利用细胞外通量分析探索单个三维微组织球体的线粒体能量代谢

摘要

这些实验方案将帮助研究人员利用Seahorse细胞外通量分析技术，探究三维培养的癌细胞系来源类球体中的线粒体能量代谢。

摘要

三维（3D）细胞聚集体，称为球状体，已成为 体外 近年来，细胞培养技术不断发展。与将细胞培养为二维单层细胞（2D培养）不同，球形细胞培养能够促进、调控并支持细胞生理结构和特性的形成 体内包括细胞外基质蛋白的表达、细胞信号传导、基因表达、蛋白质合成、分化和增殖。三维培养的重要性已在多个研究领域得到认可，包括肿瘤学、糖尿病、干细胞生物学和组织工程。在过去十年中，已开发出改进的方法用于生成类球体并评估其代谢功能和命运。

已使用XF24胰岛捕获板或XFe96类球体微孔板，通过细胞外通量（XF）分析仪研究三维微组织（如类球体）中的线粒体功能。然而，利用XF技术探测类球体中线粒体能量代谢的具体实验方案及优化方法尚未被详细描述。本文提供了使用XFe96 XF分析仪和类球体微孔板对单个三维类球体进行线粒体能量代谢检测的详细实验方案。通过使用不同癌细胞系，证明了XF技术能够区分不同大小、体积、细胞数量、 DNA含量和类型的三维类球体中的细胞呼吸。

使用寡霉素、BAM15、鱼藤酮和抗霉素A等线粒体效应化合物的最佳浓度，检测三维球状体中线粒体能量代谢的特定参数。本文还讨论了对球状体获得数据进行归一化处理的方法，并阐述了利用XF技术研究球状体代谢时需考虑的诸多因素。本方案将有助于推动先进模型中的相关研究 体外 球状体模型

引言

过去20年中，生物研究领域的体外（in vitro）模型技术迅速发展。如今，这类模型包括器官芯片、类器官以及三维微组织球体，这些已成为提升体外（in vitro）与体内（in vivo）研究之间转化效率的共同研究重点。先进体外（in vitro）模型的应用，特别是球体模型，已广泛覆盖多个研究领域，包括组织工程、干细胞研究、癌症与疾病生物学^{1,2,3,4,5,6,7}，以及安全性测试，如遗传毒理学^8,9,10、纳米材料毒理学^11,12,13,14，以及药物安全性和有效性测试^{8,15,16,17,18,19}。

正常的细胞形态对于生物学表型和功能至关重要。将细胞培养成三维微组织球体可使细胞获得更接近体内实际观察到的形态、表型功能和组织结构 体内 但难以通过传统的单层细胞培养技术捕获。两者 体内 和 体外 细胞功能直接受到细胞微环境的影响，这种影响不仅限于细胞间的通讯与程序化过程（如细胞间连接的形成、细胞生态位构建的机会）；还包括细胞对局部环境中激素和生长因子的暴露（如作为炎症反应一部分的细胞因子暴露）；物理与化学基质的组成（如细胞是生长在刚性组织培养塑料上还是弹性组织环境中）；以及最重要的是，细胞代谢如何受到营养物质、氧气供应以及乳酸等代谢废物处理过程的影响。

代谢通量分析是一种强大的方法，可用于在限定条件下研究细胞代谢 体外 系统。具体而言，XF 技术能够分析完整细胞和组织中细胞生物能量学的实时、活体动态变化。鉴于许多细胞内代谢事件发生在数秒至数分钟的时间尺度内，实时功能分析方法对于理解完整细胞和组织中细胞代谢通量的实时变化至关重要。 体外.

