6-羟基多巴胺诱导的成年斑马鱼帕金森病模型的运动功能评估

摘要

本实验方案描述了在腹侧间脑（Dn）区域对成年斑马鱼进行脑室内（ICV）注射神经毒素6-羟基多巴胺（6-OHDA），并利用敞口水箱实验评估损毁后游泳行为的损伤及后续恢复情况，同时结合视频追踪软件进行分析。

摘要

目前治疗手段在延缓帕金森病（PD）多巴胺能神经元丢失方面存在局限性，因此亟需能够恢复这些神经元的替代疗法。当前大量研究致力于利用临床前 体内 模型更深入地理解神经再生过程。然而，哺乳动物的这种自我修复再生能力效率较低。因此，斑马鱼等非哺乳动物因其具备持续自我更新的能力，并且大脑结构与人类高度同源，已成为理想的神经再生研究模型。作为阐明 体内 神经再生相关细胞事件的一部分，我们建立了基于6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的成年斑马鱼PD模型。该模型通过优化的脑室内（ICV）微量注射99.96 mM 6-OHDA，特异性消融斑马鱼脑腹侧间脑（Dn）中的多巴胺能神经元（DpN）。免疫荧光结果显示，在损伤后第3天，DpN消融超过85%，而在损伤后30天，损伤部位的DpN完全恢复。本研究通过开放场实验评估了损伤后斑马鱼游泳行为的障碍及其后续恢复情况，并量化了两个参数：移动距离（cm）和平均速度（cm/s）。通过视频追踪软件分析每组个体鱼（n = 6）的录像记录来评估运动能力。结果表明，与假手术组相比，损伤组斑马鱼在损伤后第3天的速度（cm/s）和移动距离（cm）显著降低（p < 0.0001）。损伤组斑马鱼在损伤后30天游泳行为完全恢复。本研究结果表明，6-OHDA诱导的成年斑马鱼是一种具有可重复性的优良模型，有助于开展帕金森病神经再生机制的研究。未来关于神经再生机制以及调控该过程的内在和外在因素的研究，可能为开发针对帕金森病的新型细胞替代治疗策略提供重要启示。

引言

帕金森病（PD）是一种以肌肉僵直、静止性震颤和运动迟缓为显著特征的疾病，是全球增长速度最快的神经系统疾病^1,2。PD 的风险和患病率随年龄迅速增加，尤其在50岁及以上的人群中更为明显³。迄今为止，帕金森病的病因和发病机制仍不明确，这常常导致早发性 PD 难以被诊断。目前，PD 患者体内多巴胺缺乏以及多巴胺能神经元（DpN）的丢失被认为与运动症状的出现密切相关⁴。基于这一关系，已开发出多种治疗方法，旨在直接替代多巴胺（例如左旋多巴）或补偿 DpN 的丢失（例如深部脑刺激）。尽管这些治疗可缓解症状，但并不能改变疾病的进行性恶化过程⁵。鉴于这一重大局限，细胞替代疗法被提出作为潜在解决方案。然而，由于移植物制备、细胞生长控制以及表型不稳定性等方面的挑战，该疗法的效果尚不一致。此外，细胞替代疗法不仅曾引发伦理争议，还存在诱发脑肿瘤和不良免疫反应的风险^6,7。

现有治疗策略的局限性使得多巴胺能神经元（DpN）再生作为帕金森病（PD）潜在治疗方法受到更多关注。DpN再生或神经再生已成为PD管理中颇具前景的突破之一，不....

方案

本研究已获得玛拉工艺大学（UiTM）动物研究伦理委员会（CARE）的批准[参考编号：UiTM CARE 346/2021，日期为2021年5月7日]。

注意：采用已发表的标准饲养和维持6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁成年斑马鱼帕金森病（PD）模型的实验方案^22,25,26。实验使用5个月以上、体长标准化为3.2–3.7 cm的成年雄性斑马鱼（Danio rerio）进行。

1. 斑马鱼的维持及脑室内微注射前准备

1. 将鱼类饲养在充气水箱中，温度控制在 28 ± 1.0 °C。斑马鱼的饲养与维护全程使用添加商业海盐（1 g/L）的蒸馏水²⁷。
2. 每 45 L 水箱最多饲养 25 条鱼，或每 1.8 L 水饲养 1 条鱼，并维持 14 小时光照与 10 小时黑暗的光周期。每天至少喂食两次，饲料为颗粒饲料并补充冻干蠕虫。
3. 通过将 2.5 g 三卡因甲磺酸盐（MS-222）和 5 g 碳酸氢钠溶解于 250 mL 蒸馏水中，配制浓缩储备液。取 2 mL 储备液稀释至 200 mL，制备工....

