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方法文章

立体定位手术方法用于向延髓尾部及上段颈髓进行微量注射 通过 小鼠中的大池

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DOI：

10.3791/63344

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2022年1月21日

 ,  ,  , 
1Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

本文内容

摘要

通过颅骨进入并利用颅骨解剖标志进行引导，是小鼠脑部定位的常用立体定位手术方法。本文概述了一种用于靶向延髓尾部及上段颈髓的替代性立体定位手术方法。 通过 依赖于脑干解剖标志直接可视化的枕大池。

摘要

通过颅骨标志引导定位小鼠脑区的立体定位手术通常以此为基础，随后进行通路建立 通过 通过颅骨钻孔。由于尾侧脑干和上段颈髓区域远离颅骨解剖标志，存在特定的解剖学挑战，使得这一标准方法在针对这些靶点时操作困难，易导致定位不精确。本文介绍一种替代性的立体定向方法。 通过 小脑延髓池已被用于靶向脑干尾部和上段颈髓中特定的目标区域。小脑延髓池位于枕骨与寰椎（即第一颈椎）之间，充满脑脊液，并被硬脑膜覆盖。该方法为进入某些难以通过常规途径到达的中枢神经系统（CNS）结构提供了可重复的操作路径。此外，该入路可直接观察靠近靶区的脑干解剖标志，从而在向脑干尾部和上段颈髓的局限区域注射微量液体时提高准确性。最后，该方法可避免损伤小脑，这对于运动功能及感觉运动相关研究尤为重要。

引言

在小鼠脑内定位靶点的标准立体定位手术1通常需要使用一对耳杆和一个门齿杆来固定头骨。随后，根据参考图谱2,3以及颅骨解剖标志点（即前囟点（bregma，额骨与顶骨缝合线交汇处）或后囟点（lambda，顶骨与枕骨缝合线交汇处）；图1A、B）来估算坐标。通过在预估靶点上方颅骨钻出的钻孔，可到达目标脑区，用于微量注射或植入导管、光纤等装置。由于这些缝合线的解剖结构存在个体差异，且前囟点或后囟点的定位可能存在误差4,5，因此相对于脑组织而言，零点位置在不同动物之间存在差异。虽然此类变异导致的微小定位误差对于较大或邻近的靶区影响不大，但对于远离前后或背腹向零点的小靶区，或在因年龄、品系和/或性别而体型不同的动物中进行研究时，其影响更为显著。延髓和上段颈髓区域还存在若干特有的挑战。首先，由于小脑的位置和形态（图1Bi）2,6,7，前后向坐标的微小变化会引发相对于硬脑膜的背腹向坐标显著改变。其次，上段颈髓并不位于颅腔内2。第三，枕骨的倾斜位置及其覆盖的颈部肌肉层2使得标准立体定位方法在脑干与脊髓交界区域的结构操作中更加困难（图1Bi）。最后，尾侧脑干和颈髓中许多感兴趣靶区体积较小2，需要实现精确且可重复的注射8,9。

通过小脑延髓池的替代方法可避免上述问题。小脑延髓池是一个较大的腔隙，位于枕骨与寰椎之间（图1A，即第二块椎骨）10，其中充满脑脊液，并由硬脑膜覆盖10。当头部前屈时，枕骨与寰椎之间的这一间隙会打开。通过穿过覆盖其上的成对头长肌肌腹之间进入，可暴露脑干尾侧的背侧表面。若目标区域位于背侧表面附近，可依据该区域自身的解剖标志进行靶向定位；或者以第四脑室正中孔（即中央管通入第四脑室的交界点）作为坐标零点，以到达更深层的结构。该方法已在多种动物物种中成功应用，包括大鼠11、猫12、小鼠8,9以及非人灵长类动物13，用于靶向腹侧呼吸群、延髓内侧网状结构、孤束核、最后区或舌下神经核。然而，由于该方法相较于标准的立体定位方法需要更深入的解剖学知识、专用工具以及更高水平的外科操作技能，因此尚未被广泛采用。