本文提供了培养源自癌症的细胞系 A549（肺腺癌）、HepG2/C3A（肝细胞癌）、MCF-7（乳腺腺癌）和 SK-OV-3（卵巢腺癌）的实验方案 体外 3D 采用强制聚集方法的球状体模型（图1）。本文还（i）详细描述了如何使用安捷伦 XFe96 XF 分析仪检测单个三维球状体的线粒体能量代谢；（ii）强调了利用单个三维球状体优化 XF 检测的方法；（iii）讨论了采用该方法检测三维球状体代谢时的重要注意事项与局限性。尤为重要的是，本文阐述了数据的采集方法，这些数据可用于计算氧消耗率（OCR），从而确定细胞球状体中的氧化磷酸化水平及线粒体功能。尽管本方案未对细胞外酸化率（ECAR）进行分析，但 ECAR 是 XF 实验中与 OCR 同时测量的另一项参数。然而，ECAR 数据常因采用仪器制造商提供的基础分析方法而被解读不当或不准确。本文对基于该技术厂商基本方法计算 ECAR 所存在的局限性进行了评述。

方案

图1：细胞类球体生成、细胞外通量分析及下游检测的图解工作流程。 四种癌细胞系被选择性地以单层形式培养（A），从组织培养瓶中解离后，接种至超低吸附96孔微孔板中以形成类球体（B）。人肺癌腺癌A549细胞、人肝癌HepG2/C3A细胞、人卵巢腺癌SK-OV-3细胞以及人乳腺癌MCF-7细胞以每孔1 × 10³–8 × 10³个细胞的密度接种，并培养至多7天，以形成单个类球体，并通过连续观察和平面测量优化类球体接种密度和培养时间。类球体形成后，用无血清XF培养基洗涤，并小心接种至预先包被多聚-D-赖氨酸的类球体检测用微孔板中（C）。随后使用XFe96分析仪，通过多种实验方案对类球体进行细胞外通量分析，旨在解决以下问题：（1）基础线粒体呼吸反应的最佳类球体尺寸；（2）线粒体呼吸抑制剂的优化滴定；（3）类球体在微孔板孔内位置的优化（D）。细胞外通量分析完成后，采用相差显微镜观察及类球体DNA定量，用于数据归一化及其他下游体外in vitro检测。 请点击此处查看该图的放大版本。

1. 癌细胞系三维培养 体外 球状体

细胞系	描述	培养基	来源
A549	肺癌细胞系	RPMI 1640	欧洲认证细胞库（European Collection of Authenticated Cell Cultures, ECACC）
		丙酮酸钠（1 mM）
		青霉素-链霉素（100 U/mL – 100 mg/mL）
		10 % (v/v) FBS
HepG2/C3A	肝癌细胞系，为亲代HepG2细胞系的克隆衍生物	DMEM	美国模式培养物集存库（American Tissue Culture Collection, ATCC）
		青霉素-链霉素（100 U/mL – 100 mg/mL）
		10 % (v/v) FBS
MCF7	乳腺腺癌细胞系	RPMI 1640	欧洲认证细胞库（European Collection of Authenticated Cell Cultures, ECACC）
		丙酮酸钠（1 mM）
		青霉素-链霉素（100 U/mL – 100 mg/mL）
		10 % (v/v) FBS
SK-OV-3	卵巢腺癌细胞系	RPMI 1640	欧洲认证细胞库（European Collection of Authenticated Cell Cultures, ECACC）
		丙酮酸钠（1 mM）
		青霉素-链霉素（100 U/mL – 100 mg/mL）
		10 % (v/v) FBS
组分	RPMI 检测培养基（终体积 50 mL）
基础培养基	Agilent Seahorse XF RPMI，pH 7.4
葡萄糖（1 M 无菌储备液）	11 mM（0.55 mL 储备液）
L-谷氨酰胺（200 mM 无菌储备液）	2 mM（0.5 mL 储备液）
丙酮酸钠（100 mM 无菌储备液）	1 mM（0.5 mL 储备液）

