使用多指标免疫磁珠检测法对新冠血清转化进行动态监测

摘要

本文介绍了一种便捷的方法，可同时监测针对SARS-CoV-2感染或疫苗接种所引发的免疫反应中两种免疫球蛋白亚型（IgA、IgM或IgG）抗体滴度的动态变化。该“多重分析物新冠免疫反应检测组”采用基于编码微球的三种间接免疫测定法，使用具备“双通道”功能的流式多重读数仪进行检测。

摘要

用于同时检测多种生物标志物的多重技术已存在数十年；然而，针对同一分析物上多个表位进行评估的方法仍然有限。本报告描述了一种用于血清学检测的多重免疫磁珠法的开发与优化过程，该方法可检测与SARS-CoV-2感染或疫苗接种免疫反应相关的常见免疫球蛋白同种型（如IgA、IgM和IgG）。实验采用基于流式、具备双通道功能的多重荧光读数仪完成。优化内容主要包括分析物捕获时间、检测抗体浓度以及检测抗体孵育时间。通过“双通道”模式，分别对IgG/IgM或IgA/IgM血清型组合建立了分析性能特征（如检测范围（包括定量下限和上限）以及批内和批间精密度）。对于大多数应用而言，IgG捕获时间为30分钟、IgM为60分钟、IgA为120分钟，可在检测性能与通量之间实现良好平衡。检测抗体在4 µg/mL浓度下孵育30分钟时表现最佳，且推荐用于常规应用，因其整体表现出优异的精密度（变异系数百分比（%CV）≤ 20%）和灵敏度。IgG同种型在各检测项目（Spike S1、核衣壳蛋白和膜糖蛋白）中的动态范围跨越多个数量级，支持在临床应用中以1:500稀释比例进行可靠的滴度评估。最后，将优化后的方案应用于4名完成SARS-CoV-2疫苗接种程序的受试者Spike S1血清转化监测。在此队列中，Spike S1特异性IgG水平在第二剂接种后14天达到峰值，其信号强度远高于IgM或IgA同种型（约高出40倍）。值得注意的是，我们观察到Spike S1特异性IgG滴度的衰减速率存在高度个体差异，主要取决于受试者自身因素，这将成为后续研究的主题。

引言

对生物样本中多种疾病相关生物标志物进行同时检测，可为病理过程提供描述性和预测性见解。尽管传统的单分析物免疫学方法（如酶联免疫吸附试验，ELISA）一直是临床和科研领域定量分析的基石，但这些技术在通量、每次检测所需的样本量以及成本效益方面存在显著局限性，严重限制了对疾病进程中常相互关联的多种生物组分的研究¹。基于微球的多重检测技术因其能够整合多种检测项目，提高实验室通量，缓解样本稀缺问题，并减少重复检测以实现最大成本节约，已成为诊断和研究机构不可或缺的平台^1,2,3,4。近年来，随着具备双报告分子功能的仪器问世，该多重检测能力得到了进一步增强。双报告分子功能采用两个荧光通道进行检测，增加了多重检测的维度，使得在同一分析物上检测多个表位成为可能。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是当前新型冠状病毒病2019（COVID-19）大流行的致病原⁵。虽然在疾病初期，RT-PCR检测对于确诊感染至关重要，但血清学抗体滴度检测已被证明在准确、全面评估个体是否曾暴露于病毒或已康复、对免疫接种的应答情况，以及评估新冠疫苗接种效果等方面具有不可替代的作用^6,7。

本报告阐述了利用基于流式、多重读取的双报告系统，检测针对多种SARS-CoV-2病毒抗原的血清学转化的方法。具体而言，该方法可同时检测三种SARS-CoV-2抗原（包括刺突蛋白S1、核衣壳蛋白和膜（又称基质）糖蛋白）的两种抗体亚型（配置为IgG/IgM或IgA/IgM）。该方法为纵向监测血清学转化提供了理想平台，并为抗击新冠疫情提供了有力工具。

方案

所有受试者均在拉什大学医学中心机构审查委员会（IRB）批准的协议 ORA 20101207 框架下，签署书面知情同意书后纳入研究，并严格遵守所有机构规定的伦理研究准则。血液通过常规静脉穿刺采集至紫色真空采血管（K₂EDTA）中，并按照推荐方案进行处理。所得血浆在 -80 °C 下保存，直至进行相关检测。