在此，我们描述了一种逐步的手术入路，用于到达脑干和上段颈髓 通过 小脑延髓池，观察解剖标志，设定零点（图2），并估算和优化向特定脑干和脊髓感兴趣区域进行立体定位微量注射时的目标坐标（图3然后我们讨论该方法的优缺点。

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方案

作者声明该实验方案遵循贝斯以色列女执事医疗中心机构动物护理和使用委员会的指导原则。

1. 手术器械和立体定位仪的准备

注意：手术需在无菌条件下进行。使用无菌尖端技术以维持无菌状态。

  1. 将装有微移液管或注射器（内含所选注射物，如腺相关病毒（AAV）或常规示踪剂）的立体定位臂安装在立体定位仪上，并准备好小鼠适配器（图2A）。
  2. 准备好已灭菌的手术器械（材料表），并将其放置在无菌表面上。

2. 麻醉诱导与小鼠准备

  1. 打开 O2 以0.5 L/min的流速设置异氟烷挥发罐为4.0，确保氧气2 流向感应箱。
    注意：确保异氟烷诱导箱放置在通风橱内，并将异氟烷从手术区域有效排出。
  2. 将小鼠（10周龄雄性C57BL/6J）放入诱导室中。
  3. 当呼吸减缓后，打开诱导室，轻轻提起小鼠。使用剪毛器去除从头部至肩部的毛发。

3. 将小鼠固定在立体定位仪框架中

  1. 将小鼠移至立体定位仪框架中，并将其鼻子放入一个柔性的鼻罩内。此时，确保氧气（O2）气流已导向鼻罩。
  2. 仅使用耳杆将小鼠固定在立体定位仪框架中。
    注意：确保两侧耳杆位置对称，头部保持水平。
  3. 通过手动引导鼻部，将小鼠头部前屈至90°角。为固定该位置，需在小鼠适配器的耳杆支柱之间平行放置一个塑料挡板。以颅骨的平坦部分作为参考点，类似于传统立体定位手术中的平颅骨方法。
    注意：不要过度屈曲头部（即前额颅骨平面与操作台表面之间的夹角不应超过90°），否则会阻碍上呼吸道的气流。若发现气流受阻，应重新调整小鼠体位，确保躯干下方有支撑，并按照图2A,C所示，在前额颅骨平面与操作台表面之间设置一张呈90°角的塑料卡片。
  4. 将加热垫置于小鼠身体下方，然后确保颈部及身体其余部分处于同一水平位置（即与操作台大致呈180°或平行）。可使用放置弹簧剪刀的工具盒将身体抬升至该位置。
    注意：此步骤至关重要，因为脑干尾侧部分和上颈段脊髓的位置会随体位变化而移动，而中枢神经系统更靠头侧的部分则由颅骨固定不动。
  5. 按2 µL/g体重的剂量，皮下注射单次4 mg/kg的缓释型美洛昔康（Meloxicam SR），并在眼睛表面涂抹润滑剂。
  6. 首先用70%酒精消毒片清洁手术切口部位，随后使用聚维酮碘（betadine）消毒片，再用酒精消毒片重复擦拭一次，然后自然晾干。
  7. 在小鼠身体下方放置手术巾。
  8. 对手部进行消毒并戴上无菌手套。
  9. 在手术区域覆盖手术巾。