表1：癌细胞系培养基与XF培养基的成分。

1. 采用标准的无菌组织培养技术培养所有细胞系，并使用合适的支原体检测试剂盒确认其无支原体污染。
2. 使用推荐的培养基（见表1），在T75组织培养瓶或等效容器中培养细胞系。将细胞培养至65–80%融合度，并定期传代，最多不超过25代。
3. 用Dulbecco改良的磷酸盐缓冲液（DBPS）冲洗细胞培养瓶两次。
4. 加入3 mL细胞解离试剂（见材料表），在37 °C作用5分钟，使细胞从培养瓶表面脱离，并通过显微镜确认细胞是否已脱离。
5. 轻柔吹打悬浮的细胞，确保形成单细胞悬液，然后加入7 mL完全组织培养基以中和细胞解离试剂的活性。
6. 在300 × g条件下离心5分钟收集细胞，弃去上清液，将细胞重悬于完全培养基中。
7. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并调整至接种所需的细胞密度。
   注：若需在96孔板中以每孔100 µL、每孔4 × 10³个细胞的密度接种整块板，应将细胞浓度调整为4 × 10⁴个细胞/mL，推荐总体积为12 mL。
8. 将细胞悬液倒入无菌储液槽中，使用多通道移液器向防细胞黏附微孔板的每个孔中加入100 µL细胞悬液。
   注：仅接种微孔板内侧的60个孔，其余孔中加入DPBS。此举可形成蒸发屏障，确保板内类球体生长的一致性，并最小化边缘效应。
9. 将类球体微孔板在300 × g条件下离心15分钟，促使细胞形成松散的聚集体。
10. 将微孔板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育至少3天，以确保类球体的形成。
11. 采用标准化的实验室操作进行相差显微镜观察，监测类球体的生长情况。每3天或每周两次通过半量换液的方式补充细胞培养基。

