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一种用于小鼠中枢神经系统组织学分析的重力驱动经心灌注方法

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DOI：

10.3791/63386

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2022年1月21日

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, State University of New York Upstate Medical University, 2Department of Neurology, State University of New York Upstate Medical University, 3Department of Neuroscience and Physiology, State University of New York Upstate Medical University

本文内容

摘要

介绍了一种便捷的重力灌注法，用于小鼠中枢神经系统的组织学分析。在帕金森病小鼠模型中，展示了磷酸化α-突触核蛋白的免疫荧光检测。本研究还全面描述了经心脏灌注、解剖、组织冷冻/包埋以及冷冻切片等步骤。

摘要

对从小鼠分离的脑和脊髓标本进行组织学分析，是评估该模型系统病理状况的常规做法。为了保持这些精细组织的形态，通常需要通过麻醉动物的心脏插管（经心灌注）注入化学固定剂（如多聚甲醛）。传统的小鼠心脏经心灌注依赖蠕动泵或气压装置来输送此过程所需的生理盐水和固定剂溶液。作为一种更易获取的替代方法，本研究展示了一种利用重力驱动的灌注液输送方法，其所需材料在大多数五金商店均可购得。

为了验证这种新的灌注方法，本研究展示了在脑组织和脊髓中敏感检测磷酸化α-突触核蛋白所需的全部后续步骤。这些步骤包括固定后脑组织和脊髓组织的解剖、组织的快速冷冻包埋与冷冻切片，以及免疫荧光染色。由于该方法可实现固定液的全身输送，因此也可用于制备其他非神经组织以进行组织学分析。

引言

小鼠中枢神经系统（CNS）病理学的组织学表征是神经退行性研究中常用的常规技术。由于神经组织在死亡后会迅速降解，通常需向CNS组织灌注化学固定剂（如多聚甲醛）以保存其形态结构1,2化学固定可通过用固定液进行全身灌注，或通过分离组织并将其浸入固定液中（称为浸泡固定）来完成。 "滴加固定液"灌注是固定剂递送的首选方法，因为滴加固定可能无法使固定液快速渗透到中枢神经系统深部结构3,4,5此外，由于未固定的脊髓难以从椎管中取出，通过灌注方式输送固定液可实现对脊髓的充分固定 原位 保存脊髓的显微和大体解剖结构，并使组织硬化以减少取出过程中的损伤。

用于固定所需的缓冲液和固定液的递送通常通过市售泵或气压装置完成。灌注液的重力递送可作为泵递送的一种替代方案，原因如下：（1）在某些情况下，泵或气压递送可能需要操作者在整个灌注过程中手动维持系统压力，而重力递送可在无需人工干预的情况下持续维持灌注液的输送。（2）操作者可通过获取 readily 可得的材料，以较低成本自行构建重力驱动的灌注装置 从标准科学供应商处获取。本研究描述了如何使用洗瓶和乙烯基管构建一个简单的重力灌注装置。利用帕金森病小鼠模型，本研究展示了该系统在组织分离前对脑和脊髓组织进行灌注的有效性。本研究全面描述了从动物体内解剖固定组织、快速冷冻包埋并进行冷冻切片，以及通过间接免疫荧光显微镜检测脑和脊髓中磷酸化α-突触核蛋白存在的全部步骤、技术和所需材料。