4. 暴露小脑延髓池的手术操作

  1. 通过捏脚趾或检查角膜反射，确认小鼠已充分麻醉。
  2. 将异氟烷浓度降低至维持水平（2.0）。
  3. 使用#10手术刀，从枕骨边缘向肩部方向，以一个流畅的动作做1-1.2 cm的切口。
  4. 在斜方肌的正中缝处做切口，暴露成对的头长肌。
    注意：在小鼠中，斜方肌是一层非常薄且几乎透明的肌肉。操作时应保持在正中线，避免切到下方肌肉，以免引起不必要的出血。
  5. 将两个牵开钩分别置于成对的头长肌之间，一个朝向左侧，另一个朝向右侧。止血钳的重量为牵开钩提供张力，可通过调整止血钳的位置来调节张力。
  6. 放置手术显微镜，以更清晰地观察手术区域。
  7. 使用钝头椎板切除钳，从枕骨处开始沿正中线，将成对的头长肌左右两部分分开，此处正中线清晰可见。将钝头钳沿枕骨正中线向下引导，直至到达小脑延髓池的硬脑膜，然后继续跨过硬脑膜至寰椎。
    注意：无需切断成对的头长肌，因为它们在正中线并无连接；切断会导致不必要的出血。
  8. 重新调整牵开钩位置，并通过移动止血钳调节张力，以充分暴露小脑延髓池。
  9. 使用钝头椎板切除钳进一步沿正中线分离肌肉，以获得清晰的脑干和小脑视野。
  10. 根据需要重复步骤4.7-4.9，直至硬脑膜下方的脑干和小脑清晰可见。
  11. 使用钝头椎板切除钳，从正中线向侧方移动，清除硬脑膜表面的细小结缔组织纤维，以获得清晰的脑干视野，并根据需要为靶区创造更多侧方空间。

5. 打开池膜

  1. 使用斜面 Dumont 镊子（#4/45）夹住从枕骨延伸至寰椎的硬脑膜。在靠近枕骨处夹住硬脑膜，并用弹簧剪在硬脑膜上剪开一个小口（约 0.5 至 1.5 mm）。
    注意：在此较靠前的位置，脑干与上方硬脑膜之间的间隙最宽，便于安全操作硬脑膜。
  2. 使用弹簧剪抬起硬脑膜并进一步扩大开口。开窗的大小取决于靶向区域。
    注意：进行多次纵向注射或双侧注射时需要较大的开窗；而进行单侧或中线单次注射时，较小的开窗即可满足需要。
  3. 硬脑膜打开后，用无菌棉签吸除多余的脑脊液。

6. 标志点与零点的确定

  1. 通过打开的硬脑膜观察脑干背侧表面的详细解剖标志。室管膜孔（obex）是中央管通入第四脑室的部位，作为标准的前后和内侧-外侧零点。

7. 目标坐标

注意：针对不同靶点，我们提供了一份标准坐标列表，其中前-后（AP）和内-外侧（ML）坐标均相对于颅骨前囟零点，而小脑延髓池坐标的 AP 和 ML 坐标则相对于延髓极点（obex）零点，以方便不同方法之间的转换（表1）。背-腹（DV）坐标是相对于脑或小脑表面（标准方法）或脑干表面或上颈段脊髓（小脑延髓池穿刺法）在 AP 和 ML 进入点处的表面。手术前应做好规划。

  1. 利用三组坐标确定目标位置：前后（AP）、内外（ML）和背腹（DV）。由于头部位置的影响，脑干结构的相对方位会随位置而变化。
    1. 当目标位置位于延髓闭合部尾侧距离 >0.4 mm 处时（图1B，绿色），执行以下步骤：
      1. AP：使用任何标准的立体定位参考图谱（例如 Paxinos 和 Franklin 图谱2）或在横断面上切割的组织系列，估算闭合部与目标之间的 AP 距离。
      2. ML：使用任何标准的立体定位参考图谱或在横断面上切割的组织系列，估算闭合部与目标之间的 ML 距离。
      3. DV：以目标点对应的 AP 和 ML 位置处的脑或小脑表面为参考，估算 DV 坐标。使用任何标准的立体定位参考图谱或在横断面上切割的组织系列，估算在目标 AP 和 ML 坐标处脑干表面与目标之间的距离。
    2. 当目标位置位于延髓闭合部尾侧距离 <0.4 mm 处时（图1B，橙色），执行以下步骤：
      1. AP：调整坐标以校正脑干的前屈效应。对于腹侧和头侧的目标，脑干穿刺点的 AP 位置将比标准平面上的目标 AP 坐标更偏尾侧。
      2. ML：根据标准立体定位参考图谱或在横断面上切割的组织系列确定目标坐标。坐标应相对于目标 AP 水平处所观察到的中线来确定。
      3. DV：以目标点对应的 AP 和 ML 位置处的脑干表面为参考，估算 DV 坐标。需调整 DV 坐标以校正脑干的前屈效应。对于腹侧和头侧的目标，其 DV 坐标值将大于标准平面上从脑干背侧表面测量的距离。