2. 利用细胞外通量（XF）技术检测单个球状体的线粒体能量代谢

1. 检测准备（提前一天）
   1. 使用倒置相差显微镜在4倍放大倍数下检查类球体的活性，以确保类球体结构完整，形态正常，并保证样品间整体均匀性。
   2. 水化传感器盒。
      1. 将约 20 mL 校准液分装至锥形管中。
      2. 将含有校准物的锥形管置于非 CO₂₂ 37 °C 培养箱中过夜培养。
      3. 从检测试剂盒中取出内容物。
      4. 将传感器 cartridge 从工具板上取下，并倒置放在工具板旁的工作台上。
      5. 用移液器吸取 200 µL 无菌 ddH₂O₂使用多通道P300移液器，将O加入传感器 cartridge 辅助板的每个孔中。
      6. 将传感器 cartridge 置于工具板上方。
      7. 检查每个孔中的水位是否足够高，以浸没传感器探头。
      8. 将组装好的传感器盒转移至不含CO2的37 °C培养箱中，过夜孵育。
         注意：此步骤可在检测开始前12至72小时进行。
2. 包被球状体检测微孔板
   1. 采用无菌技术，向球形微孔板每孔加入 30 µL 无菌聚-D-赖氨酸（0.1 mg/mL）溶液，室温孵育 30 分钟。
   2. 吸出球状体微孔板各孔中的溶液，将微孔板倒置，并用力轻敲滤纸以去除残留液体。
   3. 用 200 µL/孔的无菌 ddH₂O 洗涤平板两次₂O.
   4. 最后一次洗涤后，将微孔板倒置并用力轻敲滤纸，以去除残留的水分。
   5. 将培养板在室温下晾干30分钟，然后用于实验或于4 °C保存以备后续使用。
      注意：类球体检测微孔板应包被分子粘附剂，以确保类球体固定在微孔板底部。若未使用分子粘附剂，类球体可能脱落，从而干扰检测结果。除聚-D-赖氨酸外，也可选用其他分子粘附剂对微孔板进行预包被。预包被的微孔板可储存于 4 °C，但在开始检测前应使其平衡至室温。
3. 配制 XF 检测培养基
   1. 按照所述方法制备XF RPMI培养基， 表1，使用0.22 μm针头滤器进行无菌过滤
4. 检测准备（检测前1小时）
   1. 将添加了补充物的XF RPMI检测培养基预热至37 °C。
   2. 预热包被好的球状体检测微孔板至非CO₂培养箱中₂ 37 °C 培养箱或干式恒温器。
   3. 准备传感器 cartridge。
      1. 从空气培养箱中取出含有校准液和传感器 cartridge 的锥形管。
      2. 将传感器 cartridge 从工具板上取下，并倒置放在工作台面上。
      3. 使用P300多通道移液器吸取工具板中的水并弃去。
      4. 将校准液倒入无菌试剂槽中，使用P300多通道移液器向功能板每孔加入200 µL预热的校准液。
      5. 拿起传感器盒，将其重新放回多功能板上方，确保传感器充分浸入校准液中。
      6. 将组装好的传感器盒重新放回非CO₂培养箱中₂ 37 °C 培养箱中孵育，直至准备加载端口注射溶液。
5. 用检测培养基洗涤类球体。
   1. 从37 °C、5% CO₂培养箱中取出球状体培养板₂ 将培养物置于培养箱中，并在显微镜下观察类球体，以确保其完整性，然后再进行类球体转移操作。
   2. 向球形体培养板的所有孔中加入预热的检测培养基，每孔180 µL，包括用于背景校正的孔。
   3. 用3 mL的检测培养基部分填满一个7 cm的培养皿。
   4. 使用多通道移液器并搭配宽口移液器吸头，将移液器的吸液体积设置为10–50 µL，从96孔培养板中转移类球体至7 cm培养皿中。
6. 将种子球体接种至预先包被的球体检测微孔板中。
   1. 使用解剖显微镜和光源箱装置，按照下述步骤将类球体从培养皿转移至类球体检测微孔板中。
      1. 将单通道移液器的体积设置为 20 µL，并装配宽口移液器吸头，小心吸取单个类球体。将吸头直接置于类球体检测微孔板各孔的中心位置，依靠重力使单个类球体自然沉降至各孔中央，即不要从移液器吸头中推出任何液体，而是利用毛细作用使类球体从吸头中释放。为确认类球体已完全释放，可在显微镜下将移液器中的内容物重新排回 7 cm 培养皿中进行观察。
         注意：单个球状体的重力洗脱通常需要15–30秒，具体时间取决于球状体的大小和密度。在此期间，不得移除移液器。任何用于背景校正的孔应不含球状体，仅含有检测培养基。在显微镜下确认每个球状体的位置，理想情况下，每个球状体应位于各孔的中央。
      2. 将所有类球体转移至类球体检测微孔板后，将该微孔板转移至非CO₂培养环境₂ 在检测前，将样品于37 °C培养箱中孵育至少1小时。

3. XF 检测中传感器微孔板的化合物制备与加样

注射策略	化合物（进样口）	XFe96 微孔起始体积（µL）	目标终孔浓度	进样口体积（µL）	注射后 XFe96 微孔最终体积（µL）	工作储备液浓度
1	Oligomycin (A)	180	3 µg/mL	20	200	30 µg/mL
	Rotenone (B)	200	2 µM	20	220	22 µM
	Antimycin A (B)	200	2 µM	20	220	22 µM
2	BAM15 (A)	180	5 µM	20	200	50 µM
	Rotenone (B)	200	2 µM	20	220	22 µM
	Antimycin A (B)	200	2 µM	20	220	22 µM

