量化诱导剂梯度板上细菌表面聚集运动

Summary

在这里，我们描述了使用诱导剂梯度板来评估细菌聚集运动，同时获得多种浓度响应。

Abstract

细菌聚集运动是一种常见的微生物表型，细菌群落用它来在半固体表面上迁移。在诱导聚集运动的研究中，诱导剂的特定浓度可能无法报告在最佳浓度范围内发生的事件，以引起物种的所需反应。含有多种浓度的半固体板通常用于研究诱导剂浓度范围内的反应。然而，由于不均匀的凝固时间，单独的半固体板会增加每个板内介质粘度和水分含量的变化。

本文描述了一种在单个梯度板上同时测试表面聚集运动的一步法，其中等距排列的测试孔允许同时采集多重度响应。在目前的工作中，评估了 大肠 杆菌K12和 铜绿假单胞菌 PAO1的表面聚集，以响应白藜芦醇和阿拉伯糖等诱导剂的浓度梯度。定期使用成像系统对群体形态进行成像，以捕获整个表面集群过程。

使用ImageJ软件获取了群体形态的定量测量，提供了群体区域的可分析信息。本文提出了一种简单的梯度群板方法，该方法提供了诱导剂对表面聚集的影响的定性和定量信息，可以扩展到研究其他诱导剂对更广泛的运动细菌物种的影响。

Introduction

细菌聚集运动是指细菌细胞在物质表面的集体迁移。除了在实验室中专门制备的半固体琼脂平板¹外，在一些软基质上也观察到这种表型，例如动物组织²，水合表面³和植物根⁴。虽然半固体表面被认为是细菌聚集的基本条件之一，但一些物种也需要富含能量的培养基来支持它们的聚集运动⁵。鞭毛旋转为游泳和聚集运动提供动力 - 游泳描述了液体环境中的单细胞运动，而聚集是微生物种群在半固体表面上的同步运动。

底物粘度影响细菌运动;对致病微生物（如 幽门螺杆菌）的研究表明，病原体的运动性根据粘蛋白层粘度而变化，这受到人类宿主中环境酸化的影响⁶。为了复制这些环境，早期使用琼脂浓度高于0.3%（w / v）的研究限制了细菌游泳运动，以逐渐转变为表面聚集。使用高于1%（w / v）的琼脂浓度可以防止许多物种的聚集运动⁷。在表面上形成的蚁群模式是多种多样的，包括无特征的垫子⁸，牛眼⁹，树突¹⁰和涡旋¹¹。

虽然这些模式的相关性尚不清楚，但这些模式似乎取决于环境和化学线索¹²。环境线索涵盖不同的方面，包括温度、盐度、光照和pH值，而化学线索包括微生物群体感应分子、生化副产物和营养物质的存在。自动诱导群体传感信号分子，如AHL（N-己酰-L高丝氨酸内酯）可以通过调节表面活性剂的产生来影响表面聚集^13，14。白藜芦醇是一种植物抗毒素化合物，可以限制细菌聚集的运动¹⁵.

本文研究了白藜芦醇梯度浓度对野生型 大肠 杆菌K12菌株的影响，并研究了工程 大肠 杆菌K12-YdeH和 铜绿假单胞菌 PAO1-YdeH物种的阿拉伯糖诱导群运动。阿拉伯糖通过 araBAD 启动子诱导YdeH酶的产生，导致细胞c-di-GMP扰动并影响细菌群运动^16，17。使用阿拉伯糖梯度群板与 大肠杆菌 K12-YdeH和 铜绿假单胞 菌PAO1-YdeH菌株研究这种诱导的群体行为。

梯度群板通过连续固化双层介质制备（图1B）。底层包括与诱导剂一起加入的培养基，倒在支撑的培养皿的一侧。在底层固化后，培养皿返回到平坦的表面，其中含有没有诱导剂的介质的上层从板的另一侧加入。在群板完全固化后，通过按照固定布局在群板上钻孔（图1C）或通过在介质固化过程中使用包含销子的板盖的3D打印模型印印孔来产生等距排列的保持井（补充图S1）。凝胶成像系统用于捕获不同时间点的聚集形态（图2）。使用ImageJ软件分析表面群（补充图S2）提供了表面聚集过程的定量结果（图3）。

