本文描述了一种使用玻璃圆筒分离稳定转染的黑色素瘤细胞克隆的实验方案。我们重点介绍可能对整个实验成功起决定性作用的实用操作建议。
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本文内容
摘要
摘要
基因组信息发生稳定改变的细胞群体被科学家广泛用作研究模型。这类细胞无需反复转染，因为重复转染可能导致细胞群体异质性以及转染效率不稳定，从而影响实验的可重复性。此外，它们更适用于大规模分析。稳定细胞克隆的建立在多种应用中具有重要价值，例如基因功能研究和重组蛋白的生产。在初始瞬时转染后，获得均一细胞群体的方法有多种。本文介绍使用玻璃环进行单细胞克隆分离的方法。尽管该方法已存在一段时间，但其中存在若干关键步骤，忽略这些步骤可能导致实验失败。我们已成功应用此方法获得稳定过表达目的蛋白（POI）或敲除目的基因（GOI）的细胞克隆。本文详细描述了若干准备步骤，包括筛选药物浓度的优化、玻璃环的制备，以及通过PCR、蛋白质印迹分析、免疫染色或基因组DNA测序（根据所获得克隆的类型而定）验证所获克隆是否实现了GOI表达的预期改变。我们还讨论了已建立的细胞系可能存在的表型异质性问题，因为这可能会影响稳定细胞克隆的获得。
引言
哺乳动物细胞的稳定转染是多种细胞培养应用中的常规方法，包括癌症研究。与瞬时转染相比，其优势在于所引入的外源遗传物质由于整合到宿主基因组中，不会因环境因素（例如细胞汇合度或复制阶段）和细胞分裂而丢失1。建立稳定表达的细胞系可能耗时且具有挑战性，但如果需要在较长时间内持续表达基因，则构建稳定细胞系是首选方案。转染最常见的目的是通过基因表达的过量产生或下调，来研究特定基因或基因产物的功能。然而，重组蛋白的生产以及基因治疗也需要将外源遗传物质导入细胞2。
克隆是指来源于单个细胞的细胞群体。在研究具有基因型和表型异质性的细胞时，分离单细胞克隆是细胞生物学中的关键步骤。目前主要有三种用于获得细胞克隆的技术：稀释法、克隆环法3和细胞分选法4。每种方法各有优缺点。本文详细描述了一种利用玻璃圆筒法分离黑色素瘤细胞克隆的方法。该方法的优点在于，即使来自低密度细胞培养物，细胞也能表现出适度的克隆生长能力。此外，所选细胞已具备增殖能力，因为它们已经形成了克隆5。该操作流程包括将转染后的细胞以较低密度（但非极限稀释）接种至大培养皿中，在含选择性抗生素的培养基中培养2-3周，使其扩展并形成克隆。随后，使用置于克隆上方并以硅脂固定于培养皿表面的玻璃圆筒将各个克隆分离。接着，用胰蛋白酶消化使细胞脱落，并转移至多孔板中，在选择性培养基中继续培养。
已有许多研究描述了克隆的分离方法，但我们重点关注展示一些关键细节，例如克隆在筛选两周后的理想大小、在分离过程中如何标记克隆的位置，以及如何选择合适的抗生素浓度用于筛选。我们着重提供可能决定整个实验成败的实用建议。本方案可在2至4周内获得稳定的细胞克隆。该方法简便、经济，且无需复杂的设备。我们分享了一种已成功用于建立多种研究模型的技术，包括GSN基因敲除（KO）克隆6,7,8。
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方案
1. 细胞传代与药物浓度优化的接种
- 将细胞培养基（本实验中为低浓度 NaHCO3（1.5 g/L）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基，含 10% (v/v) 胎牛血清（FBS）、1% (v/v) L-谷氨酰胺和 1% (v/v) 抗生素-抗真菌剂）和胰蛋白酶溶液在水浴中预热至 37 °C。
- 吸除并弃去 T25 细胞培养瓶中生长的 A735 细胞的培养液。该细胞系购自商业来源。
- 用 1 mL 胰蛋白酶溶液或 PBS 溶液洗涤培养瓶，以去除细胞上残留的培养基。
- 吸除并弃去胰蛋白酶或 PBS 溶液。