表2：使用XFe96分析仪检测单个三维球状体线粒体能量代谢时所用线粒体相关化合物的浓度。

1. 使用完全补充的预热 XF RPMI 检测培养基，配制每种化合物的工作储备液，浓度参见表 2。
2. 将 cartridge 板（与辅助板耦合）按列方向放置，从左至右编号为 1–12。
3. 若使用加样导板，请根据加样流程将其放置在 cartridge 板上方；例如，若需先向 A 孔加样，则确保导板左上角可见A标记。
4. 将每种化合物的工作液转移至合适的储液槽中，使用校准的 P100 多通道移液器，向所有对应加样孔中各加入 20 µL。对剩余加样孔中的每种化合物重复此步骤。
   注意：若传感器 cartridge 板上的某些加样孔未使用，可保持空置或填充检测培养基。若仅使用特定字母编号的部分加样孔，请确保该字母对应的其他加样孔均填充检测培养基；否则，空气将被注入微孔中，影响这些微孔的检测结果。
5. 完成加样后，取下加样导板（如已使用），并准备分析仪以加载传感器 cartridge。
   注意：若加样完成后未立即运行检测，请将盖子重新盖回传感器 cartridge 上，并将板放回 37 °C 培养箱中，待准备上机时再取出。

4. 实验设计、注射策略与数据采集

1. 运行检测
   1. 打开分析仪电源并连接至控制器（计算机）。
      注：可通过 Wave Controller 软件小部件面板中的仪器连接状态进行确认。
   2. 在 WAVE 软件中进入 模板 页面，找到该实验的检测模板文件，双击打开。
      注：如果在 模板 界面中未显示该检测模板，需从共享网络驱动器或 U 盘将模板文件导入模板文件夹。
   3. 要开始检测，请点击 运行检测 选项卡。
      注：若已在孔板图中正确分配组别定义，则检测已准备就绪，页面右侧将显示绿色勾选标记。此时可在检测摘要页面输入任何附加信息，也可保持空白；然后进入下一步。由于线粒体调节剂在 3D 微组织球体中的渗透存在延迟（图 2），请使用 表 3 中所述的测量方案信息。

测量阶段	注射次数及端口	测量详情	阶段持续时间 (h:min:s)
校准	不适用	XF 分析仪始终执行此校准，以确保测量结果准确	00:20:00（此为平均值，不同仪器间可能存在差异）
平衡	不适用	平衡发生在校准之后，建议执行此步骤	00:10:00
基础状态	不适用	循环次数 = 5	00:30:00
		混匀时间 = 3:00
		等待时间 = 0:00
		测量时间 = 3:00
寡霉素 / BAM15	注射 1（A 端口）	循环次数 = 10	01:00:00
		混匀时间 = 3:00
		等待时间 = 0:00
		测量时间 = 3:00
鱼藤酮 + 抗霉素 A	注射 2（B 端口）	循环次数 = 10	01:00:00
		混匀时间 = 3:00
		等待时间 = 0:00
		测量时间 = 3:00
总时间：			03:00:00

表3：使用XFe96分析仪检测单个三维球状体线粒体能量代谢的实验方案设置。

4. 单击开始运行以弹出保存位置对话框。
5. 输入结果文件的保存位置，并将组装好的传感器盒放入分析仪侧面门中伸出的温控托盘内。等待温控托盘自动打开，屏幕显示加载校准工具板提示。在按照屏幕提示操作前，请确认以下事项：i) 传感器盒在工具板上安装到位，ii) 传感器盒的盖子已移除，iii) 传感器盒在工具板上的方向正确。
6. 按照屏幕上的指令启动传感器盒校准。
   注意：完成校准所需时间约为10–20分钟（在37 °C下进行检测时）。
7. 传感器盒校准完成后，根据Wave控制器上的屏幕提示，将球形微孔板装入分析仪，以启动12分钟的平衡步骤。
   注意：绿色方框内带白色对勾表示该孔校准“良好”。若任何孔未能通过“良好”校准，则会以红色方框内白色叉号标示。此类孔应予以记录，并在实验结束后使用修改检测标签页排除在分析之外。
8. 等待分析仪在完成平衡步骤后（如仪器操作规程所述）自动开始采集基线数据。
9. 为完成实验，请遵循Wave控制器上的屏幕指令。
   注意：一旦将球形微孔板从分析仪中取出，应丢弃传感器盒；如有需要（例如双链（ds）DNA定量），将球形微孔板保留以进行后续分析。若微孔板无需进一步分析，可与传感器盒一并丢弃。
10. 等待检测对话框出现，查看结果或返回模板视图。

