本文介绍了一种使用基于POCT卡片的白细胞分析仪检测外周血白细胞的实验方案。采用两台自动化血液分析仪对相同的血液样本进行检测，以评估该方法结果的一致性和准确性。结果显示，所评估的分析仪与参考系统具有良好的相关性。
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摘要
摘要
白细胞（WBC）是反映机体炎症的重要指标，有助于区分细菌性和病毒性感染。目前，中国大多数基层医疗机构的血液检测技术普及率较低，基层医疗中心亟需一种性价比高且操作简便的血液学检测系统。本文介绍了基于即时检测（POCT）卡片的白细胞分析仪（待评价系统）的原理及操作流程，该系统用于检测全血中的白细胞指标，包括中性粒细胞、淋巴细胞以及中间群细胞（含嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞）。将待评价系统的检测结果与两种商用全自动血液分析仪（参考系统）的结果进行比较，分析待评价系统与商用参考系统之间的相关性与一致性。结果显示，待评价系统与参考系统在白细胞总数和粒细胞数检测上均呈现强正相关（rs = 0.972 和 0.973），而淋巴细胞数的相关性相对较低（rs = 0.851）。Bland-Altman图显示，待评价系统与参考系统检测值之间的主要差异位于95%一致性界限（LoA）范围内，表明两种系统具有良好的一致性。综上所述，待评价系统与广泛使用的全自动血液分析仪相比，具有优异的相关性、稳定的重复性和可靠的可比性，适用于尚不具备全自动五分类血液分析仪的基层医疗机构，尤其适用于新冠疫情防控常态化时期的白细胞检测。
引言
白细胞（WBC）计数或分类是反映机体炎症状况的重要指标，可用于区分细菌感染与病毒感染。白细胞分析还有助于指导后续的诊断与治疗1。目前，五分类全自动血细胞分析仪已在大中型医疗机构中广泛应用，因其自动化程度高、效率高、结果准确可靠，能有效降低检验人员的工作强度，在临床检验中发挥着重要作用2,3。然而，大多数基层医疗机构，如社区卫生服务中心和私人诊所，血细胞分析仪的普及率较低。根据一项关于中国临床实验室建设的全国多中心研究显示，基层医疗机构的实验室建设存在不足，表现为实验室规模小、人才输送不足、科技向农村地区辐射不够等因素4。
自2019年12月以来，新冠肺炎开始在全球范围内传播，并发展为全球大流行。在“后疫情时代”，一系列国家政策相继出台，以实施常态化疫情防控措施。基层医疗机构的实验室在基层诊疗和疾病预防控制中发挥着重要作用，是疫情防控的第一道防线，对新冠肺炎的防控至关重要5。一些研究表明，外周血淋巴细胞和中性粒细胞的检测有助于新冠肺炎患者的筛查、诊断与治疗，中性粒细胞/淋巴细胞比值也可作为重症和危重症新冠肺炎的临床早期预警指标6,7。此外，白细胞检测具有报告快速的优势。基层医疗卫生机构可广泛开展白细胞检测，以协助及时发现和筛查疑似感染病例。
基于卡片的POCT白细胞分析仪（被评价系统；参见材料表）是一种基于金标准“库尔特原理”的三分群血细胞分析仪。该被评价系统可提供一个白细胞直方图和七项血液参数的定量分析结果，包括白细胞计数（WBC）、粒细胞数量（Gran#）、粒细胞百分比（Gran%）、淋巴细胞数量（Lym#）、淋巴细胞百分比（Lym%）、中间细胞数量（Mid#）和中间细胞百分比（Mid%）。该系统采用基于卡片的创新技术，具有可使用单人份检测卡、无液体废弃物、30秒快速检测、无需常规维护以及操作简便等优势，因此特别适用于基层医疗机构。本研究旨在通过与中国台湾两家大型公立医院实验室的两台全自动商用血液分析仪（参考系统1和参考系统2；参见材料表）进行比较，评估基于卡片的POCT白细胞分析仪的临床检测性能。
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方案
本研究及人血样本的使用已获得广州医科大学附属第一医院伦理委员会（GYYY-2016-73）的批准。所有参与者均独立签署书面知情同意书，或由其父母代为签署（针对儿童参与者）。
1. 研究组的基本信息
注意：静脉血样来自就诊于广州医科大学第一附属医院（医院1）和遵义医科大学第五附属（珠海）医院（医院2）的患者。医院1用于血常规检查的仪器为参考系统1，而医院2使用参考系统2。
- 2021年1月，从就诊于医院1（532例）和医院2（534例）并接受血常规检查的患者中，共采集了1066份血液样本。
注意：患者为随机选取，来自多个科室，患有多种不同疾病。 - 排除病历资料不全、不配合或拒绝签署知情同意书的患者。同时排除血液样本出现溶血、乳糜血或浑浊，或血量不足、储存时间超过24小时的患者。