8. 靶点注射

  1. 使用立体定位臂将移液器或注射器降至目标位置，并按照标准立体定位方法注入溶液。注射后停留1-5分钟，以避免在使用3-50 nL体积时形成针道。然后，使用立体定位臂提起移液器或注射器。
  2. 对多个目标重复步骤8.1。

9. 手术区域的关闭

  1. 小心地从手术区域移除牵开器。成对的头长肌将自然回缩至中立位置，完全覆盖小脑延髓池。不要在中线缝合斜方肌和硬脑膜，因为它们过于脆弱，无法承受缝线的张力。
  2. 使用三根尼龙或聚丙烯缝线（5-0 或 6-0）缝合皮肤。

10. 术后护理

  1. 关闭异氟烷，将小鼠从立体定位仪中取出。将小鼠放入干净的笼子中，并置于加热垫上，观察直至其清醒并能够活动。
  2. 在术后第1至3天监测小鼠的健康状况、体重及缝线情况。若缝线尚未脱落，于第10天拆除。

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结果

小脑延髓池入路可实现对尾侧脑干和上颈髓结构的靶向定位，而这些结构通常难以触及 通过 标准立体定位方法容易出现靶向不一致的问题。通过枕大池进行手术时，需要切开皮肤、一层较薄的斜方肌，并打开硬脑膜，但小鼠对此手术耐受良好。该方法在靶向多个（纵向分散或双侧）位点时尤其高效且创伤更小，无需像标准立体定位方法那样钻多个骨孔。在小鼠中，我们常规靶向的结构包括舌下神经核9腹侧呼吸群8，以及邻近的网状结构8 通过枕大池入路在尾侧脑干中进行，我们进一步以舌下神经核和延髓腹内侧区（GiV）为例加以说明 图3例如，舌下神经核是延髓背侧一细长的运动神经元柱，其头端极可作为靶点 通过 一种标准方法。然而，由于DV坐标（约4.5 mm）主要由其上方的小脑决定，仅有1.2–1.4 mm进入脑干，因此小鼠头部位置的微小差异就可能导致注射定位偏差。由于该靶点靠近零点（obex），通过该参考点进行定位可能更为可靠 通过...