5. 数据标准化与分析策略——检测后标准化与下游检测（可选步骤）

1. 数据归一化
   1. 为对类球体数据进行归一化处理，请参考与计算类球体大小和体积以及定量检测类球体测定中双链DNA（dsDNA）相关的数据归一化策略的一系列方案。这些内容已作为补充文件提供；详见 补充文件1 和 补充文件2。
2. 数据分析
   1. 要将数据导出至自动化分析生成器之一，请遵循WAVE控制器上的数据导出命令，并选择与测定类型相匹配的导出生成器。或者，可导出数据文件并将其上传至Seahorse分析系统。
      注意：报告生成器和Seahorse分析系统的缺点在于，数据分析受限于XF测定的设计方式，无法跨测量周期进行平均值计算。而通过仪器软件手动导出数据集，则可根据用户偏好灵活处理。鉴于评估三维类球体线粒体呼吸的加样策略可能与典型的“MitoStress”测试不同，我们已开发了一系列电子表格模板，用于帮助分析针对三维细胞培养的此类数据集，并可根据请求提供。这些数据模板文件将提供 图2 中详细说明的关键线粒体呼吸参数数据。
   2. 为分析数据，请从WAVE控制器软件中将数据导出为电子表格报告，并使用独立的电子表格模板进行分析。

图 2：由细胞外通量数据分析所得参数的示意图解。 缩写：OCR = 氧气消耗速率。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

为获得形态良好且结构紧密的球状体，每种细胞系均针对接种密度和培养时间进行了单独优化（图3。A549、HepG2/C3A和SK-OV-3细胞系最初形成松散的聚集体，直到培养7天后才发育为具有清晰边界的圆形类球体。相比之下，MCF-7细胞在3天内即可形成类球体。所有类球体模型在培养结束后，初始细胞接种密度与类球体体积之间均表现出明显相关性。类球体的大小和形态随接种密度的优化而得到调控。在所有模型中，随着类球体尺寸增大，其形态和圆度开始下降。各细胞系的接种策略在4 × 10³ 每孔细胞数：A549 和 SK-OV-3 细胞为 cells/well；HepG2/C3A 细胞的接种密度已在其他研究中优化为 1 × 10³ 细胞/孔，MCF-7 细胞使用密度为 4 × 10³ 所有实验中每孔的细胞数/孔。在优化的接种策略下，球状体体积介于 5.46 × 10⁷ µm³（SK-OV-3）和1.45 × 10⁸ µm³ (A549) (

讨论

主要发现与成果
本文提供了一项详细的实验方案 利用XFe96 XF分析仪，结合一系列癌源性细胞系，检测单个三维球状体的线粒体能量代谢。本文建立并描述了一种快速培养A549、HepG2/C3A、MCF7和SK-OV-3细胞球状体的方法，该方法采用抗细胞黏附技术实现细胞强制聚集。本方案针对使用XF技术检测球状体代谢过程中的多个关键问题进行了探讨，包括：（1）优化球状体培养流程，以及将球状体从原始培养容器转移至技术供应商提供的专用球状体检测微孔板时的操作与处理；（2）呼吸作用相关化合物的使用浓度及其渗透的时间依赖性；（3）加样注射策略的选择；（4）实验组间数据标准化的方法。本文对上述各项因素均进行了系统研究，并在下文予以详细讨论。所提出的方法旨在以XFe96通量分析仪为基础，利用单个三维球状体获得稳定可靠的代谢氧通量数据。该实验策略可作为通用框架和起点，适用于基础实验室条件下其他球状体模型的建立与应用。