- 向培养瓶中加入 1 mL 胰蛋白酶溶液，于 37 °C 培养。使用倒置显微镜仔细观察细胞脱落情况。
- 当细胞脱落后，加入 3 mL 新鲜完全细胞培养基以终止胰蛋白酶活性，并用其冲洗培养瓶。
- 将细胞悬液从培养瓶转移至 15 mL 离心管中。
- 在室温（RT）下以 800 × g 离心 5 分钟。
- 吸除并弃去上清液。
- 用 1 mL 新鲜细胞培养基重悬细胞。
- 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数，以计算细胞密度。
- 在合适尺寸的培养皿中接种适量数量的细胞。
注意：本实验中，在 35 mm 培养皿中接种 450,000 个 A375 细胞，加入 2 mL 细胞培养基。
2. 选定药物浓度的优化
- 查找生产商推荐的药物浓度范围，用于筛选稳定的细胞克隆。
注意：通过遗传载体转染引入细胞的选择基因可使细胞对筛选药物产生抗性。本实验中使用浓度为 1 µg/mL 的嘌呤霉素作为筛选标记，以获得遗传载体的稳定表达并清除未转染的细胞。 - 将细胞接种至 96 孔板的各孔中，使次日细胞融合度达到 50%。每种药物浓度设置三个复孔，并设未处理对照组。每孔接种 10,000 个细胞。具体细胞数量取决于所使用的细胞系，需通过实验经验确定。
- 24 小时后，用完全培养基将药物按生产商推荐的最低至最高浓度配制 10 个梯度稀释液，并加入细胞中。
注意：本实验使用嘌呤霉素，浓度范围为 0–10 µg/mL。每 3 天或当培养基中观察到大量死亡细胞时，更换新鲜培养基。 - 连续一周每天观察细胞，记录其融合度、增殖情况和死亡情况，并与对照孔进行比较。
注意：合适的浓度应使细胞停止增殖，不会立即引起细胞死亡，但在 48–120 小时内杀死所有处理的细胞。然而，对于某些细胞系与药物的组合，可能不存在细胞停止增殖但不立即死亡的阶段。在此情况下，能够杀死全部细胞的最低药物浓度即为适合的筛选浓度。
3. 细胞接种与转染
- 将细胞接种至6孔板的一个孔中。
注意：细胞悬液在细胞培养基中的终体积应为2.5 mL。本实验中每孔接种450,000个细胞。细胞数量需根据经验确定，以确保接种48小时后细胞融合度不超过90%。 - 将细胞置于含5% CO2的湿润环境中，37 °C培养24小时。
注意：转染前细胞培养24小时。然而，接种48小时后观察到细胞转染效率更高。 - 吸除并弃去细胞上方的培养基。
- 用预热的无抗生素细胞培养基（含10% (v/v) 胎牛血清、添加谷氨酰胺的DMEM）替换已弃去的培养基。
注意：更换培养基的原因在于某些转染试剂会增加细胞通透性，导致抗生素更易进入细胞，从而引起细胞死亡。 - 用无抗生素和无血清的DMEM稀释转染试剂。可使用聚乙烯亚胺（PEI）、脂质类转染试剂或电穿孔法进行转染。若使用聚乙烯亚胺，针对4 µg DNA，采用浓度为2 mg/mL的PEI溶液，按1:2.175的质量比进行转染。
注意：在CRISPR/Cas9(D10A)系统中，作为DNA溶液使用了两种质粒的混合物，其gRNA序列分别为：5'ccgggccgtgcagcaccgtg3' 和 5'atccagctgcacggtaaaga3'。 - 将转染混合物在室温下孵育30分钟。
- 孵育结束后，小心地将转染混合物逐滴加入正在6孔板各孔中生长的细胞中。
- 将细胞置于含5% CO2的湿润环境中，37 °C继续培养2–6小时。
- 更换为完全细胞培养基。
- 将细胞置于含5% CO2的湿润环境中，37 °C继续培养24小时。
4. 细胞克隆的制备
- 按照方案第1节中的说明，将转染后的细胞用胰蛋白酶消化并转移至一个直径为150 mm、带有20 mm成型网格的培养皿中。
