本文介绍了利用诱导剂梯度平板评估细菌群集运动能力，同时获得多个浓度响应的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
细菌群集运动是一种常见的微生物表型，细菌群体借此在半固体表面迁移。在诱导群集运动的研究中，需使用特定浓度 诱导剂的浓度可能无法报告物种产生理想反应所需的最佳浓度范围内的事件。通常使用含有多种浓度的半固体平板来研究诱导剂浓度范围内的反应。然而，由于凝固时间不均匀，分别制备的半固体平板会增加各平板间培养基黏度和水分含量的变异。
本文介绍了一种单步方法，可在单一梯度平板上同时检测表面群集运动能力，其中等距排列的测试孔允许同步获取多浓度响应结果。在本研究中，评估了大肠杆菌K12（Escherichia coli K12）和铜绿假单胞菌PAO1（Pseudomonas aeruginosa PAO1）在白藜芦醇和阿拉伯糖等诱导剂浓度梯度下的表面群集运动行为。通过成像系统定期记录群集形态，以捕捉整个表面群集运动过程。
利用ImageJ软件对群集形态进行定量测量，获得可分析的群集面积信息。本文介绍了一种简单的梯度群集平板方法，可提供关于诱导物对表面群集运动影响的定性和定量信息，该方法可进一步扩展应用于研究其他诱导物对更广泛运动性细菌物种的影响。
引言
细菌群集运动是指细菌细胞在物质表面进行的集体迁移。除了在实验室中特别制备的半固体琼脂平板外1，这种表型也可在某些柔软基质上观察到，例如动物组织2、水合表面3和植物根部4。尽管半固体表面被认为是细菌群集运动的基本条件之一，但某些菌种还需要富含能量的培养基来支持其群集运动能力5。鞭毛的旋转驱动了游动和群集两种运动方式：游动是指单个细胞在液体环境中的运动，而群集则是指微生物群体在半固体表面上的同步移动。
底物黏度影响细菌运动性；对病原微生物（如 幽门螺杆菌, 研究表明，该病原体的运动能力会随着黏蛋白层黏度的变化而改变，而黏蛋白层的黏度受人体宿主内环境酸化的影响6为了模拟这些环境，早期研究通过使用高于0.3%（w/v）的琼脂浓度来限制细菌的游动运动，从而促使其逐渐转变为表面群集运动。当琼脂浓度高于1%（w/v）时，则会抑制多种细菌的群集运动能力。7菌落在表面形成的图案多种多样，包括无特征的菌膜8，靶心9，树突10，涡旋混合11.
尽管这些模式的相关性尚不明确，但这些模式似乎依赖于环境和化学信号12。环境信号涵盖多个方面，包括温度、盐度、光照和pH值，而化学信号则包括微生物群体感应分子、生化副产物和营养物质的存在。自身诱导剂类群体感应信号分子（如AHL（N-己酰基-L-高丝氨酸内酯））可通过调控表面活性剂的产生来影响表面群集运动13,14。白藜芦醇是一种植物抗毒素化合物，能够抑制细菌的群集运动能力15。
在本研究中，我们探讨了白藜芦醇梯度浓度对野生型 大肠杆菌 K12菌株并研究经基因工程改造的阿拉伯糖诱导性群集运动能力 E. coli K12-YdeH 和 铜绿假单胞菌 PAO1-YdeH 菌株。YdeH 酶的表达通过阿拉伯糖诱导 araBAD 启动子，导致细胞内c-di-GMP水平扰动，并影响细菌的群集运动能力16,17这种可诱导的群集行为通过使用阿拉伯糖梯度群集平板进行研究，其中 E. coli K12-YdeH 和 P. aeruginosa PAO1-YdeH 菌株
梯度群游平板通过连续凝固双层培养基制备（图1B）。底层培养基中加入诱导剂，倾注于倾斜放置的培养皿的一侧。底层凝固后，将培养皿恢复至水平位置，从平板的另一侧加入不含诱导剂的上层培养基。待群游平板完全凝固后，按照固定布局在平板上打孔，形成等距排列的持样孔（图1C）；或在培养基固化过程中，使用含有凸钉的3D打印平板盖模型压印成孔（补充图S1）。采用凝胶成像系统在不同时间点拍摄群游形态（图2）。利用ImageJ软件对表面群游行为进行分析（补充图S2），可获得表面群游过程的定量结果（图3）。
因此，我们提出一种简单的方法，用于在诱导剂浓度范围内检测表面群集运动能力。该方法可通过将诱导剂混入底层培养基中，用于测试其他诱导剂的多种浓度响应，并可应用于其他运动性物种（例如，Bacillus subtilis、Salmonella enterica、Proteus mirabilis、Yersinia enterocolitica）。该方法可为筛选单一化学诱导剂提供可靠的定性和定量结果，同时可使用不同的平板分别评估更多化学诱导剂。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 梯度群游平板的制备
- 群游培养基的制备
注意：不同培养基黏度的简要比较见讨论部分；本方案中使用0.7% (w/v) 琼脂浓度的群游培养基。- 在两个锥形瓶中分别配制含琼脂的LB（Lysogeny broth）粉末；每个锥形瓶含2 g胰蛋白胨、2 g氯化钠、1 g酵母提取物和1.4 g琼脂。加入重蒸水（ddH2O），并用磁力搅拌子搅拌悬浮液。通过添加额外的ddH2O将最终体积调至200 mL。