注意事项
类球体生长、大小及XF技术的敏感性
为了使用...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A549	ECACC	#86012804	肺癌细胞系
Agilent Seahorse XF RPMI 培养基，pH 7.4	Agilent Technologies Inc.	103576-100	含 1 mM HEPES 的 XF 检测培养基，不含酚红、碳酸氢钠、葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠
Agilent Seahorse XFe96 细胞外通量分析仪	Agilent Technologies Inc.	-	用于单个类球体中氧消耗速率测量的仪器
抗霉素 A	Merck Life Science	A8674	线粒体呼吸链复合体 III 抑制剂
BAM15	TOCRIS bio-techne	5737	线粒体质子载体解偶联剂
黑色壁微孔板	Greiner Bio-One	655076	用于基于荧光的检测
CELLSTAR 防粘附表面 96 孔 U 型微孔板	Greiner Bio-One	650970	用于生成类球体的微孔板
CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒	Promega	G9681	用于测定 3D 微组织类球体细胞活力的检测试剂盒
Cultrex 聚-D-赖氨酸	R&D Systems a biotechne brand	3439-100-01	用于包被 XFe96 类球体微孔板以促进类球体附着的分子细胞粘附剂
D-(+)-葡萄糖	Merck Life Sciences	G8270	细胞培养生长及 XF 检测培养基的补充剂
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基 (DMEM)	Gibco	11885084	HepG2/C3A 类球体的培养基
EVOS XL Core 成像系统	Thermo Fisher Scientific	AMEX1000	相差成像显微镜
EZ-PCR 支原体检测试剂盒	Biological Industries	20-700-20	细胞培养物中的支原体筛查
FIJI 即 Image J			合并图像的分析
胎牛血清	Merck Life Science	F7524	细胞培养基补充剂
HepG2/C3A	ATCC	#CRL-10741	肝癌细胞系，源自亲代 HepG2 细胞系的克隆衍生物
Lactate-Glo	Promega	J5021	用于测定类球体培养基中乳酸含量的检测试剂盒
L-谷氨酰胺（200 mM 溶液）	Merk Life Sciences	G7513	细胞培养生长及 XF 检测培养基的补充剂
M50 体视显微镜	Leica Microsytems	LEICAM50	体视解剖显微镜；用于类球体操作
MCF-7	ECACC	#86012803	乳腺腺癌细胞系
来自Streptomyces diastatochromogenes的鱼藤酮	Merck Life Science	O4876	ATP 合酶抑制剂
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	添加至细胞培养基中的抗生素
Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒	Initrogen	P7589	类球体中双链 DNA 的分析
鱼藤酮	Merck Life Science	R8875	线粒体呼吸链复合体 I 抑制剂
RPMI 1640	Gibco	21875091	A549、MCF7 和 SK-OV-3 类球体的培养基
Seahorse Analytics	Agilent Technologies Inc.	Build 421	https://seahorseanalytics.agilent.com
Seahorse XFe96 类球体 FluxPak	Agilent Technologies Inc.	102905-100	每个 Seahorse XFe96 类球体 FluxPak 包含：6 个 Seahorse XFe96 类球体微孔板（102978-100）、6 个 XFe96 传感器盒和 1 瓶 500 mL Seahorse XF 校准液（100840-000）
移液管：5、10 和 25 mL	Greiner Bio-One	606107; 607107; 760107	细胞培养耗材
SK-OV-3	ECACC	#HTB-77	卵巢腺癌细胞系
丙酮酸钠（100 mM 溶液）	Merck Life Science	S8636	细胞培养生长及 XF 检测培养基的补充剂
T75 cm2 细胞培养瓶	Greiner Bio-One	658175	用于维持细胞培养的组织培养处理瓶
TrypLExpress	Gibco	12604-021	细胞解离试剂
Wave 控制器软件	Agilent Technologies Inc.	-
宽口移液枪头	STARLAB International GmbH	E1011-8400	具有宽开口的移液枪头，用于类球体操作