通过脑室内注射血红蛋白建立新生儿脑室出血模型

摘要

我们介绍了一种使用新生大鼠幼崽建立的新生儿脑室内出血模型，该模型可模拟人类中观察到的病理特征。

摘要

新生儿脑室内出血（IVH）是早产的常见后果，可导致脑损伤、出血后脑积水（PHH）以及终身性神经功能缺陷。尽管PHH可通过暂时性或永久性脑脊液（CSF）分流手术（分别为脑室储液器和脑室-腹腔分流术）进行治疗，但目前尚无药物策略可用于预防或治疗IVH引起的脑损伤和脑积水。为了更好地理解IVH的病理生理机制并测试药理学治疗方法，需要建立动物模型。尽管目前已有一些新生儿IVH模型，但那些能够稳定诱导脑积水的模型往往受限于需要大体积注射，这可能使病理过程的模拟复杂化，或导致所观察到的临床表型出现变异性。

近期的临床研究提示，血红蛋白和铁蛋白在脑室内出血（IVH）后导致脑室扩大。本文建立了一种简便的动物模型，通过向脑室内注射少量血液分解产物血红蛋白，模拟脑室内出血后脑积水（PHH）的临床表型。该模型不仅能稳定诱导脑室扩大和脑积水，还可引起脑室周围及白质区域的白质损伤、炎症反应以及免疫细胞浸润。本文详细描述了这一具有临床相关性的、利用脑室内注射在新生大鼠中建立IVH-PHH模型的简单方法，并介绍了注射后脑室大小的定量分析技术。

引言

新生儿脑室内出血（IVH）起源于生发基质，该区域是快速细胞分裂的部位，位于发育中大脑侧脑室的邻近区域。这一高度血管化的结构容易受到与早产相关的血流动力学不稳定的影响。当生发基质内脆弱的血管破裂时，血液会释放到侧脑室内，形成生发基质出血（GMH）-IVH。在IV级IVH的情况下，脑室周围出血性梗死也可能导致血液产物释放至脑组织中。¹ GMH-IVH的联合作用可能导致脑积水（PHH），尤其是在高级别出血（III级和IV级）之后。¹ 脑积水可通过植入脑室-腹腔分流管进行治疗，但分流术并不能逆转IVH可能引起的脑损伤。尽管现代新生儿重症监护已降低了IVH的发生率^2，3，但一旦IVH发生，目前尚无针对其引起的脑损伤或脑积水的特异性治疗方法。开发预防IVH所致脑损伤和PHH治疗手段的一个重要限制因素，是对IVH病理生理机制的理解尚不充分。

近期研究表明，在患有高级别脑室内出血（IVH）的新生儿中，脑脊液（CSF）中关键血液分解产物血红蛋白的早期水平与随后脑室内出血后脑积水（PHH）的发生相关⁴。此外，脑脊液中铁代谢通路相关蛋白——血红蛋白、铁蛋白和胆红素的水平，也与新生儿脑室内出血后的脑室大小相关。这一发现也在一项早产儿PHH多中心队列研究中得到证实，脑室内脑脊液中铁蛋白水平较高者，其脑室尺寸更大⁵。

在本研究中，我们建立了一种具有临床相关性的脑室内出血（IVH）所致脑损伤和脑积水模型，通过向脑室注射血红蛋白，可实现对脑损伤和继发性脑积水（PHH）的量化，并可用于测试新的治疗策略（图1）^6，7。该IVH模型采用新生大鼠，在整个操作过程中使其处于全身麻醉状态。在头皮做正中切口，利用颅骨标志点——前囟或后囟——确定坐标，以定位侧脑室进行注射。通过输注泵缓慢将血红蛋白注入脑室。该方案操作简便、适用性广，可模拟导致PHH的IVH多种病理组分。

方案

注意：所有动物实验方案均经各机构动物护理与使用委员会批准。有关本实验方案中使用的所有材料、试剂、设备和软件的详细信息，请参见材料表。

1. 血红蛋白和脑脊液溶液的制备

1. 通过将500 µL aCSF溶液加入1.5 mL微量离心管中，配制无菌 人工脑脊液（aCSF）溶液，并置于冰上保存。
2. 在1.5 mL微量离心管中，将75 mg血红蛋白加入500 µL aCSF中，配制无菌的150 mg/mL血红蛋白溶液，并置于冰上保存。