1. 抗原偶联微球的制备

1. 选择三个不同小瓶的磁性微球，每个小瓶具有独特的微球区域，记录所用每个小瓶的微球编号和批号信息。
   注意：以下步骤将针对每种不同的微球区域分别进行。微球对光敏感，应避免长时间暴露于光照下。在洗涤步骤中，注意不要扰动微球。若发生扰动，需额外静置60秒以完成分离。
2. 使用前将微球储备液涡旋振荡60秒，并超声处理5分钟，以解离聚集的微球。
3. 将1.0 × 10⁶个微球转移至1.5 mL低蛋白结合力的微量离心管中。
4. 将离心管插入磁力分离器中，静置60秒使微球分离。在保持离心管仍处于磁力分离器中的情况下，小心移除上清液，避免扰动微球沉淀。
5. 从磁力分离器中取出离心管，加入100 µL高效液相色谱级水重悬微球，涡旋振荡30秒。将离心管重新放回磁力分离器中静置60秒，随后移除上清液。重复此洗涤步骤两次。
6. 从磁力分离器中取出离心管，加入90 µL 100 mM 磷酸二氢钠缓冲液（pH 6.2，活化缓冲液），涡旋振荡30秒，重悬已洗涤的微球。
7. 向微球中加入10 µL 50 mg/mL Sulfo-NHS（用活化缓冲液稀释），轻轻涡旋10秒；再加入10 µL 50 mg/mL EDC溶液（用活化缓冲液稀释），轻轻涡旋10秒。室温（RT）孵育20分钟，每隔10分钟轻轻涡旋混匀一次。
8. 用50 mM MES缓冲液（pH 5.0，偶联缓冲液）替代高效液相色谱/质谱级水，重复步骤1.4–1.5的洗涤操作，共洗涤两次。
9. 从磁力分离器中取出离心管，加入100 µL偶联缓冲液重悬微球，涡旋振荡30秒，立即加入所需量的目标蛋白。
10. 用偶联缓冲液将总体积调至150 µL，涡旋振荡30秒混匀偶联反应体系，在室温下旋转孵育2小时。
    注意：本实验中所定义的检测方法采用以下蛋白浓度进行偶联：Spike S1：5 µg；核衣壳蛋白：5 µg；膜蛋白：12.5 µg。
11. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）含1%山羊血清白蛋白和0.01%吐温-20（封闭缓冲液）替代高效液相色谱/质谱级水，重复步骤1.4的洗涤操作，共洗涤两次。将洗涤后的微球用含0.05%叠氮化钠的100 µL封闭缓冲液重悬，涡旋振荡30秒。
    ​注意：在进行后续任何操作前，需让微球在封闭缓冲液中充分封闭至少6小时。
12. 使用自动细胞计数仪或血球计数板对回收的微球数量进行计数，并记录实测的微球浓度。
13. 将偶联完成的微球置于4 °C避光冷藏保存。