方案

本方案中展示的数据和实验步骤均使用 C57BL/6J 小鼠获得。所有涉及动物的实验方法均经纽约州立大学上州医科大学机构动物护理与使用委员会批准。

1. 灌注装置与解剖平台的构建

  1. 如图所示 图1，用锋利的剃刀将两个500 mL冲洗瓶的内管从旋盖内侧齐平切除。在每个缓冲液瓶的底部切割一个4 cm × 4 cm的方形孔。在每个瓶子的底部再切一个小孔，以便插入弯曲的不锈钢微量刮勺。
  2. 将微型刮勺弯成“S”形，使其可用作悬挂缓冲液瓶的挂钩。将弯曲的微型刮勺插入缓冲液瓶的相应开口中。
  3. 剪取两段25 cm长的管子，将其紧密连接到外瓶的吸管出口。使用Y型连接器将这两根管子的末端连接在一起。再剪取一段2 m长的管子，连接到Y型连接器的自由端。
  4. 从1 mL注射器中取出活塞，并在距离注射器尖端约6 cm处将注射器剪断。剪切时，先用刀片在塑料表面划出刻痕，然后迅速折断注射器塑料部分。
  5. 将注射器的切面插入塑料管的自由端，插入足够深度以确保密封紧密。
    注意：灌注装置内的所有连接处必须充分紧密，以防止泄漏。若连接松动，可根据需要在接头处加装小型不锈钢软管夹，并视情况拧紧，以确保密封严密。
  6. 将一个缓冲液瓶标记为 PFA 以及一个瓶子作为 PBS （缓冲液）。量取约1/3rd 距离瓶口一定长度处，在瓶身周围画一条线，以标示灌注液的适当填充液位。
  7. 将一个大号回形针拉直，然后弯成一个环，使其能够套住导管的周长。将此环放置在靠近注射器近端的导管上。
  8. 将一块大小合适的泡沫塑料块放入玻璃托盘中，将回形针的两端插入泡沫塑料块中以固定导管。
  9. 使用纸巾将玻璃托盘前端垫高约2 cm。
    注意：这将使小鼠大致处于 20° 采用特伦德伦堡位（仰卧位头低脚高倾斜），以便在解剖过程中更清晰地观察膈肌，并促进灌注期间液体的引流。

灌流装置示意图；用于组织灌流研究的 PBS 和 PFA 管路。
图1：灌流装置组装示意图。 缩写：PBS = 磷酸盐缓冲液；PFA = 多聚甲醛。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 甲醛溶液的制备

注意：PFA 溶液必须在灌流当天新鲜配制，并在灌流结束后立即倒入指定的废液容器中，由经过培训的人员进行后续处理。本方案配制 1 L 的 4% PFA 溶液，足以灌流约 4 只小鼠。PFA 具有高毒性，无论是粉末状还是液体状态，均需避免吸入或直接接触皮肤。因此，大多数配制步骤应在通风橱内操作，并佩戴手套、防护眼镜和实验服。

  1. 使用蒸馏水冲洗一个 1 L 的烧杯，并加入约 800 mL 的 18 mΩ 分子生物学级 H2O。
  2. 将装有 H2O 的烧杯放入微波炉中加热 3 分钟，或加热至水温达到 65 °C。然后将其放置于通风橱内的加热/搅拌台上。
  3. 用蒸馏水冲洗搅拌棒并放入热水中。启动搅拌器并将加热板调至中等温度。确保水温不超过 70 °C。
  4. 佩戴外科口罩、手套、防护眼镜和实验服，称取 40 g PFA 粉末，并将其倒入加热的水中。
  5. 使用移液管向溶液中加入几滴 5 M NaOH。使 PFA 粉末完全溶解。若数分钟后粉末仍未完全溶解，可根据需要逐滴加入 5 M NaOH。
  6. 当几乎全部 PFA 溶解后（溶液略显浑浊），停止搅拌和加热，并立即加入 100 mL 10×磷酸盐缓冲液（PBS）。最后用 18 mΩ 分子生物学级 H2O 将水量补至烧杯的 1 L 刻度线。用塑料封口膜覆盖烧杯，并将其置于 -20 °C 冰箱中，直至溶液冷却至室温（约 45 分钟）。
  7. 使用适当的标准缓冲液校准 pH 计。在烧杯置于搅拌台上的同时，测量溶液的 pH 值，并滴加 HCl 至 pH 达到 7.4。如果 pH 值过低，必要时可滴加 5 M NaOH 以提高 pH 值。
  8. 将真空抽滤瓶连接至真空泵，并在瓶口安装带有滤纸的洁净陶瓷布氏漏斗。开启真空泵，使用装有 4% PFA 溶液的移液管润湿滤纸。
  9. 缓慢将 4% PFA 溶液倒入滤纸上，直至全部溶液完成过滤。
  10. 将过滤后的溶液转移至洁净、避光的容器中，并于 4 °C 保存备用（保存时间不超过 24 小时）。

