本文描述了一种使用玻璃圆筒分离稳定转染的黑色素瘤细胞克隆的实验方案。我们重点介绍可能对整个实验成功起决定性作用的实用操作建议。
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本文内容
摘要
摘要
基因组信息发生稳定改变的细胞群体被科学家广泛用作研究模型。这类细胞无需反复转染，因为重复转染可能导致细胞群体异质性以及转染效率不稳定，从而影响实验的可重复性。此外，它们更适用于大规模分析。稳定细胞克隆的建立在多种应用中具有重要价值，例如基因功能研究和重组蛋白的生产。在初始瞬时转染后，获得均一细胞群体的方法有多种。本文介绍使用玻璃环进行单细胞克隆分离的方法。尽管该方法已存在一段时间，但其中存在若干关键步骤，忽略这些步骤可能导致实验失败。我们已成功应用此方法获得稳定过表达目的蛋白（POI）或敲除目的基因（GOI）的细胞克隆。本文详细描述了若干准备步骤，包括筛选药物浓度的优化、玻璃环的制备，以及通过PCR、蛋白质印迹分析、免疫染色或基因组DNA测序（根据所获得克隆的类型而定）验证所获克隆是否实现了GOI表达的预期改变。我们还讨论了已建立的细胞系可能存在的表型异质性问题，因为这可能会影响稳定细胞克隆的获得。
引言
哺乳动物细胞的稳定转染是多种细胞培养应用中的常规方法，包括癌症研究。与瞬时转染相比，其优势在于所引入的外源遗传物质由于整合到宿主基因组中，不会因环境因素（例如细胞汇合度或复制阶段）和细胞分裂而丢失1。建立稳定表达的细胞系可能耗时且具有挑战性，但如果需要在较长时间内持续表达基因，则构建稳定细胞系是首选方案。转染最常见的目的是通过基因表达的过量产生或下调，来研究特定基因或基因产物的功能。然而，重组蛋白的生产以及基因治疗也需要将外源遗传物质导入细胞2。
克隆是指来源于单个细胞的细胞群体。在研究具有基因型和表型异质性的细胞时，分离单细胞克隆是细胞生物学中的关键步骤。目前主要有三种用于获得细胞克隆的技术：稀释法、克隆环法3和细胞分选法4。每种方法各有优缺点。本文详细描述了一种利用玻璃圆筒法分离黑色素瘤细胞克隆的方法。该方法的优点在于，即使来自低密度细胞培养物，细胞也能表现出适度的克隆生长能力。此外，所选细胞已具备增殖能力，因为它们已经形成了克隆5。该操作流程包括将转染后的细胞以较低密度（但非极限稀释）接种至大培养皿中，在含选择性抗生素的培养基中培养2-3周，使其扩展并形成克隆。随后，使用置于克隆上方并以硅脂....
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方案
1. 细胞传代与药物浓度优化的接种
- 将细胞培养基（本实验中为低浓度 NaHCO3（1.5 g/L）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基，含 10% (v/v) 胎牛血清（FBS）、1% (v/v) L-谷氨酰胺和 1% (v/v) 抗生素-抗真菌剂）和胰蛋白酶溶液在水浴中预热至 37 °C。
- 吸除并弃去 T25 细胞培养瓶中生长的 A735 细胞的培养液。该细胞系购自商业来源。
- 用 1 mL 胰蛋白酶溶液或 PBS 溶液洗涤培养瓶，以去除细胞上残留的培养基。
- 吸除并弃去胰蛋白酶或 PBS 溶液。
- 向培养瓶中加入 1 mL 胰蛋白酶溶液，于 37 °C 培养。使用倒置显微镜仔细观察细胞脱落情况。
- 当细胞脱落后，加入 3 mL 新鲜完全细胞培养基以终止胰蛋白酶活性，并用其冲洗培养瓶。
- 将细胞悬液从培养瓶转移至 15 mL 离心管中。
- 在室温（RT）下以 800 × g 离心 5 分钟。
- 吸除并弃去上清液。
- 用 1 mL 新鲜细胞培养基重悬细胞。
- 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数，以计算细胞密度。
- 在合适尺寸的培养皿中接种适量数量的细胞。
注意：本实验中，在 35 mm 培养皿中接种 4....
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结果
利用本方案，我们详细演示了使用玻璃圆筒法分离稳定转染的黑色素瘤细胞克隆的步骤（图1A）。我们的研究涉及黑色素瘤细胞生物学，最常用的研究模型是贴壁性强且高度侵袭性的A375黑色素瘤细胞系。由于我们的研究显示，与其他类型的癌症相比，黑色素瘤细胞高表达凝溶胶蛋白（GSN）14，因此我们正在探究该蛋白在黑色素瘤进展中的作用。GSN是一种肌动蛋白结合蛋白，在黑色素瘤细胞的运动性中发挥重要作用15。它由六个结构域组成，分子量根据其亚型不同为82–84 kDa16。GSN定位于细胞质、细胞核和质膜，并可在黑色素瘤细胞富含F-actin的结构中被发现8。
在本研究中，我们采用CRISPR/Cas9 (D10A) 技术使A375细胞完全缺失GSN表达8。向导RNA序列靶向蛋白的N端，从而敲除了GSN的所有.......