2. 实验步骤

1. 检测性能（基础方案）
   1. 将偶联微球通过涡旋振荡30秒重新悬浮，并超声处理约60–90秒。
   2. 从各自的管中取出所需量的每种微球胶体，并将微球胶体混合至一个新的1.5 mL微量离心管中。
   3. 将试管插入磁性分离器中，静置60秒使微球沉淀。试管仍置于磁性分离器中时，小心移除上清液，避免扰动微球沉淀。
   4. 将微球从分离器中取出，加入100 µL含1%牛血清白蛋白和0.01%吐温-20的磷酸盐缓冲液（检测缓冲液），涡旋振荡30秒。将试管放回磁性分离器中，静置60秒使微球沉淀。重复此洗涤步骤（即步骤2.1.3–2.1.4）两次。
   5. 通过加入适量检测缓冲液，调整3重检测工作用微球混合物的浓度，使每种目标物的最终浓度为每1 µL含100个微球。
   6. 将步骤2.1.5制备的微球混合物各12.5 µL加入384孔板的每个孔中，或各25 µL加入96孔板的每个孔中。
   7. 用检测缓冲液将血浆/血清样本稀释500倍。根据所需滴定度制备标准品。
   8. 加入12.5 µL检测缓冲液作为空白样本，并将各稀释后的样本或标准品分别加入384孔样本板的指定孔中；或在96孔样本板中，每孔加入25 µL空白、稀释样本或标准品。
   9. 用铝封膜或铝箔覆盖板孔，在设定为700 rpm的板式振荡器上室温孵育1小时。
      注：稀释曲线的示意图见表1。
   10. 按照步骤2.1.11所述，用检测缓冲液将抗人检测抗体（二抗溶液）配制成4 µg/mL的工作浓度。
   11. 将山羊抗人IgM与Super Bright 436（SB）偶联物/山羊抗人IgA与藻红蛋白（PE）偶联物检测抗体配制成4 µg/mL；或山羊抗人IgM与SB偶联物/山羊抗人IgG与PE偶联物检测抗体配制成4 µg/mL。
       注：对于384孔板，每孔需12.5 µL配制好的二抗溶液；对于96孔板，每孔需25 µL。
   12. 将板置于磁性分离器上，快速洗涤后用力倒置在生物危害容器上方以去除孔内液体。保持板倒置状态，用力在厚叠的纸巾上敲击数次。
   13. 每孔加入100 µL检测缓冲液，通过如前所述的强力倒置方式从生物危害容器上方去除液体。重复此步骤（2.1.12–2.1.13）共两次洗涤。将所有使用过的纸巾丢弃至生物危害容器中。
   14. 向384孔板的每孔加入12.5 µL二抗工作液，或向96孔板的每孔加入25 µL。用铝封膜或铝箔覆盖板孔，在设定为700 rpm的板式振荡器上室温孵育30分钟。
   15. 重复洗涤步骤2.1.12–2.1.13。
   16. 向384孔板的每孔加入75 µL检测缓冲液，或向96孔板的每孔加入100 µL。用铝封膜或铝箔覆盖板孔，在设定为700 rpm的板式振荡器上室温孵育5分钟。
   17. 根据仪器操作手册，取60 µL反应混合物使用仪器分析仪进行检测。
2. 样本捕获孵育时间的优化
   1. 按照第2.1节所述步骤操作，在步骤2.1.9中分别采用30分钟、60分钟和120分钟的孵育时间。
      注：孵育可在不同的板上分别进行，或在步骤2.1.6暂停，直至达到所需孵育时间后再继续进行步骤2.1.9。
   2. 根据制造商推荐的方法，取60 µL检测混合物在分析仪上进行板读数。
3. 二抗浓度的优化
   1. 按照第2.1节详细描述进行本实验，但对二抗工作液（步骤2.1.10–2.1.11配制）中试剂的终浓度作如下调整：
      山羊抗人（或兔）IgM SB偶联检测抗体浓度分别为8、4、2、1和0.5 µg/mL。
      山羊抗人（或兔）IgA PE偶联检测抗体浓度分别为8、4、2、1和0.5 µg/mL。
      山羊抗人（或兔）IgG PE偶联检测抗体浓度分别为8、4、2、1和0.5 µg/mL。
      山羊抗人（或兔）IgG PE偶联/山羊抗人（或兔）IgM SB偶联检测抗体浓度分别为8、4、2、1和0.5 µg/mL。
      ​山羊抗人（或兔）IgA PE偶联/山羊抗人（或兔）IgM SB偶联检测抗体浓度分别为8、4、2、1和0.5 µg/mL。
   2. 根据制造商推荐的方法，取60 µL检测混合物在分析仪上进行板读数。
4. 二抗孵育时间的优化
   1. 按照第2.1节所述进行本实验，在步骤2.1.14中分别设置15分钟、30分钟、60分钟和120分钟的孵育时间。
   2. 根据制造商推荐的方法，取60 µL检测混合物在分析仪上进行板读数。
5. 使用优化后的双通道检测法评估受试者样本
   1. 在完成新冠疫苗（即第二剂）接种后的第-21天、第-11天、第-1/0天、第+14天、第+28天、第+60天、第+90天和第+120天，采集受试者的血浆样本（n = 4）。
      注：第0天表示疫苗接种完成的时间点。
   2. 使用基础方案（第2.1节）对所有样本进行检测，采用IgG/IgM或IgA/IgM双通道检测法。
   3. 将各特异性免疫球蛋白及检测的实验结果归一化至其观察到的最大中位荧光强度（MFI）值。

结果

典型的检测结果与性能评估
免疫磁珠检测在多个（对数）数量级范围内检测时，通常呈现S型曲线，如图1中各图所示。用户需通过实验确定多重检测中每种分析物的最佳浓度范围，以明确其完整的定量范围，同时应避免过度采样极端值区域（即接近定量下限 [LLOQ] 或定量上限 [ULOQ] 的区域）。然而，实际检测所需的范围取决于目标分析物在特定稀释倍数下于生物基质（即“未知样本”）中的分布情况。此外，尽管标准曲线通常采用四参数或五参数拟合算法进行线性回归分析，但特定曲线的线性区段通常能以线性定量模型（y = mx + b）提供最高的定量准确性。在定量检测方法开发中，应力求使校准曲线与未知样本在特定稀释倍数下的实测值相匹配。