3. 经心脏“无泵”灌注

  1. 在通风橱内，将泡沫塑料解剖板放入玻璃托盘中。确保解剖板上装有5-6根短针，用于手术期间固定小鼠，以及2根长针，用于支撑灌流导管。
  2. 用蒸馏水冲洗灌流装置。在悬挂灌流装置前，确保所有水分完全排尽。将灌流瓶悬挂于灌流动物上方1米处（适用于20–30 g的小鼠）。
  3. 使用18 mΩ分子生物学级水将10x PBS稀释，配制1x PBS非无菌溶液。2O.
  4. 如图所示 图2用止血钳夹住灌注装置的主线路，再用另一把止血钳夹住PFA管路。
    注意：为完全阻断血流，每条血管可能需要使用多个止血钳进行夹闭。
  5. 填充 缓冲液 室温下装有1x PBS的容器。
  6. 将灌流装置的注射器端放入烧杯中以收集废液缓冲液，并移除阻断主路的止血钳图2，左侧。
  7. 在轻轻敲击管壁以去除 trapped 气泡的同时，让 PBS 流经管路。
  8. 当缓冲液管路和主通道中的所有空气排尽后，用止血钳夹闭主通道以阻断液体流动。
  9. 从PFA管路中移除止血钳，使PBS逆向流入PFA瓶，同时轻敲PFA管路以排出其中的气泡图2，中段）。继续让 PBS 进入 PFA 管路，直至在瓶口上方可见 PBS。用止血钳夹闭 PFA 管路，以停止液体流入 PFA 瓶中。
  10. 将蝴蝶输液针连接至灌注注射器，打开主路止血夹，使 PBS 流经管路以排出灌注注射器中的气泡，随后关闭主路止血夹。
  11. 确保 PBS 瓶中的液体约为其容量的 1/3rd 用 PBS 灌满。如有必要，可将 PBS 冲洗通过主线路，或向缓冲瓶中添加更多 PBS，直至达到 1/3 容量rd 其全部容量。
  12. 待 PBS、PFA 及主管线中的所有气泡完全排出后，将室温的 4% PFA 溶液注入 PFA 瓶中，液面升至瓶身黑色标记处（约 1/3）rd 完整）（图2，右侧。

