本文介绍了利用诱导剂梯度平板评估细菌群集运动能力，同时获得多个浓度响应的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
细菌群集运动是一种常见的微生物表型，细菌群体借此在半固体表面迁移。在诱导群集运动的研究中，需使用特定浓度 诱导剂的浓度可能无法报告物种产生理想反应所需的最佳浓度范围内的事件。通常使用含有多种浓度的半固体平板来研究诱导剂浓度范围内的反应。然而，由于凝固时间不均匀，分别制备的半固体平板会增加各平板间培养基黏度和水分含量的变异。
本文介绍了一种单步方法，可在单一梯度平板上同时检测表面群集运动能力，其中等距排列的测试孔允许同步获取多浓度响应结果。在本研究中，评估了大肠杆菌K12（Escherichia coli K12）和铜绿假单胞菌PAO1（Pseudomonas aeruginosa PAO1）在白藜芦醇和阿拉伯糖等诱导剂浓度梯度下的表面群集运动行为。通过成像系统定期记录群集形态，以捕捉整个表面群集运动过程。
利用ImageJ软件对群集形态进行定量测量，获得可分析的群集面积信息。本文介绍了一种简单的梯度群集平板方法，可提供关于诱导物对表面群集运动影响的定性和定量信息，该方法可进一步扩展应用于研究其他诱导物对更广泛运动性细菌物种的影响。
引言
细菌群集运动是指细菌细胞在物质表面进行的集体迁移。除了在实验室中特别制备的半固体琼脂平板外1，这种表型也可在某些柔软基质上观察到，例如动物组织2、水合表面3和植物根部4。尽管半固体表面被认为是细菌群集运动的基本条件之一，但某些菌种还需要富含能量的培养基来支持其群集运动能力5。鞭毛的旋转驱动了游动和群集两种运动方式：游动是指单个细胞在液体环境中的运动，而群集则是指微生物群体在半固体表面上的同步移动。
底物黏度影响细菌运动性；对病原微生物（如 幽门螺杆菌, 研究表明，该病原体的运动能力会随着黏蛋白层黏度的变化而改变，而黏蛋白层的黏度受人体宿主内环境酸化的影响6为了模拟这些环境，早期研究通过使用高于0.3%（w/v）的琼脂浓度来限制细菌的游动运动，从而促使其逐渐转变为表面群集运动。当琼脂浓度高于1%（w/v）时，则会抑制多种细菌的群集运动能力。7菌落在表面形成的图案多种多样，包括无特征的菌膜8，靶心9，树突
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 梯度群游平板的制备
- 群游培养基的制备
注意：不同培养基黏度的简要比较见讨论部分；本方案中使用0.7% (w/v) 琼脂浓度的群游培养基。- 在两个锥形瓶中分别配制含琼脂的LB（Lysogeny broth）粉末；每个锥形瓶含2 g胰蛋白胨、2 g氯化钠、1 g酵母提取物和1.4 g琼脂。加入重蒸水（ddH2O），并用磁力搅拌子搅拌悬浮液。通过添加额外的ddH2O将最终体积调至200 mL。
- 在121 °C条件下高压灭菌20分钟。使用透气瓶盖或带通气孔的封口膜。
注意：琼脂在高压灭菌加热过程中会溶解。 - 当温度降至65 °C时，混匀溶液以确保均匀性，并将培养基转移至65 °C的培养箱或水浴中短期使用。
- 底层群游培养基的制备
注意：底层培养基是群游培养基与诱导剂储备液的混合物。诱导剂梯度群游平板的配方见表1。- 将114.12 mg冻干白藜芦醇粉末溶于5 mL二甲基亚砜（DMSO）中，配制100 mM白藜芦醇储备液，并将溶液储存在-20 °C。
- 将6 g阿拉伯糖粉末溶于30 mL ddH2O中，配制20% (w/v) 阿拉伯糖储备液；静置10–15分钟使阿拉伯糖完全溶解；溶液室....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
制备梯度泳动平板、接种及培养的工作流程如图1B所示。为制备梯度泳动平板，首先将底层培养基倾注至倾斜约4.3°（相对于水平面）的培养皿中（补充图S3），待底层完全凝固后，再倾注上层培养基。双层培养基的组成见Table 1。随后，将过夜培养的细菌培养物用移液器接种至检测孔中，并在37 °C下培养，同时维持适当的湿度。一个梯度泳动平板中可设置多个测试浓度，每个浓度设两到三个重复（图1C）。检测位点处带有柱状凸起的盖板的3D打印模型替代方案见Supplemental Figure S1。
在阿拉伯糖梯度平板上测试了两种基因工程菌株：E. coli K12-YdeH 和 P. aeruginosa PAO1-YdeH。图2A展示了五个孔中的表面群集运动测试，相邻孔之间出现重叠。每.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在半固体梯度平板上研究细菌的群集运动能力是一项具有挑战性的任务18,19,20，因为它涉及多个因素，如基质黏度、湿度和培养基成分。在这些因素中，琼脂浓度在决定微生物是进行游动还是群集运动方面起着决定性作用。当琼脂浓度从0.3%（w/v）增加到1%（w/v）时，细菌的游动运动将受到限制，并逐渐转变为表面群集运动；而当琼脂浓度超过1%（w/v）时，则会抑制游动和群集两种运动方式7。根据预实验结果，琼脂浓度固定为0.7%（w/v），因为其表现优于其他浓度。
该琼脂浓度此前也已被用于研究微生物趋化性21。降低琼脂浓度会导致菌群迁移区域增大，并引起相邻孔之间的重叠，从而因边界划分不清晰而增加菌群迁移面积定量的难度。相对较高的琼脂浓度则导致较小的菌群迁移区域，减少重叠的可能性。然而，过高的琼脂浓度（>1.0.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
该技术的开发得到了中国科学技术部国家重点研发计划资金的支持&D 计划（2018YFA0902604）、国家自然科学基金国际青年科学家研究基金（22050410270）以及深圳先进技术研究院外部基金（DWKF20190001）。我们谨向陈欣怡女士致以诚挚的谢意，感谢她在文档校对和实验室管理方面提供的帮助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| 氨苄青霉素 | Solarbio | A8180 | 25 g，≥ 85% (GC) |
| 离心管 | Corning | 430790 | 15 mL |
| 冻存管 | Corning | 430488 | 2 mL |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Aladdin | D103272 | 分析纯，> 99% (GC) |
| L(+)-阿拉伯糖 | Aladdin | A106195 | 98% (GC)，500 g |
| 培养皿 | Bkman | B-SLPYM90-15 | 塑料培养皿，圆形，90 mm × 15 mm |
| 白藜芦醇 | Aladdin | R107315 | 99% (GC)，25 g |
| 氯化钠 | Macklin | S805275 | 分析纯，99.5% (GC)，500 g |
| 方形培养皿 | Bkman | B-SLPYM130F | 塑料培养皿，方形，13 mm × 13 mm |
| 胰蛋白胨 | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| 酵母提取物 | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| 仪器设备 | |||
| 生化培养箱 | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi 成像系统 | Tanon | 5200CE | |
| 恒温水浴锅 | Jinghong | DK-S28 |
参考文献
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338(2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