注意：由于细胞密度过高时会发生细胞相互融合，建议将细胞均匀地分装到两个细胞培养皿中。培养皿上的网格有助于定位克隆并追踪其迁移情况。在打印的培养皿示意图上，可随后标记克隆的位置（图1B）。此外，对于不能耐受培养基移除和暴露于空气（会导致死亡或不可逆损伤）的细胞，建议使用表面积更小的多个培养皿，以便从单个培养皿中分离较少的克隆。这可以缩短克隆分离过程中暴露于空气的时间，降低细胞脱水的风险。 - 将细胞在37 °C、含5% CO2的湿润环境中培养24小时。
- 更换细胞培养基为含有筛选抗生素的培养基。
注意：从此时起，必须在含有筛选抗生素的条件下培养细胞；否则，整合的外源基因有可能被切除。 - 每3天更换一次培养基，或在培养基中出现大量漂浮的死亡细胞时及时更换。
注意：本实验中，细胞使用浓度为1 µg/mL的嘌呤霉素进行孵育。克隆筛选步骤大约需要2周时间。应通过倒置显微镜观察克隆的生长情况来监测克隆形成，确保各克隆之间不发生过度生长和相互接触。单个克隆的细胞可能无法避免迁移到邻近克隆并与其共同生长。因此，必须观察培养皿中克隆细胞的迁移情况，并在培养皿示意图上记录相关信息。
5. 选择用于分离的克隆
- 在倒置显微镜下使用10倍或20倍物镜观察细胞培养皿中的细胞克隆。
注意：克隆通常由约500–30,000个细胞组成，但具体数量取决于所使用的细胞系。理想的克隆应与其他细胞克隆分离，且大小适中，因为过大或特别突出的克隆可能来源于多个细胞（图1B）。 - 通过仔细检查培养皿并在倒置显微镜下评估所发现的克隆，选择一个合适的克隆。将培养皿底部的标记器置于所选克隆对应的位置，同时在打印好的培养皿示意图上标记该克隆的位置（图1B）。
注意：应从培养皿中选择大约20–30个克隆。有时获得的细胞克隆数量较少，此时应分离所有可见的克隆。
6. 玻璃管的制备
- 在分离克隆之前，将玻璃圆柱体（直径 6.4 mm，高 8 mm）（图 1C）放入第一个玻璃培养皿中，并进行高压灭菌。
- 对第二个玻璃培养皿进行高压灭菌。
- 在第二个已高压灭菌的玻璃培养皿底部涂抹一层薄薄的硅脂。将培养皿置于超净工作台内，并用紫外光照射 30 分钟以灭菌硅脂。
注意：可选步骤为对硅脂进行高压灭菌。 - 将已高压灭菌的圆柱体浸入涂有硅脂的培养皿中。此时它们已准备好用于分离克隆。
- 分离克隆后，应根据所接触细胞材料的相关规定清洗圆柱体。若涉及基因修饰操作，需使用次氯酸钠进行灭菌。
- 用二甲苯浸泡圆柱体过夜，以彻底清除硅脂。
- 在通风橱中用去离子水冲洗圆柱体，以去除残留的二甲苯溶液。
- 将圆柱体置于纸巾上，使其自然干燥。
- 将干燥后的圆柱体存放于玻璃培养皿中。
- 下次使用前，从本手册第 1 步开始重新准备圆柱体。
7. 克隆的分离
- 在24孔板的每个孔中加入0.5 mL预热的完全细胞培养基。
- 用15 mL温热且无菌的PBS小心洗涤生长在150 mm培养皿上的转染细胞，共洗涤三次。小心吸除并弃去PBS。
- 使用无菌镊子将一侧涂有油脂的圆筒转移至培养皿底部，对已标记的克隆位置进行压印，从而在单细胞来源的克隆周围形成隔离的小培养区。
注意：圆筒应牢固贴附于培养皿底部，以防止液体泄漏。 - 向每个圆筒中加入50 µL胰蛋白酶溶液，孵育数分钟。注意避免酶对细胞造成损伤。逐个处理克隆，并记住每次更换移液器吸头，以防不同克隆之间交叉污染。
注意：孵育时间取决于所使用的细胞系，需通过实验经验确定。可反复吹打胰蛋白酶溶液以促进细胞脱落。使用倒置显微镜密切观察细胞脱落情况。细胞脱落后，向每个圆筒中加入50 µL细胞培养基以终止胰蛋白酶活性。 - 立即将100 µL细胞悬液转移至24孔板中某一孔的培养基内。
注意：此处克隆的培养继续使用浓度为0.5 µg/mL的选择性抗生素。 - 在24孔板中监测细胞克隆的生长情况，当细胞融合度达到90%时，将其转移至6孔板。参照实验方案第1节的操作步骤，仅调整胰蛋白酶（0.5 mL）和终止液（1.5 mL）的体积。