2. 研究流程与关注的测量指标
注意：评估系统需要5 µL血液样本以测定白细胞计数及三项分类参数。采集血液后，分别使用评估系统和参考系统进行血常规检查。
- 分别使用参考系统和待评价系统检测532和534份血液样本的白细胞（WBC）及三项分类参数。
- 由一名经验丰富的技术人员在使用参考系统完成临床检测后，对所选血液样本进行随机重新编号，然后将样本交由另一名经验丰富的技术人员，使用待评价系统进行白细胞（WBC）及分类参数的检测。
- 公布两套系统的检测结果。
- 请第三名技术人员仅对两套系统共有的五项指标（即白细胞计数WBC、嗜粒细胞绝对值Gran#、嗜粒细胞百分比Gran%、淋巴细胞绝对值Lym#、淋巴细胞百分比Lym%）进行分析。
使用评估系统的操作步骤
注意：所评估的系统采用电阻抗原理（库尔特原理）在检测元件中对白细胞（WBC）进行计数。检测流程分为六个部分：启动分析仪、测试准备、血液采集、试剂混匀、样本分析和关闭分析仪。
- 启动分析仪
- 将分析仪背面的 [O/I] 电源开关拨至 [I] 位置。检查分析仪的指示灯是否亮起。
- 在登录对话框中输入正确的用户名和密码，然后点击 登录。确保系统自动执行自检和启动初始化，随后显示 样本分析 主页。
- 测试准备
注意：完整的血液样本检测需要四种耗材：采血针、溶血试剂、内置毛细管的定量移液管以及血细胞检测模块（图1）。- 点击 下一个样本，正确输入性别、姓名及其他临床信息（按需填写），并选择合适的参考组。点击 确定 以保存信息。
注意：不同年龄组具有各自的参考区间，因此选择正确的参考组可以获得更合适的报警提示。新生儿：1–28 天；儿童：29 天至 14 岁；成年男性/女性/通用：大于或等于 15 岁。 - 撕开血细胞检测模块的薄膜，按下 进出仓 按钮，将血细胞检测模块正确放入仪器仓内，确保其孔口朝外。
- 用定量移液管的尖端刺破溶血试剂的密封膜。
- 点击 下一个样本，正确输入性别、姓名及其他临床信息（按需填写），并选择合适的参考组。点击 确定 以保存信息。
- 采血
- 毛细血管采血：用蘸有酒精的棉签单向、单次擦拭左手中指进行消毒。待酒精自然挥发后，使用采血针刺破左手中指皮肤。
- 轻轻挤出第一滴血，并用棉签擦去。继续挤压，使血液形成饱满的"水滴状"，然后用定量移液管内的毛细管采集 5 µL 血液样本。
- 静脉采血：使用定量移液管内的毛细管采集 5 µL 预先取得的静脉血样本。本研究中所有检测均使用含 EDTA-K2 抗凝剂的真空采血管从每位患者采集的静脉血（5 mL）。所有检测应在采血后 30 分钟至 24 小时内完成。
- 毛细血管采血：用蘸有酒精的棉签单向、单次擦拭左手中指进行消毒。待酒精自然挥发后，使用采血针刺破左手中指皮肤。
- 试剂混合
- 将定量移液管插入溶血试剂（2.5 mL）中，并用力按压，使血液样本从毛细管中释放到试剂中。
- 以恒定速度将移液管上下颠倒 15–20 次，使毛细管中的血液与溶血试剂充分混合，直至毛细管中无明显红色残留。本研究中，血液样本与溶血试剂的混合比例为 1:500。
- 样本分析
- 打开盖子，将混合液挤入血细胞检测模块中。
- 按下 进出仓 按钮。待血细胞检测模块进入仓内后，按下 计数 按钮。
注意：绿色指示灯闪烁表示分析仪正在计数。计数完成后，血细胞检测模块将自动退出仓体，应将其取出并妥善处理。每次检测仅需 30 秒。 - 在分析仪界面上连续点击 确定 按钮两次，确认血细胞检测模块已被取出。
- 在分析仪界面上点击 打印 按钮，打印检测结果。
- 关闭分析仪
- 在分析仪界面上点击 关机 按钮，并在弹出的对话框中选择 是。检查系统是否开始执行关机程序。
- 待关机程序完成后，将主机背面的 [O/I] 开关拨至 [O] 位置。
4. 统计分析
- 采用广义极端学生化偏差（ESD）方法检测离群值，并根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）EP9-A3 文件的要求，在后续统计分析中剔除这些离群值8。
- 对于正态分布的连续性数据，计算其描述性参数，如均值和标准差（SD）；对于非正态分布的数据，计算中位数和25%–75%四分位间距；对于分类数据，计算频数和百分比。
- 采用 Pearson χ² 检验或 Fisher 精确检验评估分类变量之间的关联程度；采用配对样本 t 检验或 Mann-Whitney U 检验比较组间数值型数据。
- 通过散点图展示两种系统检测结果的分布及线性关联情况；采用 Spearman 非参数相关性检验评估定量变量之间的关联程度；使用 Bland-Altman 图和组内相关系数（ICC）验证两种系统所测定量值之间的一致性。