2. 注射前动物的准备

1. 将加热垫调至中等温度，以维持大鼠的体温。
2. 将出生后第4天（P4）的大鼠置于充满3%异氟烷的诱导室中进行麻醉。
   注意：每15分钟通过脚趾/尾巴夹捏反应确认麻醉深度。通过观察组织颜色、体温和呼吸频率进行麻醉监测。
3. 对已麻醉的大鼠皮下注射5 mg/kg的卡洛芬，以提供镇痛。
4. 将麻醉后的大鼠俯卧位固定于立体定位仪中，鼻部置于麻醉接头内，并持续通入1.5%异氟烷。
5. 使用无损伤耳杆夹紧外耳道，以固定头部。
   注意：若注射时大鼠眼睛张开，应涂抹兽用眼膏以保持眼睛湿润。
6. 使用浸有聚维酮碘和70%乙醇的无菌棉签交替清洁头部。
   1. 将浸有聚维酮碘的棉签接触头皮中央，并以同心圆方式向外擦拭。
   2. 使用浸有乙醇的棉签重复步骤2.6.1.1。
   3. 重复步骤2.6.1.1和步骤2.6.1.2共3次。
7. 覆盖无菌手术巾以保护手术区域。 
8. 使用无菌手术刀在头部正中垂直做0.3 cm切口，暴露颅骨的前囟。
   注意：若从后囟进针，则应暴露颅骨的后囟而非前囟。
9. 使用无菌棉签擦干手术区域。

3. 设置立体定位注射仪

1. 用30G针头将步骤1.2中配制的血红蛋白溶液吸入一支0.3 mL无菌注射器中，并将注射器放入立体定位注射系统。
   ​注意：若需建立对照条件，请将步骤1.1中配制的aCSF溶液吸入0.3 mL无菌注射器，并按本方案继续操作。
2. 打开立体定位注射仪界面，点击配置按钮，输入注射体积和流速参数。
   1. 点击体积，将体积设置为20,000 nL（20 µL）。
   2. 点击输注速率，将速率设置为8,000 nL/min（8 µL/min）。
3. 点击重置位置 按钮，退出配置界面。
4. 点击输注按钮，冲洗针尖，直至针尖处出现一小滴血红蛋白溶液。
5. 用无菌棉签轻轻吸去针尖处的血红蛋白溶液。

4. 动物注射

1. 设置 前囟 作为 零 通过调整注射器的内外侧和前后位置，使排空的注射器针头尖端轻轻接触前囟点处的颅骨，从而校准立体定位注射系统。
   注意：若从λ位点进行注射，需设置 λ 作为 零.
2. 确定所选坐标。
   1. 若从前囟开始注射，在 P4 大鼠 此处描述的方法，使用 1.5 mm 侧向，0.4 mm 前向，2.0 mm 深度，相对于前囟。
   2. 若从人字缝进行注射，请使用以下坐标参数 P4期大鼠：从人字缝前4.6 mm、外侧1.1 mm、深度3.3 mm处进针。
3. 将注射器针头抬高至颅骨上方1 cm处，以避开头皮。抬高注射器后，继续设定正中-外侧和前-后方向的坐标。
4. 将注射器针头降低至轻轻接触颅骨。检查针头是否已接触颅骨。
5. 在30秒的时间段内设定背腹向坐标。
   注意：在设定背腹向坐标时，针头将穿刺颅骨。必须小心操作，确保注射器穿过颅骨时不会导致颅骨变形。若发生颅骨变形，应沿背腹向坐标缓慢回撤针头，随后沿相同轨迹重新置入针头。此操作可使针头以较小的力度穿过颅骨上的孔洞，避免产生变形。
6. 在立体定位注射器界面上，点击 运行 开始注射按钮。
7. 注射完成后，将注射器针头留置原位2分钟，以尽量减少溶液回流。
8. 沿背腹轴坐标缓慢撤出注射器，持续2分钟 分钟，直至针尖位于头皮上方2 cm处。
9. 将立体定位注射臂旋转至远离手术区域的位置。

5. 术后护理

1. 使用6-0单股缝合线缝合头皮。在0.3 cm切口的中心处做一个简单的间断缝合。
2. 将幼鼠从麻醉状态中移出，并放置在加热垫上安全的位置。
3. 将啮齿动物放回笼中，在母鼠的照料下恢复麻醉。
   注意：及时返回母鼠照料可降低术后早期死亡率。
4. 术后每小时监测一次动物的麻醉状态，持续3小时，以观察翻正反射是否消失。
5. 术后每日监测动物7天，观察其正常活动、摄食情况及体重增长。同时观察手术部位切口的愈合、闭合情况以及毛发的重新生长。
   注意：在极少数情况下，若监测期间观察到癫痫发作、中枢抑制或食欲减退等神经学变化，应在麻醉下通过血管灌注或颈椎脱臼实施安乐死。
6. 为预防缝合关闭后伤口愈合期间发生感染，应在切口部位局部涂抹三重抗生素药膏。