- 继续监测6孔板中细胞克隆的生长，当细胞达到完全融合时，将其转移至T12.5细胞培养瓶中。
- 观察T12.5细胞培养瓶中的细胞克隆，当细胞达到完全融合时，进行传代并采用适当方法（如自动细胞计数仪或血细胞计数板）进行细胞计数。将一半细胞冷冻保存于含70%完全培养基（含选择性抗生素）、20%（v/v）胎牛血清（FBS）和10%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）的冻存液中。将剩余细胞接种于盖玻片（12 mm × 12 mm）上用于免疫染色，并接种至6孔板的两个孔中用于基因组DNA提取和裂解液制备。
注意：对于A375细胞系，每张盖玻片接种45,000个细胞，每孔6孔板接种450,000个细胞。
8. 验证所获得的细胞克隆
- 免疫染色
注意：对细胞进行免疫染色以确定目的蛋白（POI）的表达水平。必须同时对野生型细胞或对照克隆进行染色，作为对照以便比较POI的表达水平（图2A）。- 吸除并弃去细胞培养基。
- 用PBS洗涤盖玻片上的细胞三次。
- 向每孔中加入0.5 mL 4%甲醛溶液以固定细胞，并在室温下孵育20分钟。
注意：不同抗体可能需要不同的固定方法。 - 用PBS洗涤细胞两次。
- 为透化细胞，将盖玻片置于含0.1% Triton X-100的PBS溶液中，在室温下孵育5分钟。
注意：不同抗体可能需要不同的透化方法。 - 用PBS洗涤盖玻片两次。
- 将盖玻片放入染色盒中9。
- 在室温下用含1% (w/v) BSA和0.1% (v/v) Triton X-100的PBS溶液封闭30分钟，以避免抗体的非特异性结合。
- 使用针和镊子将盖玻片边缘轻靠在滤纸上，吸除溶液。
- 配制含一抗的染色液（溶于含1% (w/v) BSA和0.1% (v/v) Triton X-100的PBS溶液中），每张盖玻片滴加30 µL，于4 °C湿盒中避光孵育24小时。
注意：本实验中使用鼠抗GSN抗体，稀释比例为1:200。 - 使用针和镊子将盖玻片边缘轻靠在滤纸上吸除溶液，然后将盖玻片转移至24孔板中。
- 在室温下用PBS洗涤盖玻片三次，每次5分钟。
- 配制含二抗和荧光染料的溶液（溶于含1% (w/v) BSA和0.1% (v/v) Triton X-100的PBS溶液中），每张盖玻片滴加30 µL，在室温下避光孵育1小时。
注意：使用稀释比例为1:200的驴抗鼠IgG荧光标记二抗（Alexa Fluor 488）。为检测F-肌动蛋白和细胞核，分别使用稀释比例为1:200的鬼笔环肽-Alexa Fluor 568和稀释比例为1:1000的Hoechst 33342。 - 使用针和镊子将盖玻片边缘轻靠在滤纸上吸除溶液，然后将盖玻片转移至24孔板中。
- 在室温下避光用PBS洗涤盖玻片三次，每次5分钟。
- 用去离子水洗涤盖玻片一次。
- 使用封片剂将盖玻片封固于显微镜载玻片上。
- 使用共聚焦显微镜观察细胞染色情况，以确定衍生克隆中POI的表达水平（图2A）。
- Western印迹分析
注意：为确认衍生克隆中POI表达缺失、升高或降低，应在标准条件下进行Western印迹分析10。同时分析野生型细胞或对照克隆（图2B、C）。- 用PBS洗涤六孔板中生长的细胞三次。
- 使用细胞刮收集细胞至所选裂解缓冲液中，轻轻涡旋20秒。对样品进行三次冻融循环（-80 °C冷冻，4 °C解冻）。
注意：可使用细胞骨架结合蛋白提取缓冲液 [10 mM Tris-HCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 20 mM Na4P2O7, 2 mM Na3VO4, 1% (v/v) Triton X-100, 10% (v/v) 甘油, 0.1% (w/v) SDS, 0.5% 脱氧胆酸钠] 或尿素缓冲液 [50 mM TRIS-HCl pH 7, 5% (w/v) SDS, 8.6% (w/v) 蔗糖, 74 mM 尿素, 1 mM DTT]，两者均需添加1:100蛋白酶抑制剂混合物、1:100丝氨酸磷酸酶抑制剂和1:100酪氨酸磷酸酶抑制剂。 - 在4 °C下以12,000 x g 离心裂解物5分钟。
