通过脑室内注射血红蛋白建立新生儿脑室出血模型

摘要

我们介绍了一种使用新生大鼠幼崽建立的新生儿脑室内出血模型，该模型可模拟人类中观察到的病理特征。

摘要

新生儿脑室内出血（IVH）是早产的常见后果，可导致脑损伤、出血后脑积水（PHH）以及终身性神经功能缺陷。尽管PHH可通过暂时性或永久性脑脊液（CSF）分流手术（分别为脑室储液器和脑室-腹腔分流术）进行治疗，但目前尚无药物策略可用于预防或治疗IVH引起的脑损伤和脑积水。为了更好地理解IVH的病理生理机制并测试药理学治疗方法，需要建立动物模型。尽管目前已有一些新生儿IVH模型，但那些能够稳定诱导脑积水的模型往往受限于需要大体积注射，这可能使病理过程的模拟复杂化，或导致所观察到的临床表型出现变异性。

近期的临床研究提示，血红蛋白和铁蛋白在脑室内出血（IVH）后导致脑室扩大。本文建立了一种简便的动物模型，通过向脑室内注射少量血液分解产物血红蛋白，模拟脑室内出血后脑积水（PHH）的临床表型。该模型不仅能稳定诱导脑室扩大和脑积水，还可引起脑室周围及白质区域的白质损伤、炎症反应以及免疫细胞浸润。本文详细描述了这一具有临床相关性的、利用脑室内注射在新生大鼠中建立IVH-PHH模型的简单方法，并介绍了注射后脑室大小的定量分析技术。

引言

新生儿脑室内出血（IVH）起源于生发基质，该区域是快速细胞分裂的部位，位于发育中大脑侧脑室的邻近区域。这一高度血管化的结构容易受到与早产相关的血流动力学不稳定的影响。当生发基质内脆弱的血管破裂时，血液会释放到侧脑室内，形成生发基质出血（GMH）-IVH。在IV级IVH的情况下，脑室周围出血性梗死也可能导致血液产物释放至脑组织中。¹ GMH-IVH的联合作用可能导致脑积水（PHH），尤其是在高级别出血（III级和IV级）之后。¹ 脑积水可通过植入脑室-腹腔分流管进行治疗，但分流术并不能逆转IVH可能引起的脑损伤。尽管现代新生儿重症监护已降低了IVH的发生率^2，3，但一旦IVH发生，目前尚无针对其引起的脑损伤或脑积水的特异性治疗方法。开发预防IVH所致脑损伤和PHH治疗手段的一个重要限制因素，是对IVH病理生理机制的理解尚不充分。

近期研究表明，在患有高级别脑室内出血（IVH）的新生儿中，脑脊液（CSF）中关键血液分解产物血红蛋白的早期水平与随后脑室内出血后脑积水（PHH）的发生相关⁴。此外，脑脊液中铁代谢通路相关蛋白——血红蛋白、铁蛋白和胆红素的水平，也与新生儿脑室内出血后的脑室大小相关。这一发现也在一项早产儿PHH多中....

方案

注意：所有动物实验方案均经各机构动物护理与使用委员会批准。有关本实验方案中使用的所有材料、试剂、设备和软件的详细信息，请参见材料表。

1. 血红蛋白和脑脊液溶液的制备

1. 通过将500 µL aCSF溶液加入1.5 mL微量离心管中，配制无菌 人工脑脊液（aCSF）溶液，并置于冰上保存。
2. 在1.5 mL微量离心管中，将75 mg血红蛋白加入500 µL aCSF中，配制无菌的150 mg/mL血红蛋白溶液，并置于冰上保存。

2. 注射前动物的准备

1. 将加热垫调至中等温度，以维持大鼠的体温。
2. 将出生后第4天（P4）的大鼠置于充满3%异氟烷的诱导室中进行麻醉。
   注意：每15分钟通过脚趾/尾巴夹捏反应确认麻醉深度。通过观察组织颜色、体温和呼吸频率进行麻醉监测。
3. 对已麻醉的大鼠皮下注射5 mg/kg的卡洛芬，以提供镇痛。
4. 将麻醉后的大鼠俯卧位固定于立体定位仪中，鼻部置于麻醉接头内，并持续通入1.5%异氟烷。
5. 使用无损伤耳杆夹紧外耳道，以固定头部。
   注意：若注射时大鼠眼睛张开，应涂抹兽用眼膏以保持眼睛湿润。
6. 使用浸有聚维....