对于Spike S1、核衣壳蛋白（Nucleocapsid）和膜蛋白（Membrane）抗体，分别评估了基于1:5连续稀释系列的7点标准曲线，其浓度范围分别为Spike S1和核衣壳蛋白抗体0.000064 µg/mL至1 µg/mL，膜蛋白抗体0.00032 µg/mL至5 µg/mL，如图1所示。每种检测方法的最低检测限（LLOD）定义为能够产生可与背景信号区分的最低分析物浓度。LLOD可通过先前描述的公式^8,9确定：LLOD = LoB + 1.645(SD_{low concentration} sample)。其中LoB为“空白限”，即在预期为零值时由空白样本产生的“表观”分析物浓度，可通过以下公式确定：LoB = Mean_blank + 1.645(SD_blank)⁸。根据该方法，Spike S1检测的MFI值范围为134.38至20191.2，其中134.38 MFI对应0.00024 µg/mL，被定义为LLOD。膜蛋白检测的实际MFI范围为52.24至4764.9，其中52.24 MFI计算为0.004885 µg/mL，被指定为LLOD。核衣壳蛋白检测的MFI范围为517.9至19666.34，其中517.9对应0.00024 µg/mL，被确定为LLOD。最高检测限（ULOD）定义为分析物浓度达到后MFI变化不再呈线性、信号响应趋于饱和的浓度点。需要注意的是，除核衣壳蛋白曲线外，所测试标准品的完整S型曲线特征尚不可见。然而，鉴于迄今为止所有未知样本（以1:500稀释）检测所得的MFI值均位于各分析物对应的标准曲线范围内，因此可通过四参数或五参数线性回归拟合轻松实现定量分析。

检测精密度
板内精密度：在同一块板上进行四次重复检测以评估检测精密度，以 %CV（变异系数）表示，即标准差与平均值的商乘以 100。选择标准品第 2 点和第 5 点进行此项统计，数值列于表 2中。通常可接受的 %CV 上限阈值为 ≤20%，本实验数据均符合该标准，唯膜结合型 IgG 的标准品 2 除外，其可能由背景信号水平所致，可通过剔除离群值进行校正（数据未显示）。需要注意的是，在膜结合型检测中，当 MFI 值<200 时，读数表现出明显的不稳定性，这种情况在 IgA 和 IgM 同种型中最常见。

批间精密度：每项检测制备并测试了三个不同的微球试剂批次，其定义与批内精密度相同（如上所述，参见图1）。通过计算三个批次平均结果的%CV来评估批间变异性，结果如Table 3所示。同样，可接受的%CV上限阈值设定为≤20%，所有测试条件均符合该标准（其中Membrane IgG标准品2的表现与上述结果相似）。需要注意的是，在定制检测方法开发过程中，同一免疫试剂的多个批次之间，净MFI值的批间变异性是常见现象。使用从商业来源获得的抗目标抗体（例如兔抗Spike S1抗体）构建的校准曲线，再结合抗物种检测抗体，可提高分析结果的一致性，并允许在不同时间点对多个批次进行比较。

使用人源样本的批间精密度：采用在首次报告 SARS-CoV-2 感染症状后一个月内采集的人血浆样本（n = 5），重复评估了批间精密度；实验使用了三批不同的检测试剂（即不同的微球试剂制备批次）。结果如表4所示，%CV 值均处于典型的上限阈值 ≤20% 范围内，表明具有良好的精密度。Spike S1、Nucleocapsid 和 Membrane 的 IgG 抗体滴度的平均 %CV 值分别为 9.9%（范围 2.6%–18%）、11.0%（范围 3.5%–24.4%）和 7.6%（范围 3.2%–12.9%）。针对这三种分析物的 IgM 和 IgA 抗体滴度也观察到类似结果，其 %CV 值均<20%。唯一例外是第5号受试者针对 Membrane 蛋白的 IgM 抗体滴度，该数据随后被作为离群值剔除。人源样本评估所得的精密度结果与前述兔源抗体的结果一致，提示该检测方法可轻松调整用于评估多种物种中抗原的抗体滴度，且对检测精密度影响较小。如前所述，在 Membrane 蛋白检测中存在明显的读数不稳定性，当 MFI 值<200 时尤为明显，这种情况最常出现在 IgA 和 IgM 同种型中。

一抗浓度优化
使用抗原偶联的微球评估了分析物的“捕获时间”，并通过改变一抗孵育时间（30 分钟、1 小时、2 小时和 4 小时），检测血浆样本或标准品中的抗体。平均 MFI 的差异以特定孵育时间与最长孵育时间的比值表示，即图 2中的 % Max.，比较了 30 分钟（最短时间）与 4 小时（最长时间）的孵育效果。结果显示，IgG 对 Spike S1、膜蛋白（Membrane）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid）抗体的滴度在 120 分钟时达到最佳，表明其一抗结合动力学较快，有利于提高检测通量。然而，IgA 和 IgM 同种型表现出较慢的动力学（数据未显示），其捕获信号在 4 小时时间点达到峰值，如图 2所示。总体而言，在接近检测饱和度与实际生产中每项检测所需时间效率之间需取得平衡（以最大化通量）。据此，本研究观察到在定量检测中，IgG 的最短孵育时间为 30 分钟，IgM 为 60 分钟，IgA 为 120 分钟时即可获得适宜的信号。

