立体定位手术方法用于向延髓尾部及上段颈髓进行微量注射 通过 小鼠中的大池

摘要

通过颅骨进入并利用颅骨解剖标志进行引导，是小鼠脑部定位的常用立体定位手术方法。本文概述了一种用于靶向延髓尾部及上段颈髓的替代性立体定位手术方法。 通过 依赖于脑干解剖标志直接可视化的枕大池。

摘要

通过颅骨标志引导定位小鼠脑区的立体定位手术通常以此为基础，随后进行通路建立 通过 通过颅骨钻孔。由于尾侧脑干和上段颈髓区域远离颅骨解剖标志，存在特定的解剖学挑战，使得这一标准方法在针对这些靶点时操作困难，易导致定位不精确。本文介绍一种替代性的立体定向方法。 通过 小脑延髓池已被用于靶向脑干尾部和上段颈髓中特定的目标区域。小脑延髓池位于枕骨与寰椎（即第一颈椎）之间，充满脑脊液，并被硬脑膜覆盖。该方法为进入某些难以通过常规途径到达的中枢神经系统（CNS）结构提供了可重复的操作路径。此外，该入路可直接观察靠近靶区的脑干解剖标志，从而在向脑干尾部和上段颈髓的局限区域注射微量液体时提高准确性。最后，该方法可避免损伤小脑，这对于运动功能及感觉运动相关研究尤为重要。

引言

在小鼠脑内定位靶点的标准立体定位手术¹通常需要使用一对耳杆和一个门齿杆来固定头骨。随后，根据参考图谱^2,3以及颅骨解剖标志点（即前囟点（bregma，额骨与顶骨缝合线交汇处）或后囟点（lambda，顶骨与枕骨缝合线交汇处）；图1A、B）来估算坐标。通过在预估靶点上方颅骨钻出的钻孔，可到达目标脑区，用于微量注射或植入导管、光纤等装置。由于这些缝合线的解剖结构存在个体差异，且前囟点或后囟点的定位可能存在误差^4,5，因此相对于脑组织而言，零点位置在不同动物之间存在差异。虽然此类变异导致的微小定位误差对于较大或邻近的靶区影响不大，但对于远离前后或背腹向零点的小靶区，或在因年龄、品系和/或性别而体型不同的动物中进行研究时，其影响更为显著。延髓和上段颈髓区域还存在若干特有的挑战。首先，由于小脑的位置和形态（图1Bi）^2,6,7，....

方案

作者声明该实验方案遵循贝斯以色列女执事医疗中心机构动物护理和使用委员会的指导原则。

1. 手术器械和立体定位仪的准备

注意：手术需在无菌条件下进行。使用无菌尖端技术以维持无菌状态。

1. 将装有微移液管或注射器（内含所选注射物，如腺相关病毒（AAV）或常规示踪剂）的立体定位臂安装在立体定位仪上，并准备好小鼠适配器（图2A）。
2. 准备好已灭菌的手术器械（材料表），并将其放置在无菌表面上。

2. 麻醉诱导与小鼠准备

1. 打开 O₂ 以0.5 L/min的流速设置异氟烷挥发罐为4.0，确保氧气₂ 流向感应箱。
   注意：确保异氟烷诱导箱放置在通风橱内，并将异氟烷从手术区域有效排出。
2. 将小鼠（10周龄雄性C57BL/6J）放入诱导室中。
3. 当呼吸减缓后，打开诱导室，轻轻提起小鼠。使用剪毛器去除从头部至肩部的毛发。

3. 将小鼠固定在立体定位仪框架中

....

结果

小脑延髓池入路可实现对尾侧脑干和上颈髓结构的靶向定位，而这些结构通常难以触及 通过 标准立体定位方法容易出现靶向不一致的问题。通过枕大池进行手术时，需要切开皮肤、一层较薄的斜方肌，并打开硬脑膜，但小鼠对此手术耐受良好。该方法在靶向多个（纵向分散或双侧）位点时尤其高效且创伤更小，无需像标准立体定位方法那样钻多个骨孔。在小鼠中，我们常规靶向的结构包括舌下神经核⁹腹侧呼吸群⁸，以及邻近的网状结构⁸ 通过枕大池入路在尾侧脑干中进行，我们进一步以舌下神经核和延髓腹内侧区（GiV）为例加以说明 图3例如，舌下神经核是延髓背侧一细长的运动神经元柱，其头端极可作为靶点 通过 一种标准方法。然而，由于DV坐标（约4.5 mm）主要由其上方的小脑决定，仅有1.2–1.4 mm进入脑干，因此小鼠头部位置的微小差异就可能导致注射定位偏差。由于该靶点靠近零点（obex），通过该参考点进行定位可能更为可靠 通过.......