因此，我们提出了一种简单的方法来测试诱导剂浓度范围内的表面聚集运动。该方法可用于通过将诱导剂混合到底层培养基中来测试其他诱导剂的多种浓度反应，并且可以应用于其他活动物种（例如， 枯草芽孢杆菌， 肠沙门氏菌， 奇异变形杆菌， 肠溶性耶尔森菌）。这种方法可以为筛选单一化学诱导剂提供可靠的定性和定量结果，并且可以使用单独的板来评估更多的化学诱导剂。

Protocol

1. 梯度群板的制备

1. 蜂群培养基的制备
   注:有关不同介质粘度的简要比较，请参阅讨论部分;该协议中使用了0.7%（w / v）琼脂浓度的群体培养基。
   1. 在两个锥形烧瓶中用琼脂制备溶菌汤（LB）粉末;每个烧瓶含有2克色蛋白酮，2克氯化钠，1克酵母提取物和1.4克琼脂。加入双蒸馏水（ddH ₂ O），并使用磁力搅拌棒搅拌悬浮液。通过添加额外的ddH2 O将最终体积调节至₂₀₀ mL。
   2. 将溶液在121°C高压灭菌20分钟。使用透气盖或带通风口的瓶子密封膜。
      注意:琼脂在高压灭菌器中加热时会溶解。
   3. 当温度降至65°C时，混合溶液以确保均匀性，并将培养基转移到65°C的培养箱或水浴中供短期使用。
2. 底层群介质的制备
   注:底层培养基是群体培养基和诱导剂储备溶液的混合物。诱导剂梯度群板的配方如 表1所示。
   1. 通过将114.12mg冻干白藜芦醇粉末溶解到5mL二甲基亚砜（DMSO）中来制备100mM白藜芦醇储备溶液，并将溶液储存在-20°C。
   2. 通过将6g阿拉伯糖粉末溶解在30mL的ddH ₂ O中来制备20%（w / v）阿拉伯糖储备溶液;等待10-15分钟，让阿拉伯糖溶解;并将溶液储存在室温下。
   3. 从65°C培养箱中取出培养基并将其置于室温下;让群体培养基冷却，直到锥形瓶冷却到足以保持（〜50°C）。不要将群体培养基长时间置于室温下，因为这会导致琼脂凝固。
   4. 在50°C下将所需体积的诱导剂储备溶液加入蜂群培养基中（表1）。使用移液器分配诱导剂溶液，而不是倒入。轻轻旋转，将诱导剂与群体培养基混合。
      注意:此步骤适用于无法高压灭菌的诱导剂。注意不要将气泡引入培养基中。
3. 双层梯度群板的制备
   注:上层培养基为含有0.7%（w/v）琼脂的LB培养基。
   1. 用诱导剂名称和菌株标记13 x 13厘米见方的培养皿，并将培养皿支撑在盖子的边缘（图1B）。
   2. 使用 50 mL 移液器或 50 mL 离心管加入 40 mL 温的底层培养基 （50 °C）。
      注意:或者，对于13 x 13厘米见方的培养皿，40 mL底层和上层培养基是合适的;对于 10 x 10 cm 见方的培养皿，25 mL 底层和上层培养基是合适的。
   3. 让底层介质在层流罩内裸露固化1小时。请勿在培养基凝固时打扰方形培养皿。
      注意:在固化底层时，不应含有诱导剂的群培养基应保持在65°C培养箱或水浴中。
   4. 一旦底层完全凝固，取下盖子并将方形培养皿放在层流罩内。
   5. 使用50 mL移液器或50 mL离心管加入40 mL温热的上层培养基（50°C）。
      注意:上层培养基不含诱导剂。
   6. 将台面上的双层板覆盖且不受干扰地固化1小时。将准备好的板在4°C下储存长达24小时。
      注意:较长的固化时间会降低水分含量并限制蜂群运动。

2. 大肠杆菌 K12和 铜绿假单胞菌 PAO1的生长

1. 将5克色蛋白酮，5克NaCl和2.5克酵母提取物加入ddH2 O中，准备500毫升LB培养基，并将溶液加满至500毫升。将溶液在121°C下以液体循环高压灭菌20分钟，并将其储存在4°C。
2. 将100 mL 1.5%（w / v）LB琼脂培养基加入1g色蛋白酶，1gNaCl，0.5g酵母提取物和1.5g琼脂加入_dh2 O中，并将溶液加满至100mL。将溶液在121°C的液体循环中高压灭菌20分钟。 将培养基转移到50°C水浴中以防止琼脂凝固。
3. 当 LB 琼脂培养基烧瓶握持舒适时，使用 25 mL 移液器将 20 mL LB 琼脂培养基加入培养皿（直径 10 厘米）中。将平板在室温下过夜，并将LB-琼脂平板储存在4°C。
4. 使用一次性接种环在LB-琼脂培养皿上储存在-80°C，条纹大肠杆菌K12，大肠杆菌K12-YdeH，铜绿假单胞菌PAO1和铜绿假单胞菌PAO1-YdeH菌株的库存培养物。将培养皿倒置在37°C下孵育过夜。
5. 从培养皿中为不同的菌株选择单个菌落，将每个菌落接种到5mLLB培养基中，并在37°C下在220rpm设置的实验室轨道振荡器中孵育培养物。
6. 当培养密度达到OD _600nm 〜1.0时，从振荡器中取出培养物并将其置于室温下。将培养密度调节至OD _600nm = 1.0，如步骤3.2.1中所述。