二抗浓度优化
测试了五种不同浓度的二抗（山羊抗人IgG，PE标记；山羊抗人IgA，PE标记；山羊抗人IgM，SB标记）（0.5、1、2、4和8 µg/mL）。所有抗体均显示出较宽的信号范围，在任何条件下均未出现明显的信号饱和，从而确保了在任一浓度下均可实现线性测量。例如，使用0.5 µg/mL浓度的SB标记山羊抗人IgM进行Spike S1检测时，其平均信号为最高浓度（8 µg/mL）所产生MFI的13.2%；而使用4 µg/mL浓度时产生的MFI则为最高信号MFI的73.3%。其他Spike S1抗体同种型、膜蛋白抗体和核衣壳蛋白抗体信号范围的详细信息见表5和图3。从实际应用角度考虑，最佳二抗浓度与先前所述的4 µg/mL浓度之间的主要差异体现在检测灵敏度和检测成本方面。具体而言，对于抗体滴度较低或珍贵样本量有限的应用场景，采用8 µg/mL的二抗浓度可能更为理想，但此类检测的相关成本将显著高于使用先前确定的4 µg/mL浓度。相反，在预期抗体滴度较高（如已接种Covid-19疫苗的个体或血清样本充足的情况）的情况下，使用较低浓度的二抗（例如1 µg/mL）可带来成本效益优势。

二抗孵育时间的优化
通过调整二抗孵育时间（15、30、60 和 120 分钟），进一步考察了孵育时长可能产生的影响。通常情况下，以特定孵育时间与最长孵育时间的平均荧光强度（MFI）比值表示的 %Max 指标显示，Spike S1、膜蛋白（Membrane）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid）抗体在 15 分钟（最短时间）与 120 分钟（最长时间）孵育之间的差异分别未超过 30%、55% 和 50%，表明二抗结合反应动力学较快，有助于提高检测通量。表 6 列出了所有孵育时间下信号变化的详细数据。本分析中不同孵育时间所获得信号的图示见 图 4。

双通道性能与特异性
针对每种分析物，将单一报告分子格式运行（仅IgG-PE、仅IgA-PE或仅IgM-SB）所产生的信号，与该分析物在双报告分子格式下运行时产生的信号进行比较（例如，仅Spike S1 IgG-PE 与在双报告分子格式中联合使用Spike S1 IgG-PE和Spike S1 IgM-SB的情况）。通过两种格式下信号的检测精密度（以%CV表示）来分析本实验结果之间的关系。Spike S1检测的%CV值分别为：IgM为6.19%，IgG为16.4%，IgA为23%。膜蛋白（Membrane）检测的%CV值分别为：IgM为3.3%，IgG为7.9%，IgA为16.4%。最后，核衣壳蛋白（Nucleocapsid）检测的%CV值分别为：IgM为8.7%，IgG为10.3%，IgA为24.2%。IgM和IgA同种型所观察到的精密度结果提示，由于不同类别免疫球蛋白之间已知的结合动力学差异，延长孵育时间可能带来更优的检测性能。图4展示了不同浓度二抗条件下各检测格式之间的一致性。

为确认报告通道的特异性，每次仅测试一个报告通道，同时将另一通道设为空白，以检测非特异性信号（串扰效应）。这些结果表明，在各种实验条件下，两个报告通道之间的交叉信号污染可忽略不计，具有高度特异性。这些结果如图5所示。总体而言，我们观察到通道1对通道2的干扰率为6.45%。然而，当考虑信号强度时，在双报告通道模式下观察到以下潜在干扰水平：Spike IgG/IgM 为71.98%，Spike IgA/IgM 为28.11%；Membrane IgG/IgM 为7.41%，Membrane IgA/IgM 为134.61%；Nucleocapsid IgG/IgM 为146.03%，Nucleocapsid IgA/IgM 为112.13%。在当前设定的配置下，这意味着Spike IgM需与IgA同型联合检测，Membrane IgM需与IgM同型联合检测，而核衣壳蛋白的检测则不应采用双通道模式进行。该发现可能提示需要探索调整标记策略，即将IgA和IgG在通道2中检测，而IgM在通道1中检测。

新冠疫苗接种后血清转化事件的评估
在四名受试者中，通过Spike S1检测方法，在从接种前至完成新冠疫苗接种系列后四个月的不同时间点，监测了IgA、IgM和IgG的血清转化情况。检测以双通道模式完成（IgG/IgM 和 IgA/IgM，IgM值取平均值）。所有受试者均按照标准程序接受两剂免疫接种，第一剂与第二剂之间间隔21天。图6A-C展示了每位受试者的免疫应答曲线。针对核衣壳（Nucleocapsid）和膜蛋白（Membrane）抗原的免疫球蛋白检测值均处于背景水平（数据未显示），这与所有受试者在接种前无既往记录的SARS-CoV-2感染情况一致。总体而言，观察到的Spike S1特异性IgA和IgM水平较IgG同种型滴度约低40倍；IgM和IgG同种型的峰值滴度最早在接种后14天达到，而IgA同种型的峰值滴度则在第二剂接种时（第0天）至第二剂接种后14天之间达到，具体时间因人而异。值得注意的是，Spike S1特异性IgG滴度在完成疫苗接种后的四个月内开始以高度可变的速率下降，且下降模式具有个体差异性。