讨论

标准立体定位手术通常依赖颅骨解剖标志来计算中枢神经系统内目标位点的坐标¹随后可进入靶位点 通过 颅骨钻孔¹该方法不适用于尾侧脑干，因为目标位点在前后方向和背腹方向上距离颅骨标志较远² 由于颅骨及其上方肌肉的解剖结构使得进入变得困难⁶ (图1Bi）。本研究描述了一种用于到达延髓尾部及上段脊髓靶点的替代性立体定位方法，称为小脑延髓池入路。该方法与标准立体定位方法的关键区别在于动物体位的设置，即通过头部前屈以充分暴露小脑延髓池，以及采用脑干背侧表面的关键解剖标志（如闩部）作为定位参考点。我们的结果表明，该方法适用于将小体积（5–50 nL）示踪剂或腺相关病毒（AAVs）精准递送至特定的脑干结构。此外，采用代表中枢神经系统解剖标志（而非骨性结构）且邻近目标区域的参考点，可提高针对微小靶区和微量注射的可重复性与准确性，这对于神经环路示踪和化学遗传学研究具有重要意义。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酒精棉片	Med-Vet International	货号：MDS090735Z	预防手术部位感染的皮肤准备
斜角镊，Dumont #5/45	FST	11251-35	仅用于抓取硬脑膜
聚维酮碘消毒垫	Med-Vet International	SKU：PVP-PAD	预防手术部位感染的皮肤准备
霍乱毒素B亚基，Alexa Fluor 488/594 标记物	赛默飞世尔科技	488：C34775，594：C22842	荧光示踪剂
剪刀	Wahl	Model MC3，28915-10	用于手术部位剃毛
带角夹的电极架	Kopf	1770	用于持握玻璃移液管
流量计	Gilmont 仪器	模型编号 65 MM	调节异氟烷和氧气的流量，以维持小鼠的手术麻醉深度
荧光微球，聚苯乙烯	赛默飞世尔科技	F13080	荧光示踪剂
加热垫	斯托尔廷	53800M	体温调节
带端口连接套件的诱导室	Midmark 公司	93805107 92800131	提供初始麻醉的麻醉室
胰岛素注射器	Exelint International	26028	给予生理盐水和镇痛药
异氟烷	Med-Vet International	货号：RXISO-250	吸入性麻醉剂
异氟烷 Matrix VIP 3000 麻醉蒸发器	Midmark 公司	91305430	吸入麻醉给药装置
椎板切除钳，Dumont #2	FST	11223-20	仅用于清洁硬脑膜
医用压缩空气	Linde	UN 1002	与刺激器联用 &以及用于提供空气以实现精确溶液注射的PicoPump
美洛昔康SR	Zoo Pharm LLC	批号 # MSR2-211201	镇痛药
微压积硼硅酸盐玻璃预校准毛细管	Globe Scientific Inc	51628	用于将物质转染至指定坐标
小鼠适配器	斯托尔廷	0051625	将大鼠立体定位仪改装用于小鼠手术
持针器，学生用哈尔斯泰德-蚊式止血钳	FST	91308-12	用于缝合
氧气调节器	生命支持产品	S/N 909328，批号 092109	调节氧气罐中的氧气水平
氧气罐，压缩的	Linde	USP UN 1072	与异氟烷麻醉一并提供
塑料卡片	不适用	不适用	任何坚固的塑料卡片，裁剪至适合立体定位仪框架（例如身份证）
气动PicoPump（或类似产品）	世界精密仪器公司（WPI）	SYS-PV820	用于精确溶液注射
生理盐水，无菌	Mountainside Medical Equipment	H04888-10	用于补充手术期间丢失的体液
手术刀柄，#3	FST	10003-12	持手术刀
剪刀，Wagner	FST	14070-12	剪断聚丙烯缝线
弹簧剪，Vannas 2.5 mm，带配套盒	FST	15002-08	仅使用剪刀打开硬脑膜，使用支架抬高身体
立体定向显微操作仪	Kopf	1760-61	连接至电极夹具，以根据坐标调整位置
立体定向“U”形框架组装与细胞内基板	科普夫	1730-B，1711	手术框架
无菌棉签	普尔itan	25-806 10WC	吸收手术区域的血液
无菌非开窗型手术巾	Henry Schein	9004686	无菌手术区域
无菌眼膏	Puralube	P1490	眼用润滑剂
刺激器 &和管路	Grass 医疗器械	S44	为精确溶液注射提供可控压力空气
手术刀片 #10	Med-Vet International	SKU: 10SS	用于皮肤切口
外科镊，超细格拉夫镊	FST	11153-10	固定皮肤
外科手套	Med-Vet 国际	MSG2280Z	用于无菌手术
手术显微镜	Leica	Model M320/F12	用于手术部位5倍至40倍的放大观察
5-0聚丙烯缝线	绿洲	MV-8661	缝合皮肤
Tegaderm	3M	3M ID 70200749250	提供无菌屏障
通用夹具和支架杆	Kopf	1725	固定于立体定位U型架和细胞内基板
伤口拉钩与哈特曼止血钳	FST	18200-09, 13003-10	分离肌肉并建立手术入路窗口