3. 梯度群板的接种和孵育

1. 接种井的制备
   注意:可以使用能够生成由标准距离分隔的井的3D打印覆盖模型，而不是下面描述的方法（补充图S1）。
   1. 在 图1C所示的A4纸上标记井位。在一个方形培养皿中设置三个测试浓度，并重复两个或三个重复。
   2. 将标记的A4纸放在凝固的梯度板下。将100 μL移液器吸头的较宽侧推入半固体介质表面的标记位置。按压移液器吸头，直到其到达上层介质的底部。
   3. 当尖端接触底部时，不要对尖端施加垂直力;轻轻旋转尖端以隔离圆柱形孔的内容物。
   4. 沿非常小的距离水平移动移液器吸头，以使气流进入放在一边的狭窄位置。用食指按压吸头以阻挡吸头内部的气流，同时使用拇指和中指握住移液器。
   5. 垂直拉出尖端，在将其拉出时将孔内容物保持在尖端中。
      注意:如果孔内容物打滑，请用食指稍微加大一点压力，以完全密封尖端。
   6. 在每个标记位置重复步骤 3.1.2 到 3.1.5。接种前盖住蜂群板。
2. 梯度板接种和孵育
   1. 将过夜生长培养密度调节至OD _600nm = 1.0。
   2. 将80μL过夜生长培养物移入每个孔中。不要将细菌培养物溢出孔外。
   3. 用密封膜包裹板。对于长期观察（3-5天），用无菌实验室橡胶胶带包裹板。
      注:橡胶胶带不易断裂。
   4. 将充满ddH ₂ O的烧杯放入培养箱中，以保持培养箱内的湿度。在37°C下孵育梯度群板。
      注意:不要将蜂群板倒置孵育;这将导致细菌培养物从孔中泄漏。
   5. 接种后立即对蜂群板进行成像，并将其记录为 0小时 时间点。

4. 成像细菌表面聚集

1. 每12小时从培养箱中取出蜂群板，一次一个，水平握住板，并将它们放入凝胶成像系统中（见 材料表）。
   注意:不要在板表面留下指纹;用干净的手套握住蜂群板的侧面。
2. 选择 凝胶成像 模式;将蜂群板暴露在白光下;并调整焦距以提供最清晰的群体视图。
   注意:对给定批次中的所有板使用相同的焦距。
3. 通过将 曝光时间 调整为 300毫秒，增强群的亮度以进行清晰的观察。调整 阈值 以最大程度地减少来自背景光的干扰。
   注:阈值在凝胶成像系统的操作界面上调整。增加左侧的值以尽量减少背景光的干扰;减少右侧的值以增强群的亮度。在此协议中，该区域通常在 6，000 和 50，000 之间。
4. 保存图像文件以供进一步分析。在 .txt 文件中记录成像时间、诱导剂类型、梯度方向和菌株。