图 1：典型的三重标准曲线。 三种分析物的典型标准曲线；以七点、1:5 系列稀释曲线表示，起始浓度分别为（A）Spike S1 1 µg/mL，（B）膜蛋白 5 µg/mL，以及（C）核衣壳蛋白和抗体 1 µg/mL。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：一抗/样本孵育时间优化：使用不同一抗/样本（抗体捕获）孵育时间（从 30 分钟到 4 小时）所获得的标准品 1-7 的平均 MFI 信号（如表 1所示）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：二抗浓度优化及双通道检测性能。 曲线显示了在0.5–8 µg/mL范围内测试的不同二抗浓度所产生的平均MFI（归一化至该系列中记录的最高值）。每种情况均分别以单通道和双通道检测方式进行，以评估实验格式之间的差异。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：二抗孵育时间优化，双通道模式。观察到的MFI值（归一化至该系列中记录的最高值）随二抗孵育时间变化的代表性图谱。实验以双通道检测形式进行，分别为（A-C）IgA/IgM 或（D-F）IgG/IgM 组合。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：双通道检测的特异性评估。 双通道检测格式的实验结果，每种组合中均指定其中一个作为空白对照，以证明不存在跨通道荧光信号或干扰。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 6：新冠疫苗接种后血清转化示意图。 图中显示了在新冠疫苗接种过程中（接种前至完成接种后4个月）针对Spike S1抗原的（A）IgG、（B）IgM和（C）IgA抗体的相对滴度；时间以完成疫苗接种系列后的天数表示；疫苗接种时间点以红线标出。实验按照方案所述以双通道模式进行。请点击此处查看该图的放大版本。

标准编号	稀释系列	抗刺突蛋白S1或N（µg/mL）	抗膜蛋白（µg/mL）
空白	空白	-	-
1	STD7 1:1	1	5
2	STD6 1:5	0.2	1
3	STD5 1:25	0.04	0.2
4	STD4 1:125	0.008	0.04
5	STD3 1:625	0.0016	0.008
6	STD2 1:3125	0.00032	0.0016
7	STD1 1:15625	0.000064	0.00032

表1：标准曲线的稀释系列：用于IgG血清型标准曲线的稀释倍数表；以7个点、1:5倍比连续稀释曲线呈现，起始浓度分别为α-刺突蛋白S1和α-核衣壳抗体1 µg/mL，α-膜蛋白抗体5 µg/mL。

分析物	样本	重复1	重复2	重复3	重复4	平均值	标准差	%CV
Spike S1	STD2	369.4	356.9	295.2	271.5	323.3	47.4	14.6
	STD5	3869.1	3437	3970.2	4240.7	3879.3	334	8.6
Membrane	STD2	40.6	37.7	49.9	27.8	39	9.1	23.3
	STD5	733.2	731.3	724	678.1	716.7	26	3.6
Nucleocapsid	STD2	1746.7	1790.8	1577.3	1664.8	1694.9	94.2	5.6
	STD5	15598.1	14735.5	18369.5	17408.5	16527.9	1657.7	10

表2：批内精密度：基于同一次实验中单一批次检测对标准品2（STD2）和标准品5（STD5）的四种重复标准抗体混合物测定结果计算的变异系数百分比（%CV）。重复样本及均值所提供的数值代表观测到的MFI值。

分析物	样本	批次1	批次2	批次3	平均值	标准差	%CV
Spike S1	STD2	383.2	424.4	379.9	395.8	24.8	6.3
	STD5	5639.7	6062.5	6384.3	6028.8	373.4	6.2
膜蛋白	STD2	39.1	58.5	59.1	52.2	11.4	21.8
	STD5	732.3	941.4	701.1	791.6	130.7	16.5
核衣壳蛋白	STD2	1342.6	1621	1718.2	1560.6	195	12.5
	STD5	13543.9	14843.2	17883.4	15423.5	2227.2	14.4

表3：标准品的批间精密度：基于同一次实验中标准品2和标准品5的三次独立批次检测结果计算得到的变异系数百分比（%CV）。提供的重复样本值及平均值代表实测的MFI值。