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讨论
我们已详细描述了使用玻璃圆筒分离稳定转染的黑色素瘤细胞克隆的方法。在获得基因表达改变的细胞克隆时，获得对照克隆至关重要，因为针对目标修饰克隆所获得的结果必须始终与对照克隆的结果进行比较。通过这种方式，我们可以验证实验结果是否受到转染操作本身或含选择性抗生素的培养条件的影响，而非其他因素（如引入的遗传修饰）所致。在规划细胞克隆制备时，有必要检查待测细胞系在目的蛋白（POI）表达上是否具有均一性。若存在POI表达异质性，而在获得对照克隆后该异质性不再保留（与A375细胞中GSN的表达情况相反，参见图2E），则在筛选过程中必须充分考虑这一因素。
与克隆实验相关的最常见问题是转染效率低下。在后续研究中，我们观察到，对于A375细胞系，与本方案中所述的24小时转染时间相比，在细胞接种后最长48小时进行转染，其转染效率更高。此外，建议测试多种转染试剂和方法，以选择最适合的一种，例如聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体转染试剂、电穿孔或病毒转染。另一个可调整以提高转染效率的因素是转染试剂与细胞共孵育的时间。转染试剂的存在可能导致细胞膜部分通透<.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作由波兰科学国家中心资助（项目编号 #2016/22/E/NZ3/00654，授予 AJM）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 ml 离心管 | GoogleLab Scientific | G66010522 | |
| 带 20 mm 网格的 150 mm 细胞培养皿 | Falcon | 353025 | |
| 24 孔板 | VWR International | 10062-896 | |
| 35 mm 培养皿 | Eppendorf | EP0030700112 | |
| 6 孔板 | Eppendorf | EP0030700113 | |
| 96 孔板 | VWR International | 10062-900 | |
| 80% 乙酸溶液 | Chempur | 115687330 | |
| 琼脂糖 | Prona-Abo | BLE500 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240062 | |
| 抗 GAPDH 抗体 | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-47724 | |
| 抗 GSN 抗体 - 克隆 C20 | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-6405 | |
| 抗 GSN 抗体 - 克隆 GS-2C4 | Sigma-Aldrich | G44896 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Color Taq PCR 预混液 (2x) | EurX | E2525 | |
| 对照双切口酶质粒 | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-437281 | |
| 盖玻片 | bionovo | 16283 | |
| Dako 封片剂 | Clontech | S3023 | |
| DMSO - 二甲基亚砜 | applichem | A3672,0250 | |
| DNA 纯化试剂盒 | EurX | 3555-02 | |
| 驴抗小鼠 Alexa Fluor 488 | Invitrogen | # A-21202 | |
| DTT - 1,4-二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | FD0274 | |
| EDTA - 乙二胺四乙酸 | Poch (Pol-Aura) | 593280117 | |
| EGTA - 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸’’-四乙酸 | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| FBS - 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| 肌动蛋白解聚因子 CRISPR 质粒 | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-401005-NIC | |
| 甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | L-4909 | |
| 高糖 Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基，NaHCO3 浓度降低 (1.5 g/l) | 波兰科学院，弗罗茨瓦夫 ，波兰 | 11-500 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030-024 | |
| 木质素 | Bionovo | B-0521 | |
| Lipofectamine 3000 转染试剂 | Invitrogen | L3000-008 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Na4P2O7 | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| NaF | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| NEBuilder 连接工具 | http://nebuilder.neb.com/#!/ | ||
| pACGFP-C1 | Clontech | ||
| PageRuler 预染蛋白 Marker | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
| Perfect 100 bp DNA Marker | EurX | E3134 | |
| 鬼笔环肽-Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 2 | Sigma-Aldrich | P5726 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| 聚乙烯亚胺 (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 嘌呤霉素 | InviviGen | ant-pr | |
| SDS - 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| 硅胶 | CX80 Polska | ||
| 氯化钠 - NaCl | Chempur | 7647-14-5 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | D6750259 | |
| 蔗糖 | Poch (Pol-Aura) | PA-06-772090110 | |
| 玻璃圆筒 | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | |
| 25 mL 组织培养瓶 | VWR International | 10062-868 | |
| 75 cm² 组织培养瓶 | VWR | 10062-872 | |
| Tris 碱 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 胰蛋白酶 | 波兰科学院，弗罗茨瓦夫，波兰 | 20-500 | |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | 8656 | |
| 二甲苯溶液 | Chempur | 115208603 |
参考文献
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Wurm, F. M.
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重印与许可
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