- 在121 °C条件下高压灭菌20分钟。使用透气瓶盖或带通气孔的封口膜。
注意：琼脂在高压灭菌加热过程中会溶解。 - 当温度降至65 °C时，混匀溶液以确保均匀性，并将培养基转移至65 °C的培养箱或水浴中短期使用。
- 底层群游培养基的制备
注意：底层培养基是群游培养基与诱导剂储备液的混合物。诱导剂梯度群游平板的配方见表1。- 将114.12 mg冻干白藜芦醇粉末溶于5 mL二甲基亚砜（DMSO）中，配制100 mM白藜芦醇储备液，并将溶液储存在-20 °C。
- 将6 g阿拉伯糖粉末溶于30 mL ddH2O中，配制20% (w/v) 阿拉伯糖储备液；静置10–15分钟使阿拉伯糖完全溶解；溶液室温保存。
- 从65 °C培养箱中取出培养基，置于室温下；让群游培养基冷却至锥形瓶可安全手持（约50 °C）。不要将群游培养基长时间置于室温，以免琼脂凝固。
- 在50 °C时向群游培养基中加入所需体积的诱导剂储备液（表1）。使用移液器加入诱导剂溶液，避免倾倒。轻轻旋转混匀诱导剂与群游培养基。
注意：此步骤适用于不能高压灭菌的诱导剂。注意避免在培养基中引入气泡。
- 双层梯度群游平板的制备
注意：上层培养基为含0.7% (w/v) 琼脂的LB培养基。- 用诱导剂名称和菌株标记13 × 13 cm的方形培养皿，并将培养皿倾斜支撑在皿盖边缘（图1B）。
- 使用50 mL移液管或50 mL离心管加入40 mL温热的底层培养基（50 °C）。
注意：对于13 × 13 cm方形培养皿，40 mL底层和上层培养基量合适；对于10 × 10 cm方形培养皿，25 mL底层和上层培养基量合适。 - 将底层培养基在超净台内敞口固化1小时。培养基凝固过程中请勿扰动方形培养皿。
注意：在底层固化的同时，不含诱导剂的群游培养基应保持在65 °C培养箱或水浴中。 - 底层完全凝固后，移除皿盖，将方形培养皿平放于超净台内。
- 使用50 mL移液管或50 mL离心管加入40 mL温热的上层培养基（50 °C）。
注意：上层培养基不含诱导剂。 - 将双层平板在实验台上加盖静置固化1小时。制备好的平板可于4 °C保存最多24小时。
注意：过长的固化时间会降低水分含量，限制群游运动能力。
2. 生长 E. coli K12 和 P. aeruginosa PAO1
- 通过将 5 g 胰蛋白胨、5 g NaCl 和 2.5 g 酵母提取物加入 ddH2O 中，配制 500 mL LB 培养基，并将溶液定容至 500 mL。在 121 °C 下，使用液体循环灭菌 20 分钟，然后在 4 °C 下保存。
- 通过将 1 g 胰蛋白胨、1 g NaCl、0.5 g 酵母提取物和 1.5 g 琼脂加入 ddH2O 中，配制 100 mL 1.5% (w/v) LB-琼脂培养基，并将溶液定容至 100 mL。在 121 °C 下，使用液体循环灭菌 20 分钟。将培养基转移至 50 °C 水浴中，以防止琼脂凝固。
- 当 LB-琼脂培养基瓶可舒适持握时，使用 25 mL 移液管将 20 mL LB-琼脂培养基加入培养皿（直径 10 cm）中。将平板在室温下放置过夜，并在 4 °C 下保存 LB-琼脂平板。
- 取 -80 °C 保存的菌种，使用一次性接种环在 LB-琼脂培养皿上划线接种 E. coli K12、E. coli K12-YdeH、P. aeruginosa PAO1 和 P. aeruginosa PAO1-YdeH 菌株。将培养皿倒置，在 37 °C 下培养过夜。
- 从培养皿中挑取不同菌株的单菌落，将每个菌落接种至 5 mL LB 培养基中，并在 37 °C 下，以 220 rpm 的转速在实验室摇床中培养。
- 当菌液密度达到 OD600nm ~1.0 时，从摇床中取出菌液并置于室温下。按照步骤 3.2.1 所述，将菌液密度调整至 OD600nm = 1.0。
3. 梯度泳动平板的接种与培养
- 接种孔的制备
注意：可使用能够生成标准间距孔的3D打印盖模型，替代下述方法（补充图S1）。- 在A4纸上标记如图1C所示的孔位。在一个方形培养皿中设置三个测试浓度，每个浓度设两到三个重复。
- 将标记好的A4纸置于已凝固的梯度平板下方。将100 µL移液枪头较宽的一端在标记位置处插入半固体培养基表面，下压枪头直至触及上层培养基底部。
- 当枪头接触底部时，不再施加垂直方向的力；轻轻旋转枪头，以分离出圆柱形孔内的培养基。
- 将移液枪头沿水平方向轻微移动一小段距离，使空气进入预留的狭窄空间。用食指按住枪头以阻断其内部气体流动，同时用拇指和中指握住移液器。
- 垂直向上拔出枪头，拔出过程中保持孔内培养基留在枪头中。
注意：若孔内培养基滑脱，可略微增加食指压力，完全封闭枪头。 - 在每个标记位置重复步骤3.1.2至3.1.5。接种前盖好趋化运动平板。
- 梯度平板接种与培养
- 将过夜培养的菌液调整至OD600nm = 1.0。