		IgG-PE		IgM-SB		IgA-PE
		平均 MFI	%CV	平均 MFI	%CV	平均 MFI	%CV
Spike S1	受试者 1	8002.3	17.7	1949.5	1.3	2045.8	5.5
	受试者 2	19155.8	7.3	918.6	4.1	1684.5	3.9
	受试者 3	17865.6	18.0	549.4	3.8	961.3	8.1
	受试者 4	11901.1	2.6	1603	4.8	8736.4	5.5
	受试者 5	9801.8	4.0	1014.1	3.0	2747.6	9.3
Nucleocapsid	受试者 1	15097.8	11.3	1049.7	9.9	5276.5	3.9
	受试者 2	15204.3	12.1	265.9	5.2	6761.3	11.9
	受试者 3	18471.7	24.4	329.1	4.5	14308	2.9
	受试者 4	16424.7	3.5	2418.1	0.1	4234.7	4.2
	受试者 5	13344.9	3.6	225.6	10.0	13436.5	9.7
Membrane	受试者 1	514.6	8.6	180.6	14.0	141.2	9.8
	受试者 2	196.8	5.2	57	20.7	55.5	13.0
	受试者 3	553.7	12.9	54.5	21.2	191.2	18.6
	受试者 4	377.9	3.2	68.1	22.1	62	2.3
	受试者 5	325.4	8.2	11.4	91.6	74.6	20.8

表4：使用人源样本的批间精密度：根据来自五名SARS-CoV-2感染者的血浆样本（稀释500倍）进行三批检测所计算出的平均百分比变异系数（%CV）。

		刺突蛋白S1		膜蛋白		核衣壳蛋白
	µg/mL	平均MFI	% 最大值	平均MFI	% 最大值	平均MFI	% 最大值
IgM	0.5	186	13.2	32	25.2	132.7	13.6
	1	304.2	21.6	45.8	36	194.4	19.9
	2	664.5	47.2	78.8	61.9	458.2	47
	4	1032.1	73.3	101.3	79.6	707.8	72.6
	8	1407.1	100	127.2	100	975	100
IgG	0.5	809.7	4.9	27.5	15	1355.6	6.3
	1	1696.9	10.2	40.6	22.2	2782.1	13
	2	4543.8	27.3	68.3	37.3	6661.2	31.2
	4	10003.5	60	110.7	60.5	12605.6	59
	8	16662.8	100	182.9	100	21360.6	100
IgA	0.5	797.4	19.3	31.1	47.2	2056.5	16.1
	1	1529.5	37	41.4	62.8	3869	30.4
	2	2261.3	54.7	48.6	73.3	6648.9	52.2
	4	2320.4	56.2	48.3	73.2	6548.1	51.4
	8	4132.2	100	65.9	100	12744.8	100

表5：二抗浓度优化： 使用不同浓度的二抗（范围从0.5 µg/mL到8 µg/mL）所产生的平均MFI信号。每个信号值还表示为8 µg/mL时信号（“最大值”）的百分比，以显示相对信号强度。

		刺突蛋白S1		膜蛋白		核衣壳蛋白
	孵育时间（分钟）	平均MFI	% 最大值	平均MFI	% 最大值	平均MFI	% 最大值
IgM	15	1185	72.2	40.4	48.9	609.5	53.3
	30	1416.6	86.3	58.4	70.7	894.2	78.2
	60	1324.8	80.7	73.6	89.1	945.6	82.7
	120	1641.2	100	82.6	100	1143.2	100
IgG	15	12917.6	80.5	244.4	44.9	15429.8	80.8
	30	14915.4	92.9	434.7	79.9	18797	98.5
	60	15340.3	95.6	421.4	77.5	18694.4	97.9
	120	16050.3	100	544	100	19085.8	100
IgA	15	3141.9	78.2	75	66.8	9103	86.6
	30	3569.1	88.8	83.9	74.8	9563.8	91
	60	3539.1	88	86	76.6	9555.7	90.9
	120	4020	100	112.2	100	10512.9	100

表6：二抗孵育时间优化： 使用不同二抗孵育时间（从15分钟到120分钟）所获得的平均MFI信号。每个信号值还表示为120分钟时信号（“最大值”）的百分比，以显示相对信号强度。

讨论

针对SARS-CoV-2暴露后产生的免疫应答进行评估，结合基于RT-PCR的感染状态监测，已被广泛描述为明确新冠（Covid-19）康复进程、识别具有潜在治疗价值的恢复期血浆，以及在人群层面调查感染率的有效策略^10,11。用于理解人体血清学转化的多种方法包括蛋白质（抗原）芯片¹²、免疫印迹¹³、快速免疫层析检测装置¹⁴以及酶联免疫吸附测定（ELISA）^15,16,17。上述每种技术均可通过微小调整，分别检测多种免疫球蛋白同种型。然而，这些方法难以被实际改造以实现多种同种型的并行分析（如本论文所述），因而其在基于人群的大规模检测策略中的应用受到成本和通量的限制。其中部分应用还可提供将多种抗原水平进行平行叠加检测的机会，形式包括原始格式或改进格式，例如多重ELISA^18,19。最后，免疫磁珠平台也具备并行检测多种抗原水平的潜力^20,21，但除非使用近期具备“双通道”检测能力的仪器，否则每项检测通常仅限于单一表位（即免疫球蛋白同种型）。

