利用shRNA文库筛选鉴定调控药物耐受表型的因素

摘要

利用慢病毒shRNA文库进行高通量RNA干扰（RNAi）筛选，可作为发现恶性肿瘤中具有治疗意义的合成致死靶点的工具。我们提供一种基于shRNA文库的筛选方法，用于研究急性髓系白血病（AML）中的表观遗传调控因子。

摘要

阐明急性髓系白血病（AML）患者获得性化疗耐药的临床相关驱动机制，对于揭示克服耐药性并改善患者生存率的方法至关重要。在化疗后存活的一小部分白血病细胞具有预先准备的表观遗传状态，能够耐受化疗药物的损伤。进一步的化疗暴露使这些药物持久性细胞获得稳定的表观遗传状态，导致基因表达改变，从而促进耐药细胞群体的增殖，最终导致疾病复发或难治。因此，鉴定维持耐药白血病细胞存活所必需的表观遗传调控因子至关重要。本文详细描述了一种利用混合shRNA文库筛选技术，在获得性阿糖胞苷（AraC）耐药的AML细胞系中鉴定介导对核苷类似物阿糖胞苷耐药的表观遗传调控因子的实验方案。该文库包含5,485个shRNA构建体，靶向407个人类表观遗传因子，可实现表观遗传因子的高通量筛选。

引言

在过去近五十年中，急性髓系白血病（AML）的治疗方案一直未有改变，以阿糖胞苷（AraC）和蒽环类药物作为治疗该疾病的核心手段。AML治疗面临的一个挑战是白血病干细胞对化疗药物的耐药性，从而导致疾病复发^1,2。表观遗传调控在癌症发病机制和药物耐药性中发挥关键作用，多个表观遗传因子已作为有前景的治疗靶点被提出^3,4,5。表观遗传调控机制影响细胞在持续暴露于化疗药物条件下的增殖与存活。在非血液系统恶性肿瘤中的研究报道，有少量细胞能够克服药物作用，并经历多种表观遗传学修饰，从而实现存活^6,7。然而，表观遗传因子在介导AML中对阿糖胞苷产生获得性耐药方面的作用尚未被研究。

高通量筛选是一种药物发现方法，其全球重要性日益增加，现已成为识别细胞机制中潜在靶点、进行通路分析以及分子水平研究的标准方法^8,9。合成致死概念涉及两个基因之间的相互作用，单独扰动其中任....

方案

遵循机构生物安全委员会（IBSC）指南，并在适当的设施中操作慢病毒（BSL-2）。操作人员应接受慢病毒处理与处置的适当培训。本方案遵循印度韦洛尔基督教医学院的生物安全指南。

1. 选择最有效的启动子以获得shRNA的持久和长期表达

注意：使用表达荧光蛋白的、带有不同启动子的慢病毒载体进行转导实验至关重要，以确定在实验所选细胞系中能够实现shRNA稳定且长期表达的启动子。常用于此目的的启动子包括表达绿色荧光蛋白（GFP）的人EF1α（人延伸因子1α）、hCMV（人巨细胞病毒）和SSFV（脾灶形成病毒）启动子（图2A）。

1. 使用台盼蓝排斥法进行细胞计数。将 MV4-11 AraC R 细胞悬浮于含 8 µg/mL 多聚素的 10% RPMI 培养基（RPMI 加 10% 胎牛血清，并补充 100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素）中。每孔加入 1.5 mL 培养基，按每孔 1 × 10⁶ 个细胞接种至 6 孔板中，设三个重复孔。
2. 向各孔中加入不同体积的浓缩慢病毒（例如，根据慢病毒滴度加入 10 µL、20 µL 或 40 µL）。轻轻摇晃培养板以混匀内容物。
3. 在 37 °C 条件下，以 920 ×g 离心 90 分钟，进....

结果

整体筛选流程如 图1A所示。体外细胞毒性实验显示，MV4-11 AraC R细胞系对阿糖胞苷（48 h）的IC50值高于MV4-11 P细胞系（图1B）。本研究采用该细胞系作为模型，用于筛选介导阿糖胞苷耐药的表观遗传因子。

图 2A 显示了线性化的 pZIP 载体图谱，包含三种不同的启动子：hEF1α（人延伸因子 1α）、hCMV（人巨细胞病毒）和 SSFV（脾灶形成病毒），其中包含位于 UltramiR 序列内的乱序 shRNA。图 2B 展示了在文库实验中使用的 pZIP 载体图谱，该载体包含靶向表观遗传因子的 shRNA，并以 Zsgreen 和嘌呤霉素作为筛选标记，由 hEF1a 启动子驱动表达。这些载体用于最强启动子筛选实验。

在.......