- 将80 µL过夜培养菌液加入每个孔中。注意避免菌液溢出孔外。
- 用密封膜包裹培养皿。若需长期观察（3–5天），则使用无菌实验室橡胶胶带包裹培养皿。
注意：橡胶胶带不易断裂。 - 在培养箱内放置盛有ddH2O的烧杯，以维持培养箱内湿度。将梯度趋化平板置于37 °C培养箱中培养。
注意：切勿将趋化平板倒置培养，否则会导致菌液从孔中泄漏。 - 接种后立即拍摄趋化平板图像，并记录为0 h时间点。
4. 成像细菌表面群集运动
- 每隔 12 小时从培养箱中依次取出 swarm 平板，每次取一个，保持平板水平，并将其放入凝胶成像系统中（参见材料表）。
注意：切勿在平板表面留下指纹；应使用洁净手套握住 swarm 平板的侧面。 - 选择凝胶成像模式；用白光照射 swarm 平板；调节焦距以获得 swarm 最清晰的图像。
注意：同一批次的所有平板应使用相同的焦距。 - 通过将曝光时间调整为300 ms，增强 swarm 的亮度以便清晰观察；调节阈值以减少背景光的干扰。
注意：阈值在凝胶成像系统的操作界面上进行调整。向左增加数值可减少背景光干扰；向右减小数值可增强 swarm 的亮度。在本方案中，该数值范围通常介于 6,000 和 50,000 之间。 - 保存图像文件以供后续分析。将成像时间、诱导剂类型、梯度方向和菌株等信息记录在一个.txt文件中。
5. 使用 ImageJ 软件量化群集迁移面积
- 导入使用凝胶成像系统获取的图像文件。
- 使用 ImageJ 软件设置比例尺，并将其应用于所有图像。
- 点击直线工具，创建一条标记板子长度的线段。
- 点击 分析 | 设置比例尺，打开 设置比例尺 窗口。
- 在 已知距离 和 长度单位 中输入实际长度。
注：由于本研究中使用了 13 × 13 cm 的方形培养皿，因此实际长度为“130”，长度单位为“mm”。 - 勾选 全局 选项框。
- 点击 分析 | 工具 | 比例尺 插入比例尺，输入 宽度（mm）、高度（像素）、字体大小，并从下拉菜单中选择 颜色、背景 和 位置。或者，通过勾选复选框选择 粗体文本、隐藏文本、衬线字体 和 叠加。
注：这些参数的选择由用户决定，并取决于图像的特性。在本方案中，宽度（mm） 设置为 25，高度（像素） 设置为 20，字体大小 设置为 80，并通过选择 位置 | 右下角 将比例尺放置在图像右下角。其他参数可由用户自行选择。
- 点击 处理 | 阴影 以增强图像的清晰度，特别是边界区域（补充图 S2A）。点击 处理 | 批处理 对图像进行批量处理。
注：此步骤的目的是实现更精确的边界划分。- 通过点击 处理 | 阴影 | 南向 对一张图像进行参考处理。
- 点击 处理 | 批处理 | 宏，打开 批量处理 窗口。查找窗口中显示的以下命令：
run("South");
run("Save");
close(); - 在 批量处理 窗口中点击 处理，输入原始图像的文件夹地址和输出文件地址。
注：建议将添加阴影后的图像导出到另一个文件夹，并保留原始图像的副本。
- 使用 魔棒（描迹）工具 单独选择菌群，并调整容差值（双击 魔棒（描迹）工具），直到生成的线条准确贴合菌群边界（补充图 S2B）。
注：首先点击 魔棒（描迹）工具，在一幅图像上选择一个菌群。如果边界未被正确描绘，双击 魔棒（描迹）工具 打开 魔棒工具 窗口，在其中调整 容差 值。 - 点击 分析 | 测量 导出面积数值。
- 重复步骤 5.1.1–5.1.5，直至所有菌群均被测量，将结果保存为 .csv 文件以供进一步分析。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
制备梯度泳动平板、接种及培养的工作流程如图1B所示。为制备梯度泳动平板，首先将底层培养基倾注至倾斜约4.3°（相对于水平面）的培养皿中（补充图S3），待底层完全凝固后，再倾注上层培养基。双层培养基的组成见Table 1。随后，将过夜培养的细菌培养物用移液器接种至检测孔中，并在37 °C下培养，同时维持适当的湿度。一个梯度泳动平板中可设置多个测试浓度，每个浓度设两到三个重复（图1C）。检测位点处带有柱状凸起的盖板的3D打印模型替代方案见Supplemental Figure S1。
在阿拉伯糖梯度平板上测试了两种基因工程菌株：E. coli K12-YdeH 和 P. aeruginosa PAO1-YdeH。图2A展示了五个孔中的表面群集运动测试，相邻孔之间出现重叠。每...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在半固体梯度平板上研究细菌的群集运动能力是一项具有挑战性的任务18,19,20，因为它涉及多个因素，如基质黏度、湿度和培养基成分。在这些因素中，琼脂浓度在决定微生物是进行游动还是群集运动方面起着决定性作用。当琼脂浓度从0.3%（w/v）增加到1%（w/v）时，细菌的游动运动将受到限制，并逐渐转变为表面群集运动；而当琼脂浓度超过1%（w/v）时，则会抑制游动和群集两种运动方式7。根据预实验结果，琼脂浓度固定为0.7%（w/v），因为其表现优于其他浓度。