液-液萃取示意图，色谱系统，分离方法可视化
图2灌流手术用灌流装置的准备 首先，关闭PFA管路的止血夹，打开PBS管路及主路的止血夹。用PBS充满管路，并去除PBS管路和主路中的气泡。接着，打开PFA管路的止血夹，关闭主路的止血夹，用PBS填充PFA管路，并去除PFA管路中的气泡。最后，当PBS到达PFA瓶的入口时，关闭PFA管路的止血夹。将PFA瓶填充至1/3体积rd 充满 PFA。确保 PBS 瓶中 PBS 的液面高度为 1/3rd 注满，必要时通过打开主通路止血夹用 PBS 灌满或排空 PBS。缩略语：PBS = 磷酸盐缓冲盐水；PFA = 多聚甲醛。 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 用清水清洗以下器械，随后用70%乙醇擦拭，以准备非存活手术：大剪刀、精细解剖剪、皮肤镊、精细带孔弯镊。
  2. 将无尘擦拭纸放入一个50 mL锥形管中，以准备麻醉。在通风橱内，用异氟烷充分浸湿无尘擦拭纸，并将打开盖子的锥形管倒置于一个500 mL烧杯中。确保烧杯底部无液态异氟烷残留；在将小鼠放入烧杯前，务必弃去任何残留的液体异氟烷。
  3. 将小鼠放入烧杯中，并用塑料封口膜覆盖烧杯口，开始麻醉。
  4. 持续麻醉至小鼠呼吸停止（约1分30秒）。
  5. 当呼吸停止后，立即从小鼠取出并盖上50 mL锥形管的管盖。
  6. 通过脚趾夹捏反射检查小鼠是否已充分麻醉。若麻醉不足，按步骤3.15所述追加异氟烷。
  7. 迅速将小鼠置于泡沫板上，用四枚短针（例如22 G注射器针头）将四肢向外固定。
  8. 用皮肤镊提起腹部皮肤，使用大剪刀剪开腹壁。注意避免损伤腹腔内任何器官！
  9. 继续向上方沿腹壁切口至肝脏区域。将肝脏从前腹壁分离，并继续向上沿初始切口延伸至膈肌。在距离膈肌约1 cm处停止该切口。注意避免损伤肝脏！
  10. 从初始切口向左右两侧沿膈肌向上延伸，形成“Y”形切口（图3A）。
  11. 当切口到达膈肌时，使用精细解剖剪在膈肌上打孔，并剪开动物右侧的肋骨，剪切位置约为右侧腋窝方向的肋骨中点。
  12. 在左侧膈肌处做类似但更长的切口，几乎延伸至左侧腋窝。
  13. 将胸壁翻起，并用针固定于泡沫板上。
  14. 如有必要，清除心脏周围的脂肪组织以暴露左心室。根据左心室颜色较右心室更浅的特征进行识别。
  15. 确认左心室位置后，用精细弯镊轻轻夹持以稳定心脏。打开主路止血钳，使PBS溶液开始经针头流出。立即穿刺左心室，并确保针头插入心室深度不超过0.5 cm；必要时可轻微回撤针头。
    注意：针头准确插入左心室的标志是血液逆流进入针头导管。必须避免针头插入过深，否则可能导致液体经肺静脉逆流或穿破室间隔。
  16. 将蝶形导管置于泡沫板上由两枚18 G大针所构成的X形支架上。
    注意：此操作至关重要，可避免灌流过程中蝶形针在心脏内移动。
  17. 识别下腔静脉从肝脏穿出的位置，使用精细解剖剪将其横断（图3B）。或者，也可用剪刀剪开右心房。
  18. 立即打开主路，开始PBS灌流（图3C）。
  19. 确保PBS液体从泡沫板流下并进入下方的玻璃托盘。若液体未顺利排出，应调整托盘或泡沫板的角度，以保证液体顺利流入玻璃托盘。
  20. 持续进行PBS灌流，直至从下腔静脉流出的液体无血（约3分钟）。
    注意：针头在心脏内正确放置的标志是肝脏由红色逐渐变为淡黄色，表明血液被清除。若未出现此现象，可通过调整左心室内灌注针的位置进行纠正。可在尾部腹侧基部做一小切口以评估灌流质量。灌流充分时，切口处将有清澈的PBS液体流出。
  21. 迅速操作，用止血钳夹闭PBS管路，打开PFA管路。
  22. 让PFA灌流数分钟，直至尾巴开始卷曲。一旦尾巴开始卷曲，立即启动50分钟计时器。若PFA灌流5分钟后尾巴仍未卷曲，也应开始50分钟的PFA灌流计时。
  23. 在整个灌流过程中持续监测瓶内PFA液面高度，确保液面不会过低。若液面降至瓶盖上方不足2 cm，应及时补充PFA溶液。