6. MRI 采集与定量分析

1. 在4.7T或9.4T小动物扫描仪上进行MRI扫描。
2. 将加热垫调至中等档位，以维持大鼠的体温。
3. 在麻醉舱内使用3%异氟烷诱导麻醉。
   注意：每15分钟通过脚趾/尾巴夹捏反应确认麻醉深度。通过肉眼观察组织颜色、体温和呼吸频率来监测麻醉状态。
4. 将麻醉后的大鼠俯卧位置于MRI设备中，鼻部插入麻醉适配器，并持续通入1.5%异氟烷。
5. 选择T2加权快速自旋回波序列，进行T2加权成像。
   1. 若使用4.7T MRI扫描仪，在MRI软件中输入以下参数：重复 时间 = 3,000 ms，回波时间 = 27.50 ms，平均次数 = 3，视野 = 18.0 mm × 18.0 mm，矩阵 = 128 × 128，轴向切片数 = 24，层厚 = 0.50 mm。
   2. 若使用9.4T MRI扫描仪，在MRI软件中输入以下参数：重复时间 = 5,000 ms，回波时间 = 66.00 ms，回波间隔 = 16.50 ms，平均次数 = 2，重复次数 = 1，RARE因子 = 8，视野 = 16.0 mm × 16.0 mm，矩阵 = 256 × 256，轴向切片数 = 32，层厚 = 0.50 mm。
6. 点击继续按钮以启动序列。

7. 图像处理与分析

1. 使用原始的T2加权数据来分析脑体积。使用分割软件手动勾画侧脑室⁶。点击画笔模式，并选择方形画笔样式。将画笔大小调整为1。点击布局检查器，并选择轴向视图。点击缩放以适应。将光标置于图像上，描画并填充侧脑室区域。
2. 在工具栏中点击分割 | 体积与统计，以查看分割后的体积。

结果

通过影像学和免疫组织化学方法确认了注射成功。接受血红蛋白注射的动物在注射后24小时和72小时的MRI评估中表现出中度急性脑室扩大（图2A），其侧脑室体积显著大于人工脑脊液（aCSF）注射组动物（图2B、C）。尽管在注射后38天时，血红蛋白注射组与aCSF注射组动物的侧脑室体积无显著差异（图2D），但值得注意的是，在随访至注射后38天的血红蛋白注射组动物中，有44%（4/9）在此时间点仍表现出未缓解的脑室扩大（图2D）。这种脑室大小的广泛分布模式与脑室内出血后梗阻性脑积水（IVH-PHH）的临床病程一致。此外，在注射后38天时对白质体积进行了量化分析（图3），结果显示血红蛋白注射组的白质体积显著低于aCSF注射组（图3B）。

讨论

该利用血红蛋白注射构建的脑室内出血（IVH）模型可用于专门研究由血红蛋白介导的IVH病理机制。为开展互补性研究，血红蛋白也可通过简便方式递送 体外 且不会干扰对全血中存在的小胶质细胞/巨噬细胞所产生蛋白质的生化检测。

IVH-PHH 的主要理论包括脑脊液循环的机械性阻塞、室管膜壁上纤毛结构的破坏、炎症、纤维化以及铁毒性¹⁰现有的脑室内出血（IVH）动物模型，例如胶原酶诱导的新生大鼠模型，通过直接损伤和破坏细胞外基质来诱导IVH¹¹，而其他模型如甘油诱导的兔仔模型则是通过颅内低血压引发脑室内出血¹². 其他模型采用自体或供体大鼠血液注射至侧脑室^{13, 14}尽管这些及其他现有模型为研究脑室内出血后脑积水（IVH-PHH）提供了重要的特征，但它们主要关注血液在脑室内的影响，而未考虑出血过程中释放的血液特定组分所起...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.3 mL 胰岛素注射器	BD Microfine + Insulin Syringe	230-4533	0.3–0.5 mL 注射器可用
1.5 mL 微量离心管	USA Scientific	1615-5500	批号 K194642H -3 511
4.7T 磁共振成像仪	Agilent/Varian	4.7T/33 cm	Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI 系统
6-0 单丝缝合线	ETHICON	667G
9.4T 磁共振成像仪	Bruker	BioSpec 94/20	本方案中使用时不带低温探头
分析天平	CCURIS Instruments	W3200-320
人工脑脊液 (aCSF)	Tocris Bioscience	3525	批次号：72A
聚维酮碘	Purdue Products L.P.	301005-00	NDC 67618-150-09
卡洛芬（注射用）	Zoetis Inc.	PI 4019448	Rimadyl
乙醇	Decon Laboratories	2701
加热垫	Sunbeam	E12107-819	UL 612A, Z-1228-001
血红蛋白	MP Biomedicals	100714	批号 SR02321
异氟烷	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
异氟烷蒸发器	VETEQUIP	911103
立体定位仪照明灯	Dolan-Jenner industries	Fiber-Lite MI-150
微量注射泵	World Precision Instruments	MICRO21	序列号 184034 T08K
MRI 软件	Bruker BioSpin	Paravision 360 3.2
氧气	Airgas Healthcare	UN1072	批号 S1432080XA02
Sprague Dawley 大鼠	Charles River Laboratories	品系编号：001
立体定位仪	KOPF Instruments	型号 900LS Lazy Susan
无菌棉签	Fischerbrand	23-400-118
手术刀片	covetrus	#10
外用三联抗生素软膏	Triple Antibiotic Ointment	NDC 51672-2120-1
脑室容积定量分析软件	ITK-SNAP	ITK-SNAP 4.0.0 beta