本报告列举了一项案例研究中的实验方案，该研究采用仪器的“双通道”模式，通过免疫磁珠检测法对新冠疫苗接种者的血清转化过程中多个表位进行可靠检测。该方法采用人工实验设计，展现出优异的精密度（%CV 值通常 <20%），若整合实验室自动化系统，性能可进一步提升。所有选定分析物和表位的检测灵敏度和动态范围均适用于常规评估。尽管 commercially-available 抗抗原 IgA 和 IgM 免疫试剂的缺乏限制了定量检测仅限于 IgG 同种型，但这一限制并不妨碍提供半定量评估，或以特定样本作为校准品进行相对评估^22,23。

经过验证的免疫磁珠检测法被用于研究接种新冠疫苗人群队列中的血清转化情况。与其他类似平台相比，该系列仪器在手动操作流程中每天可检测数百名个体的血清转化，在自动化方案中则可达数千名。总体而言，这些结果证实，“双通道”方法具有足够的灵敏度，可在同一检测中并行描述多个表位，且适用于多分析物检测环境。当分别使用藻红蛋白和Super Bright 436荧光染料检测通道1和通道2时，两者灵敏度的差异可能需要设计特定实验，以确保获得可靠的分析结果。也就是说，为保持检测的动态范围能够涵盖未知样本的观测值，可能需要将通道1保留用于检测丰度较低的表位或分析物。除此之外，该检测的设计较为直观，应易于分析能力有限的实验室采用。当然，在考虑通道1与通道2之间的干扰时，应权衡这一因素，正如我们在图5中所观察到的，高丰度同种型的信号干扰可能导致在双通道检测格式下对低丰度同种型产生误导性的分析误差。当分析物浓度差异极大时，此类干扰的可能性若不在检测设计阶段妥善处理，可能成为该方法的重要局限性。

综上所述，本文介绍了一种快速检测与新冠病毒感染或疫苗接种免疫反应相关的主要免疫球蛋白亚型抗体滴度的方法。通过纵向应用该方法评估血清转化，可能提供有助于更好地管理或监测疾病进程的见解，或者为未来的新冠加强疫苗接种计划提供指导依据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
384孔黑色侧壁聚苯乙烯微孔板	Thermo Fisher	12-565-346
活化缓冲液（0.1 M NaH2PO4，pH 6.2）	实验室自配
检测缓冲液（PBS，1% 牛血清白蛋白，0.01% 吐温-20）	实验室自配
牛血清白蛋白，热休克组分	MilliporeSigma	A-7888-50G
偶联缓冲液（50 mM MES，pH 5.0）	实验室自配
新型冠状病毒（COVID-19 M冠状病毒）重组基质蛋白（6xHis标签）	MyBioSource	MBS8574735
一次性移液器吸头
EDC（1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐）	Thermo Fisher	PIA35391
山羊白蛋白，V组分粉末	MilliporeSigma	A2514-1G
山羊抗人IgA，R-PE标记，多克隆抗体	Thermo Fisher	OB205009
山羊抗人IgG，R-PE标记，多克隆抗体	Thermo Fisher	OB204009
山羊抗兔IgG，R-PE标记，多克隆抗体	Thermo Fisher	OB403009
山羊抗人IgM，R-PE标记，多克隆抗体	Thermo Fisher	OB202009
小鼠抗人IgM，SB 436，克隆SA-DA4	Thermo Fisher	62999842
仪器分析仪	Luminex Corp.	INTELLIFLEX-RUO
低吸附微量离心管（1.5 mL）	Thermo Fisher	13-698-794
MagPlex-C微球，区域XXX	Luminex Corp.	MC10XXX-01
MES水合物（2-(N-吗啉)乙烷磺酸水合物）	MilliporeSigma	M2933
微孔板铝封膜	Thermo Fisher	07-200-683
吐温-20	Thermo Fisher	BP337-500
Quality Biological公司PBS，pH 7.2	Thermo Fisher	50-751-7328
封闭缓冲液（PBS，1% 山羊血清白蛋白，0.01% 吐温-20）	实验室自配
SARS-CoV-2（2019-nCoV）核衣壳蛋白（His标签）	Sino Biologicals	40588-V08B
SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白（S1亚基，His标签）	Sino Biologicals	40591-V08H
SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白RBD抗体，兔多克隆抗体	Sino Biologicals	40592-T62
SARS-CoV-2（2019-nCoV）核衣壳抗体，兔单克隆抗体	Sino Biologicals	40588-R0004
SARS-CoV-2（COVID-19）膜蛋白抗体（IN），兔多克隆抗体	ProSci	10-516
Sulfo-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐）	Thermo Fisher	PIA39269
洗涤缓冲液（PBS，0.01% 吐温-20）	实验室自配
水，LC/MS级	Thermo Fisher	W-64