- 测定样品中的蛋白浓度（例如通过BCA法）。
注意：所用测定方法需与缓冲液成分兼容。 - 进行Western印迹分析时，将30 µg蛋白样品加入每道的聚丙烯酰胺凝胶（7%-15%）中。
- 进行SDS-PAGE电泳，并将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。
- 使用合适的抗体对膜进行染色，以检测POI的表达水平（图2B、C）。
注意：使用稀释比例为1:2000的鼠抗GSN抗体和稀释比例为1:200的鼠抗GAPDH抗体。详见我们的论文2,11。曝光时间应足够长，以避免遗漏微弱信号（图2C）。
- 基因组DNA分析
注意：在通过显微镜观察和Western印迹技术评估衍生克隆中POI表达水平后，应进行基因组DNA分析。通过比较在克隆gDNA模板上获得的PCR产物长度，可判断目的基因（GOI）序列是否已被编辑（图2D）。- 用PBS洗涤六孔板中生长的细胞三次。
- 使用细胞刮将细胞收集至1 mL PBS中。
- 在4 °C下以5000 x g 离心细胞5分钟。
- 吸除并弃去上清液。
注意：细胞沉淀可在-80 °C保存数月。 - 使用市售gDNA提取试剂盒从衍生克隆的细胞沉淀中提取gDNA。
- 设计PCR引物，使其退火位点位于CRISPR/Cas9基因编辑位点的gRNA靶序列上下游至少300 bp处。
注意：本实验使用以下引物：Fwd: 5'gtgcagccaggatgagag3'，Rev: 5'ccctgttactggtgcatc3'。 - 根据制造商说明，使用DNA聚合酶预混液进行PCR反应。
注意：PCR反应体系组成见表1，PCR扩增程序见表2。 - 在含Tris-乙酸-EDTA缓冲液（40 mM Tris pH 8.0, 20 mM 乙酸, 1 mM EDTA）的1%或2% (w/v) 琼脂糖凝胶中分析PCR产物。
- 将GSN基因敲除（KO）克隆的PCR扩增片段长度与对照（CTRL）KO克隆的PCR产物长度进行比较（203 bp；图2D）。
- 基因组DNA测序
- 设计PCR引物，使其退火位点位于CRISPR/Cas9(D10A)质粒编码的gRNA识别序列的上下游。
注意：引物设计如下：Fwd: 5'gatctcgagctcaagcttcgaattctgaacagtgcagacctttg3'，Rev: 5'cgcggtaccgtcgactgcagaattcaattcaccagaacaggactaggc3'。 - 以高保真DNA聚合酶（此类分析要求DNA扩增具有高准确性）和gDNA为模板进行PCR扩增。
注意：PCR反应体系组成见表3，PCR扩增程序见表4。 - 使用限制性内切酶在多克隆位点处线性化质粒，37°C孵育1小时。
注意：限制性酶切反应体系组成见表5。所用质粒类型无关紧要。本实验中pACGFP-C1质粒使用EcoRI酶进行线性化。 - 通过琼脂糖凝胶电泳估算插入片段和切割后质粒的浓度。
- 准备DNA连接反应。
注意：可使用传统克隆方法或其他任何方法。 - 转化感受态细菌（例如通过热激法）12。
- 提取质粒（例如根据制造商说明或引用的方案，从每个构建体中选取六个菌落进行质粒提取）13。
- 通过限制性酶切和DNA电泳检测插入片段是否成功克隆至质粒中，并确认其长度是否正确。
注意：若所选菌落不含带插入片段的质粒，应从后续细菌菌落中继续提取质粒。 - 通过质粒测序确认基因编辑结果（图3）。