结果

本实验评估了成年斑马鱼在脑室内微量注射6-OHDA后游泳行为的变化。选择6-OHDA作为神经毒素的原因在于其无法穿过血脑屏障，从而可在目标区域——间脑腹侧区（Dn）特异性地靶向消融DpN¹⁶。该区域的DpN亚群在解剖结构上与人类黑质致密部的DpN亚群具有相似性³¹。

根据我们之前的研究²²，通过检测成年斑马鱼DpN标志物——酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）的免疫组织化学染色，证实了6-OHDA脑室内微量注射对成年斑马鱼DpN的细胞效应。主要关注的脑区为Dn，由终脑前部（preoptic area, POA）、后结节区（posterior tuberculum, PT）和下丘脑（hypothalamus, Hyp）组成。研究发现，99.96 mM的6-OHDA处理可使成年斑马鱼存活率达到100%，且Dn区域TH免疫阳性（TH-ir）神经元数量最少。此外，在损伤后第3天，Dn中超过85%（p &.......

讨论

本研究成功实现了基于已建立的6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的成年斑马鱼帕金森病（PD）模型的运动功能评估。整个实验包括三个主要步骤：脑室内微注射前的准备工作、斑马鱼脑室内微注射以及运动行为评估。为了确保成年斑马鱼在脑室内微注射后能够健康恢复，并获得良好的实验结果，本研究针对每个步骤推荐了一些最佳操作规范。

脑室注射前准备：动物选择最好在实验前一天完成。需确定斑马鱼的性别并测量其体长。选择体长标准化为3.2–3.7 cm的成年雄性斑马鱼，将其放入单独的实验鱼缸中。此外，鱼类应在实验前禁食24小时，以避免麻醉期间发生反流³³。实验前应准备好一个鱼缸（四壁用白纸包裹），并设置好静水装置，以减少外界环境带来的应激，促进斑马鱼的术后恢复。所有化学试剂均需在每次实验开始前新鲜配制，因其可能随时间迅速降解，并在室温下变得不稳定^34,35。

6-OHDA微量注射：在整个操作过.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
6-羟基多巴胺（6-OHDA）	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	162957
抗坏血酸	Thermo Fisher Scientific, California, USA	FKC#A/8882/53
一次性巴斯德吸管，3 mL	Thermo Fisher Scientific, California, USA	FB55348
微量离心管，0.2 mL	Eppendorf, Hamburg, Germany	30124332
锥形瓶，100 mL	Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia	SumYau0200
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	P4417
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	S5761
氯化钠	Merck, Darmstadt, Germany	106404
体视显微镜	Nikon, Tokyo, Japan	SMZ745
三卡因甲磺酸盐（MS-222）	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	E10521
设备
ANY-maze 软件	Stoelting Co., Illinois, USA	-	版本 7.0；视频追踪软件
Cubis II 微型实验室天平	Sartorius, Göttingen, Germany	SE 2
FemtoJet IV 微注射仪	Eppendorf, Hamburg, Germany	5192000035
Femtotip II，无菌注射毛细管	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242957000
InjectMan 4 显微操作器	Eppendorf, Hamburg, Germany	5192000027
LED 便携式灯	MR. DIY, Selangor, Malaysia	9023251	20 mAh
PELCO Pro Superalloy，偏移型，细尖	Ted Pella, California, USA	5367-12NM
Shanda 水族箱加热器	Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia	SDH-228
温度计	Sera Precision, Heinsberg, Germany	52525
摄像机	Nikon, Tokyo, Japan	D3100