该琼脂浓度此前也已被用于研究微生物趋化性21。降低琼脂浓度会导致菌群迁移区域增大，并引起相邻孔之间的重叠，从而因边界划分不清晰而增加菌群迁移面积定量的难度。相对较高的琼脂浓度则导致较小的菌群迁移区域，减少重叠的可能性。然而，过高的琼脂浓度（>1.0...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
该技术的开发得到了中国科学技术部国家重点研发计划资金的支持&D 计划（2018YFA0902604）、国家自然科学基金国际青年科学家研究基金（22050410270）以及深圳先进技术研究院外部基金（DWKF20190001）。我们谨向陈欣怡女士致以诚挚的谢意，感谢她在文档校对和实验室管理方面提供的帮助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| 氨苄青霉素 | Solarbio | A8180 | 25 g，≥ 85% (GC) |
| 离心管 | Corning | 430790 | 15 mL |
| 冻存管 | Corning | 430488 | 2 mL |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Aladdin | D103272 | 分析纯，> 99% (GC) |
| L(+)-阿拉伯糖 | Aladdin | A106195 | 98% (GC)，500 g |
| 培养皿 | Bkman | B-SLPYM90-15 | 塑料培养皿，圆形，90 mm × 15 mm |
| 白藜芦醇 | Aladdin | R107315 | 99% (GC)，25 g |
| 氯化钠 | Macklin | S805275 | 分析纯，99.5% (GC)，500 g |
| 方形培养皿 | Bkman | B-SLPYM130F | 塑料培养皿，方形，13 mm × 13 mm |
| 胰蛋白胨 | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| 酵母提取物 | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| 仪器设备 | |||
| 生化培养箱 | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi 成像系统 | Tanon | 5200CE | |
| 恒温水浴锅 | Jinghong | DK-S28 |
参考文献
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338(2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847(2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. Swarming motility in plant-associated bacteria. Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710(2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840(2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36(2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. Brahmachari, P. V., et al. , Springer. Singapore. 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, Pt 10 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842(2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915(2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752(2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102(2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480(2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