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讨论

标准立体定位手术通常依赖颅骨解剖标志来计算中枢神经系统内目标位点的坐标1随后可进入靶位点 通过 颅骨钻孔1该方法不适用于尾侧脑干，因为目标位点在前后方向和背腹方向上距离颅骨标志较远2 由于颅骨及其上方肌肉的解剖结构使得进入变得困难6 (图1Bi）。本研究描述了一种用于到达延髓尾部及上段脊髓靶点的替代性立体定位方法，称为小脑延髓池入路。该方法与标准立体定位方法的关键区别在于动物体位的设置，即通过头部前屈以充分暴露小脑延髓池，以及采用脑干背侧表面的关键解剖标志（如闩部）作为定位参考点。我们的结果表明，该方法适用于将小体积（5–50 nL）示踪剂或腺相关病毒（AAVs）精准递送至特定的脑干结构。此外，采用代表中枢神经系统解剖标志（而非骨性结构）且邻近目标区域的参考点，可提高针对微小靶区和微量注射的可重复性与准确性，这对于神经环路示踪和化学遗传学研究具有重要意义。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由 R01 NS079623、P01 HL149630 和 P01 HL095491 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酒精棉片Med-Vet International货号：MDS090735Z预防手术部位感染的皮肤准备
斜角镊，Dumont #5/45FST11251-35仅用于抓取硬脑膜
聚维酮碘消毒垫Med-Vet InternationalSKU：PVP-PAD预防手术部位感染的皮肤准备
霍乱毒素B亚基，Alexa Fluor 488/594 标记物赛默飞世尔科技488：C34775，594：C22842荧光示踪剂
剪刀WahlModel MC3，28915-10用于手术部位剃毛
带角夹的电极架Kopf1770用于持握玻璃移液管
流量计Gilmont 仪器模型编号 65 MM调节异氟烷和氧气的流量，以维持小鼠的手术麻醉深度
荧光微球，聚苯乙烯赛默飞世尔科技F13080荧光示踪剂
加热垫斯托尔廷53800M体温调节
带端口连接套件的诱导室Midmark 公司93805107 92800131提供初始麻醉的麻醉室
胰岛素注射器Exelint International26028给予生理盐水和镇痛药
异氟烷Med-Vet International货号：RXISO-250吸入性麻醉剂
异氟烷 Matrix VIP 3000 麻醉蒸发器Midmark 公司91305430吸入麻醉给药装置
椎板切除钳，Dumont #2FST11223-20仅用于清洁硬脑膜
医用压缩空气LindeUN 1002与刺激器联用 &以及用于提供空气以实现精确溶液注射的PicoPump
美洛昔康SRZoo Pharm LLC批号 # MSR2-211201镇痛药
微压积硼硅酸盐玻璃预校准毛细管Globe Scientific Inc51628用于将物质转染至指定坐标
小鼠适配器斯托尔廷0051625 将大鼠立体定位仪改装用于小鼠手术
持针器，学生用哈尔斯泰德-蚊式止血钳FST91308-12用于缝合
氧气调节器生命支持产品S/N 909328，批号 092109调节氧气罐中的氧气水平
氧气罐，压缩的LindeUSP UN 1072与异氟烷麻醉一并提供
塑料卡片不适用不适用任何坚固的塑料卡片，裁剪至适合立体定位仪框架（例如身份证）
气动PicoPump（或类似产品）世界精密仪器公司（WPI）SYS-PV820用于精确溶液注射
生理盐水，无菌Mountainside Medical EquipmentH04888-10用于补充手术期间丢失的体液
手术刀柄，#3FST10003-12持手术刀
剪刀，WagnerFST14070-12剪断聚丙烯缝线
弹簧剪，Vannas 2.5 mm，带配套盒FST15002-08仅使用剪刀打开硬脑膜，使用支架抬高身体
立体定向显微操作仪Kopf1760-61连接至电极夹具，以根据坐标调整位置
立体定向“U”形框架组装与细胞内基板科普夫1730-B，1711手术框架
无菌棉签普尔itan25-806 10WC吸收手术区域的血液
无菌非开窗型手术巾Henry Schein9004686无菌手术区域
无菌眼膏PuralubeP1490眼用润滑剂
刺激器 &和管路Grass 医疗器械S44为精确溶液注射提供可控压力空气
手术刀片 #10Med-Vet InternationalSKU: 10SS用于皮肤切口
外科镊，超细格拉夫镊FST11153-10固定皮肤
外科手套Med-Vet 国际MSG2280Z用于无菌手术
手术显微镜LeicaModel M320/F12用于手术部位5倍至40倍的放大观察
5-0聚丙烯缝线绿洲MV-8661缝合皮肤
Tegaderm3M3M ID 70200749250提供无菌屏障
通用夹具和支架杆Kopf1725固定于立体定位U型架和细胞内基板
伤口拉钩与哈特曼止血钳FST18200-09, 13003-10分离肌肉并建立手术入路窗口

参考文献

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