- 使用选定的统计软件进行数据分析，P 值 < 0.05 被认为具有统计学显著性。
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结果
示例数据
共在两个研究中心纳入1066例患者，包括医院1（n = 532）和医院2（n = 534）。患者特征见表1。男性占比为49.9%，中位年龄为52（32, 66）岁。纳入研究的患者包括住院患者（51.1%）、门诊患者（39.0%）和体检患者（8.4%）。检测样本来自就诊于内科（30.6%）、外科（19.1%）、妇产科（9.0%）、儿科（3.9%）等科室的患者。
检测异常结果（离群值）
以参考系统结果为横坐标，待评价系统结果为纵坐标，得到1066份样本五项白细胞指标的散点图（结果未显示）。在五项白细胞指标的散点图中，可疑的异常点明显可见。根据ESD方法的分析结果，在1066份样本中，白细胞计数（WBC count）有16个离群值，嗜中性粒细胞绝对值（Gran#）有27个离群值，嗜中性粒细胞百分比（Gran%）有8个离群值，淋巴细胞绝对值（Lym#）有15个离群值，淋巴细胞百分比（Lym%）有9个离群值。剔除这些离群值后进行数据分析，离群值总数占比小于5%。
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讨论
随着现代实验室医学的进步，目前在相同或不同的实验室中，常采用多种检测技术来识别相同的临床标志物。因此，应更加重视检测结果的一致性，以协助临床准确解读和判断检验结果。调查显示，三级医院和独立实验室的检验设备总值明显高于基层医院及其他医疗机构4。尽管此类设备具有多项目检测、高准确性、稳定性好、检测通量大等优点，但也存在价格昂贵、体积大、重量重、操作复杂、试剂消耗量大以及对操作人员专业素质要求高等缺点，因而不适合在基层医疗机构中广泛应用。检测仪器与设备的发展正持续朝着自动化、智能化、标准化、个性化和小型便携化的方向推进9。POCT检测设备具有时效性高、轻便易携带、无需维护等优势，弥补了大型血液分析仪的不足，更易被基层医疗机构所接受10。实现不同检测仪器对同一标本和检测项目的检测结果之间的可比性，是实验室质量管理的核心内容11。然而，目前针对POCT血液分析仪与类似临床产品之间相关性与一致性的研究仍较为少见。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由广东省医学科研基金（A2019224）资助。资助机构同意本研究的设计、数据分析、论文撰写及发表决定。本研究未获得其他资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 血细胞检测模块 | 创慧医疗科技有限公司（中国深圳） | 评估系统的耗材 | |
| 采血针 | 创慧医疗科技有限公司（中国深圳） | 评估系统的耗材 | |
| 溶血试剂 | 创慧医疗科技有限公司（中国深圳） | 评估系统的耗材 | |
| IBM SPSS Statistics 25 | International Business Machines Corp., Armonk, NY | 数据分析软件 | |
| MedCalc 11.4.2.0 | 2021 MedCalc Software Ltd | 数据分析软件 | |
| Microsoft Excel 2019 | Microsoft | 数据分析软件 | |
| 基于即时检测（POCT）卡片的白细胞分析仪 | 创慧医疗科技有限公司（中国深圳） | CX-2000 | 评估系统 |
| 内置毛细管的定量移液器 | 创慧医疗科技有限公司（中国深圳） | 评估系统的耗材 | |
| 西门子全自动血液分析仪及其相关试剂和耗材 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | ADVIA 2120i | 参考系统 2 |
| UniCel DxH 800 库尔特细胞分析系统及其相关试剂和耗材 | Beckman Coulter, Inc. | DxH 800 | 参考系统 1 |
参考文献
- Agbaria, A. H., et al. Diagnosis of inaccessible infections using infrared microscopy of white blood cells and machine learning algorithms. The Analyst. 145 (21), 6955-6967 (2020).