5. 使用 ImageJ 软件量化蜂群区域

1. 导入使用凝胶成像系统采集的图像文件。
2. 使用 ImageJ 软件设置比例尺，并将其应用于所有图像。
   1. 通过单击线工具创建标记电路板长度的线段。
   2. 单击 "分析|设置比例 以打开 "设置比例 "窗口。
   3. 在"已知距离"和"长度单位"中键入实际长度。
      注意:由于本作品使用了13 x 13厘米见方的培养皿，因此实际长度为"130"，长度单位为"mm"。
   4. 选中 全局 框。
   5. 通过单击"分析|"插入比例尺工具|比例尺，键入宽度（毫米）、高度（像素）、字体大小，然后从下拉菜单中选择颜色、背景和位置。或者，通过勾选复选框选择粗体文本、隐藏文本、衬线字体和叠加。
      注意:这些参数的选择由用户和图像的属性决定。在此协议中， "宽度（mm）" 设置为 25， "高度（以像素为单位 ）"设置为 20， "字体大小" 设置为 80，并通过选择" 位置"将比例尺放置在右下角|右下角。其他参数可由用户选择。
3. 单击" 进程|阴影 可增强图像的清晰度，尤其是边界（补充图S2A）。单击" 进程|批处理 以处理图像。
   注:此步骤的目的是提供更精确的边界划分。
   1. 通过单击"处理|"将图像作为参考 进行处理阴影|南。
   2. 单击" 进程|批次|宏 以打开" 批处理" 窗口。查找窗口中显示的以下命令:
      run（"South"）;
      run（"Save"）;
      关闭（）;
   3. 键入原始图像的文件夹地址和输出文件地址，方法是单击"批处理"窗口中的"处理"。
      注意:建议将带有阴影的图像导出到另一个文件夹，并保留原始图像的副本。
4. 使用 魔杖（追踪）工具 单独选择群并调整容差（双击 魔杖（追踪）工具 ），直到生成的线正确拟合群边界（附图 S2B）。
   注意:首先，单击" 魔杖（跟踪）"工具 ，然后在一个图像上选择一个群。如果边界描绘不正确，请双击 "棒（追踪）"工具 以打开" 棒工具 "窗口，可在其中调整 容差 。
5. 单击 "分析|测量 以导出面积值。
6. 重复步骤 5.1.1-5.1.5，直到测量完所有群，将结果保存到.csv文件中以供进一步分析。

Results

由梯度群板的制备，接种和孵育组成的工作流程如图 1B所示。为了产生梯度游板，将底层介质从水平面以~4.3°的支撑皿中倒入支撑皿中（补充图S3），然后在底层完全固化后倒入上层介质。双层介质的组成如 表1所示。然后，将培养过夜的细菌培养物移液到测试孔中并在37°C下孵育，保持适当的湿度水平。在具有两个或三个重复的梯度群板中设置多个测试浓度（图1C）。补充 图S1显示了盖盖的3D打印模型的替代选项，该盖子在测试点上具有柱状突起。

两种工程物种， 大肠杆菌 K12-YdeH和 铜绿假单胞菌 PAO1-YdeH，在阿拉伯糖梯度板上进行了测试。 图2A 显示了5口井的地表成群过程测试，相邻井之间发生了重叠。如图 2B

Discussion

研究半固体梯度板上细菌聚集的运动可能是一项具有挑战性的任务^18，19，20，因为它涉及多种因素，如底物粘度，湿度和介质组分。在这些因素中，琼脂浓度在确定微生物恢复到游泳或聚集运动方面起着决定性作用。随着琼脂浓度从0.3%（w/ v）增加到1%（w / v），细菌游泳运动将受到限制并逐渐转变为表面聚集，高于1%（w / v）的琼脂浓度将禁止游泳和聚集运动⁷。根据初步实验，琼脂浓度固定在0.7%（w / v），因为它显示出比其他浓度更好的性能。

这种琼脂浓度以前也用于研究微生物趋化性²¹。琼脂浓度降低导致群面积变大，相邻井之间重叠，由于边界划界不明确，增加了量化群面积的难度。相对较高的琼脂浓度导致较小的群体区域，减少了重叠的可能性。然而，过量的琼脂（>1.0%）可以防止细菌表面聚集。因此，必须选择可应用于所...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
琼脂	Sigma-Aldrich	V900500	500 g
氨苄青霉素	Solarbio	A8180	25 g， ≥ 85% （GC）
离心管	Corning	430790	15 mL
低温样品瓶	Corning	430488	2 mL
二甲基亚砜 （DMSO）	阿拉丁	D103272	AR， > 99% （GC）
L（+）-阿拉伯糖	阿拉丁	A106195	98% （GC），500 g
培养皿	Bkman	B-SLPYM90-15	塑料培养皿，圆形，90 mm x 15 mm
白藜芦醇	阿拉丁	R107315	99% （GC），25 g
氯化钠	Macklin	S805275	AR，99.5% （GC），500 g
方形培养皿	Bkman	B-SLPYM130F	塑料培养皿，方形，13 mm x 13 mm
胰蛋白胨	Thermo Scientific Oxoid	LP0042	500 克
酵母提取物	Thermo Scientific Oxoid	LP0021	500 克
<强>设备
生化培养箱	Blue pard	LRH-70
Tanon 5200多成像系统	Tanon	5200CE
恒温水沐浴	景宏	DK-S28