讨论

RNA干扰（RNAi）被广泛应用于功能基因组学研究，包括siRNA和shRNA筛选。shRNA的优势在于其可被插入质粒载体并整合到基因组DNA中，从而实现稳定表达，因此对靶标mRNA的沉默效果更持久。与传统的阵列式筛选（siRNA）相比，混合shRNA文库筛选具有更高的稳健性和成本效益。在全基因组范围内鉴定某一特定类别蛋白质的功能重要性可能较为繁琐。靶向筛选策略能够在特定蛋白类别中揭示各个蛋白质对癌细胞存活或药物耐药性的功能重要性，同时降低背景噪声。本实验方案重点介绍针对表观遗传因子的RNAi筛选，以系统性地研究必需基因和非必需基因，并展示该方法作为功能筛选平台的应用，用于鉴定介导急性髓系白血病（AML）药物耐药性的关键靶点。

这项强大技术在实验设计与实施过程中需要采取某些预防措施。首先，应选择在细胞培养期间不会发生显著沉默的启动子，以表达shRNA，因为其高效表达对于靶基因的敲低至关重要。其次，维持shRNA的代表性（即每种shRNA转导的细胞数量）尤为关键。在整个shRNA筛选过程中，每种shRNA构建体平均由>500个细胞代表，有助于提高识别引起表型效应的shRNA的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
100 bp Ladder Hyper Ladder	BIOLINE	BIO-33025
1kb Ladder Hyper Ladder	BIOLINE	BIO-33056
琼脂糖	Lonza Seachekm	50004
甜菜碱（5 mM）	Sigma	B03001VL
硼酸	Qualigens	12005
细胞培养塑料器皿	Corning	as appicable
盐酸阿糖胞苷（Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride）	Sigma	C1768-500MG
DMEM	MP BIO	91233354
DMSO	Wak Chemie GMBH	Cryosure DMSO 10ml
EDTA	Sigma	E5134
溴化乙锭	Sigma	E1510-10 mL
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	16000044
凝胶/PCR 纯化试剂盒	MACHEREY-NAGEL	REF 740609.50
Gibco- RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	23400021
冰醋酸	Thermo	Q11007
hCMV GFP 质粒	Transomics	TransOmics Promoter selection KIT
hEF1a GFP 质粒	Transomics	TransOmics Promoter selection KIT
HEK 293T	ATCC	CRL-11268
HL60 细胞系	ATCC	CCL-240
KOD Hot Start 聚合酶	Merck	71086
Molm13 细胞系	Ellen Weisberg 实验室，达纳-法伯癌症研究所，波士顿，马萨诸塞州，美国	达纳-法伯癌症研究所，波士顿，马萨诸塞州，美国
MV4-11 细胞系	ATCC	CRL-9591
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122
psPAX2 和 pMD2.G	Addgene	Addgene 质粒编号 12260 & Addgene 质粒编号 12259
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Invitrogen	REF Q32854
SFFV  GFP 质粒	Transomics	TransOmics Promoter selection KIT
来自 Transomics 的 shERWOOD-UltrmiR shRNA 文库	Transomics	货号 TLH UD7409；批号 A116.V 132.14
Trans-IT-LTI Mirus	Mirus	Mirus 目录编号：MIR2300
Tris	MP Biomedicals	0219485591
台盼蓝	Sigma-Aldrich	T8154-100ML
超速离心管	Beckman Coulter	103319
设备
5% CO2 培养箱	Thermo Fisher
BD Aria III 细胞分选仪	Becton Dickinson
Beckman Coulter Optima L-100K 超速离心机	Beckman Coulter
离心机	Thermo Multiguge 3SR+
ChemiDoc 成像系统 （Fluro Chem M 系统）	Fluro Chem
Leica AF600	Leica
光学显微镜	Zeiss Axiovert 40c
Nanodrop	Thermo Scientific
Qubit 3.0 荧光计	Invitrogen
PCR 仪	BioRad