注意：由于基因存在两个等位基因，应对每个衍生细胞克隆至少获得两个不同的DNA测序结果。对于多倍体细胞系（染色体数大于2n），需测序更多质粒以获得细胞中所有基因拷贝的序列。应分离足够数量的菌落，直至获得包含所有基因拷贝序列的克隆质粒。可使用市售试剂盒估算目标基因的基因座数量。 - 使用多序列比对程序比较GSN KO克隆和CTRL KO克隆的gDNA序列（图3）。
- 设计PCR引物，使其退火位点位于CRISPR/Cas9(D10A)质粒编码的gRNA识别序列的上下游。
| 试剂 | 体积 |
| DNA聚合酶预混液 | 7.5 µl |
| 正向引物（10 μM） | 1.5 µl |
| 反向引物（10 μM） | 1.5 µl |
| 无菌水 | 3.5 µl |
| gDNA | 1 µl（含10 ng gDNA） |
表1. PCR反应体系的组成。
| 步骤 | 温度 [°C] | 时间 [分钟:秒] |
| 1 | 95 | 04:00 |
| 2 | 95 | 00:30 |
| 3 | 57 | 00:30 |
| 4 | 72 | 00:45 |
| 5 | 返回步骤2，重复35次 | X |
| 6 | 72 | 10:00 |
| 7 | 8 | ∞ |
表2. PCR反应的PCR仪设置。
| 试剂 | 体积 |
| 5 x 高保真DNA聚合酶缓冲液 | 4 µl |
| dNTPs (10 mM) | 0.4 µl |
| 正向引物 (10 μM) | 1 µl |
| 反向引物 (10 μM) | 1 µl |
| 无菌水 | 12.4 µl |
| gDNA | 1 µl（含10 ng gDNA） |
| 高保真DNA聚合酶 | 0.2 µl |
表3. PCR反应体系的组成。
| 步骤 | 温度 [°C] | 时间 [分钟:秒] |
| 1 | 98 | 00:30 |
| 2 | 98 | 00:30 |
| 3 | 61 | 00:30 |
| 4 | 72 | 01:00 |
| 5 | 返回步骤 2，重复 35 次 | X |
| 6 | 72 | 10:00 |
| 7 | 8 | ∞ |
表4. PCR反应的PCR仪设置。
| 试剂 | 用量 |
| 10 x 缓冲液 | 3 μl |
| 限制性内切酶 | 1 μl |
| 无菌水 | 20.7 μl |
| 质粒 | 5.3 μl（含 5 μg DNA） |
表5. 限制性消化反应体系的组成。
9. 评估细胞系的表型异质性
- 对细胞进行免疫染色，以确定目的蛋白（POI）的表达水平。
- 使用共聚焦显微镜配备的60倍油镜，以无放大倍率的方式拍摄照片。
- 为确定不同表达水平细胞的分布比例，使用大多数显微图像分析软件中通常提供的"过曝光/欠曝光"工具。将存在欠曝光区域的细胞归类为POI低水平表达细胞；将过曝光的细胞归类为POI高水平表达细胞，其余细胞则归类为POI中等水平表达细胞。
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结果
利用本方案，我们详细演示了使用玻璃圆筒法分离稳定转染的黑色素瘤细胞克隆的步骤（图1A）。我们的研究涉及黑色素瘤细胞生物学，最常用的研究模型是贴壁性强且高度侵袭性的A375黑色素瘤细胞系。由于我们的研究显示，与其他类型的癌症相比，黑色素瘤细胞高表达凝溶胶蛋白（GSN）14，因此我们正在探究该蛋白在黑色素瘤进展中的作用。GSN是一种肌动蛋白结合蛋白，在黑色素瘤细胞的运动性中发挥重要作用15。它由六个结构域组成，分子量根据其亚型不同为82–84 kDa16。GSN定位于细胞质、细胞核和质膜，并可在黑色素瘤细胞富含F-actin的结构中被发现8。
在本研究中，我们采用CRISPR/Cas9 (D10A) 技术使A375细胞完全缺失GSN表达8。向导RNA序列靶向蛋白的N端，从而敲除了GSN的所有...