结果

通过影像学和免疫组织化学方法确认注射成功。接受血红蛋白注射的动物在通过 MRI 评估时出现中度急性脑室扩大。图 2A)，与注射 aCSF 的动物相比，血红蛋白注射后 24 小时和 72 小时的侧脑室显著增大（图2B，C）。在注射后第38天，血红蛋白注射组与aCSF注射组动物的侧脑室体积之间无显著差异（图 2D需要指出的是，在注射血红蛋白组中，有44%（9只中的4只）动物在注射后38天时仍表现出未缓解的脑室扩大。图 2D）。脑室大小的这种广泛分布模式与IVH-PHH的临床病程一致。此外，在注射后38天量化了白质体积图3) 与 aCSF 注射组相比，血红蛋白注射组显著降低图3B).

我们此前发表了一.......

讨论

该利用血红蛋白注射构建的脑室内出血（IVH）模型可用于专门研究由血红蛋白介导的IVH病理机制。为开展互补性研究，血红蛋白也可通过简便方式递送 体外 且不会干扰对全血中存在的小胶质细胞/巨噬细胞所产生蛋白质的生化检测。

IVH-PHH 的主要理论包括脑脊液循环的机械性阻塞、室管膜壁上纤毛结构的破坏、炎症、纤维化以及铁毒性¹⁰现有的脑室内出血（IVH）动物模型，例如胶原酶诱导的新生大鼠模型，通过直接损伤和破坏细胞外基质来诱导IVH¹¹，而其他模型如甘油诱导的兔仔模型则是通过颅内低血压引发脑室内出血¹². 其他模型采用自体或供体大鼠血液注射至侧脑室^{13, 14}尽管这些及其他现有模型为研究脑室内出血后脑积水（IVH-PHH）提供了重要的特征，但它们主要关注血液在脑室内的影响，而未考虑出血过程中释放的血液特定组分所起.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.3 mL 胰岛素注射器	BD Microfine + Insulin Syringe	230-4533	0.3–0.5 mL 注射器可用
1.5 mL 微量离心管	USA Scientific	1615-5500	批号 K194642H -3 511
4.7T 磁共振成像仪	Agilent/Varian	4.7T/33 cm	Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI 系统
6-0 单丝缝合线	ETHICON	667G
9.4T 磁共振成像仪	Bruker	BioSpec 94/20	本方案中使用时不带低温探头
分析天平	CCURIS Instruments	W3200-320
人工脑脊液 (aCSF)	Tocris Bioscience	3525	批次号：72A
聚维酮碘	Purdue Products L.P.	301005-00	NDC 67618-150-09
卡洛芬（注射用）	Zoetis Inc.	PI 4019448	Rimadyl
乙醇	Decon Laboratories	2701
加热垫	Sunbeam	E12107-819	UL 612A, Z-1228-001
血红蛋白	MP Biomedicals	100714	批号 SR02321
异氟烷	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
异氟烷蒸发器	VETEQUIP	911103
立体定位仪照明灯	Dolan-Jenner industries	Fiber-Lite MI-150
微量注射泵	World Precision Instruments	MICRO21	序列号 184034 T08K
MRI 软件	Bruker BioSpin	Paravision 360 3.2
氧气	Airgas Healthcare	UN1072	批号 S1432080XA02
Sprague Dawley 大鼠	Charles River Laboratories	品系编号：001
立体定位仪	KOPF Instruments	型号 900LS Lazy Susan
无菌棉签	Fischerbrand	23-400-118
手术刀片	covetrus	#10
外用三联抗生素软膏	Triple Antibiotic Ointment	NDC 51672-2120-1
脑室容积定量分析软件	ITK-SNAP	ITK-SNAP 4.0.0 beta