- Mlinaric, A., et al. Autovalidation and automation of the postanalytical phase of routine hematology and coagulation analyses in a university hospital laboratory. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (3), 454-462 (2018).
- Genzen, J. R., et al. Challenges and opportunities in implementing total laboratory automation. Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).
- Kang, F., Li, W., Wang, W., Chen, B., Wang, Z. A nationwide multicenter study on clinical laboratory construction in China. Chinese Journal of Hospital Administration. 35 (10), 867-871 (2019).
- Rawaf, S., et al. Lessons on the COVID-19 pandemic, for and by primary care professionals worldwide. The European Journal of General Practice. 26 (1), 129-133 (2020).
- Balla, M., et al. COVID-19, Modern pandemic: a systematic review from front-line health care providers' perspective. Journal of Clinical Medicine Research. 12 (4), 215-229 (2020).
- Cheng, B., et al. Predictors of progression from moderate to severe coronavirus disease 2019: a retrospective cohort. Clinical Microbiology and Infection. 26 (10), 1400-1405 (2020).
- Budd, J. Measurement procedure comparison and bias estimation using patient samples; approved guideline-third edition. Clinical and Laboratory Standards Institute. 33 (11), (2013).
- Wang, Y. Development trend of testing instruments in grass-roots hospitals. Medical Equipment. 24 (03), 26-27 (2011).
- Miesler, T., Wimschneider, C., Brem, A., Meinel, L. Frugal innovation for point-of-care diagnostics controlling outbreaks and epidemics. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (5), 2709-2725 (2020).
- Vesper, H. W., Myers, G. L., Miller, W. G. Current practices and challenges in the standardization and harmonization of clinical laboratory tests. The American Journal of Clinical Nutrition. 104, Suppl 3 907-912 (2016).
- Vaz Fragoso, C. A. Epidemiology of lung disease in older persons. Linics in Geriatric Medicine. 33 (4), 491-501 (2017).
- Qian, C., Xie, T. Regional differences and demographic reasons of population aging in Guangdong Province. Scientific Research on Aging. 5 (01), 46-56 (2017).
- de Graaf, A. J., Hiemstra, S. W., Kemna, E. W. M., Krabbe, J. G. Evaluation of a POCT device for C-reactive protein, hematocrit and leukocyte differential. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 55 (11), 251-253 (2017).
- Chabot-Richards, D. S., George, T. I. White blood cell counts: reference methodology. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (1), 11-24 (2015).
- Green, R., Wachsmann-Hogiu, S. Development, history, and future of automated cell counters. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (1), 1-10 (2015).
- Henry, B. M., de Oliveira, M. H. S., Benoit, S., Plebani, M., Lippi, G. Hematologic, biochemical and immune biomarker abnormalities associated with severe illness and mortality in coronavirus disease 2019 (COVID-19): a meta-analysis. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (7), 1021-1028 (2020).
- Flanagan, B., Keber, B., Mumford, J., Lam, L. Hematologic conditions: leukocytosis and leukemia. FP Essentials. 485, 17-23 (2019).
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