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讨论
我们已详细描述了使用玻璃圆筒分离稳定转染的黑色素瘤细胞克隆的方法。在获得基因表达改变的细胞克隆时，获得对照克隆至关重要，因为针对目标修饰克隆所获得的结果必须始终与对照克隆的结果进行比较。通过这种方式，我们可以验证实验结果是否受到转染操作本身或含选择性抗生素的培养条件的影响，而非其他因素（如引入的遗传修饰）所致。在规划细胞克隆制备时，有必要检查待测细胞系在目的蛋白（POI）表达上是否具有均一性。若存在POI表达异质性，而在获得对照克隆后该异质性不再保留（与A375细胞中GSN的表达情况相反，参见图2E），则在筛选过程中必须充分考虑这一因素。
与克隆实验相关的最常见问题是转染效率低下。在后续研究中，我们观察到，对于A375细胞系，与本方案中所述的24小时转染时间相比，在细胞接种后最长48小时进行转染，其转染效率更高。此外，建议测试多种转染试剂和方法，以选择最适合的一种，例如聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体转染试剂、电穿孔或病毒转染。另一个可调整以提高转染效率的因素是转染试剂与细胞共孵育的时间。转染试剂的存在可能导致细胞膜部分通透<...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作由波兰科学国家中心资助（项目编号 #2016/22/E/NZ3/00654，授予 AJM）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 ml 离心管 | GoogleLab Scientific | G66010522 | |
| 带 20 mm 网格的 150 mm 细胞培养皿 | Falcon | 353025 | |
| 24 孔板 | VWR International | 10062-896 | |
| 35 mm 培养皿 | Eppendorf | EP0030700112 | |
| 6 孔板 | Eppendorf | EP0030700113 | |
| 96 孔板 | VWR International | 10062-900 | |
| 80% 乙酸溶液 | Chempur | 115687330 | |
| 琼脂糖 | Prona-Abo | BLE500 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240062 | |
| 抗 GAPDH 抗体 | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-47724 | |
| 抗 GSN 抗体 - 克隆 C20 | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-6405 | |
| 抗 GSN 抗体 - 克隆 GS-2C4 | Sigma-Aldrich | G44896 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Color Taq PCR 预混液 (2x) | EurX | E2525 | |
| 对照双切口酶质粒 | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-437281 | |
| 盖玻片 | bionovo | 16283 | |
| Dako 封片剂 | Clontech | S3023 | |
| DMSO - 二甲基亚砜 | applichem | A3672,0250 | |
| DNA 纯化试剂盒 | EurX | 3555-02 | |
| 驴抗小鼠 Alexa Fluor 488 | Invitrogen | # A-21202 | |
| DTT - 1,4-二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | FD0274 | |
| EDTA - 乙二胺四乙酸 | Poch (Pol-Aura) | 593280117 | |
| EGTA - 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸’’-四乙酸 | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| FBS - 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| 肌动蛋白解聚因子 CRISPR 质粒 | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-401005-NIC | |
| 甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | L-4909 | |
| 高糖 Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基，NaHCO3 浓度降低 (1.5 g/l) | 波兰科学院，弗罗茨瓦夫 ，波兰 | 11-500 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030-024 | |
| 木质素 | Bionovo | B-0521 | |
| Lipofectamine 3000 转染试剂 | Invitrogen | L3000-008 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Na4P2O7 | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| NaF | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| NEBuilder 连接工具 | http://nebuilder.neb.com/#!/ | ||
| pACGFP-C1 | Clontech | ||
| PageRuler 预染蛋白 Marker | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
| Perfect 100 bp DNA Marker | EurX | E3134 | |
| 鬼笔环肽-Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 2 | Sigma-Aldrich | P5726 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| 聚乙烯亚胺 (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 嘌呤霉素 | InviviGen | ant-pr | |
| SDS - 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| 硅胶 | CX80 Polska | ||
| 氯化钠 - NaCl | Chempur | 7647-14-5 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | D6750259 | |
| 蔗糖 | Poch (Pol-Aura) | PA-06-772090110 | |
| 玻璃圆筒 | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | |
| 25 mL 组织培养瓶 | VWR International | 10062-868 | |
| 75 cm² 组织培养瓶 | VWR | 10062-872 | |
| Tris 碱 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 胰蛋白酶 | 波兰科学院，弗罗茨瓦夫，波兰 | 20-500 | |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | 8656 | |
| 二甲苯溶液 | Chempur | 115208603 |
参考文献
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