小鼠灌流过程；心脏插管，下腔静脉横断；方法示意图；实验步骤。
图3：经心灌流示意图。（A）首先切开腹壁，随后向两侧腋部方向做两个切口，形成“Y”形。（B）进入胸腔并暴露心脏后，将针插入左心室。接着横断下腔静脉（IVC）或右心房，以便灌流液在流经全身后排出。下腔静脉的切断位置位于膈肌上方。（C）灌流液给药操作流程。缩写：IVC = inferior vena cava（下腔静脉）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 50分钟后，用止血钳夹闭主通路，并将针头从左心室撤出。
    注意：此时整只小鼠已变得僵硬，可将其放入标有标签的4%多聚甲醛（PFA）容器中，在4 °C下固定过夜。在此阶段，也可将中枢神经系统组织解剖取出，并分别置于固定液中过夜固定。本研究中，将整只小鼠直接放入固定液，以缩短固定开始与转移至4 °C之间的间隔时间。此外，这种方法还可避免在固定完成前进行预解剖可能造成的神经组织机械性形变。

4. 中枢神经系统解剖

  1. 使用水清洗以下解剖器械，随后用70%乙醇处理：剪刀、皮肤镊、弯型有齿镊、弯型精细镊、直型精细镊、精细剪刀。
  2. 每只小鼠标记四个试管，并加入无菌20%蔗糖溶液，标记如下：小鼠编号，脑1，小鼠编号，脑2，小鼠编号，腰段，小鼠编号，颈段。
  3. 将小鼠从PFA溶液中取出，用纸巾轻轻吸干以去除多余的PFA。
  4. 使用大剪刀在颈部位置剪下小鼠头部。
  5. 将身体部分放回PFA溶液中。保留头部用于从颅骨中分离脑组织。
  6. 开始解剖脑组织时，先将颅骨皮肤向前翻起，以完全暴露颅骨（图4A）。
  7. 使用精细解剖剪在听道处做一浅切口，以进入颅腔。
  8. 沿横窦继续切割，直至两侧听道之间完全切开颅骨。
  9. 在纵裂处做一垂直于前一切口的切口，一直切至颅骨最前端（大约两眼之间位置）。
  10. 使用弯型有齿镊将颅骨向两侧翻起，暴露前脑。继续去除颅骨，直至整个前脑（包括嗅球）完全暴露。
  11. 从枕骨处开始切割，解剖颅骨后部区域，并缓慢向下延续切口至枕骨大孔。
  12. 将两片颅骨向两侧翻起，以暴露后部的小脑和脑干（图4B）。
  13. 使用超精细弯型镊将嗅球与前颅骨分离，并从嗅球开始，逐步将脑组织从颅底剥离。
  14. 在将脑组织从颅底剥离的过程中，使用超精细镊剪断颅神经，以便完整取出脑组织。
  15. 继续将脑组织从颅底剥离，直至完整取出整个脑组织（图4C，D）。
  16. 沿纵裂将脑组织切成两半，分离左右半球（图4E，F）。
  17. 将其中一个半球放入脑1管中，另一个半球放入脑2管中。将这些试管置于4 °C保存，直至脑半球完全沉底（约过夜）。

解剖过程，解剖学研究，脑标本，比例参考，教学图示。
图 4：固定脑组织的取出。 （A）颅骨顶部。（B）颅腔内暴露的脑组织。（C）分离出的脑（背侧观）。（D）分离出的脑（腹侧观）。（E）左半球（外侧观）。（F）左半球（内侧观）。比例尺 = 1 cm（E 和 F）。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 为解剖脊髓，将小鼠尸体从多聚甲醛（PFA）中取出，并用纸巾吸干表面液体。
  2. 将小鼠腹侧朝下置于泡沫板解剖台上，用四枚针将四肢固定在泡沫板上。
  3. 从颈部至尾部沿正中线切开皮肤，暴露整个背部。
  4. 剥离背部的肌肉和筋膜，暴露椎体后部结构。
  5. 从最头端的椎骨开始，使用精细解剖剪剪开椎板，注意避免损伤脊髓（图5A）。
  6. 将超细弯镊置于椎板下方，向上提起以折断椎骨，从而暴露脊髓（图5B）。
  7. 使用弯镊将折断的椎骨向外翻起，暴露脊髓最外侧区域。
  8. 重复上述操作，依次将超细弯镊置于下一节椎板下方，逐节折断椎骨，直至完全暴露颈段和胸段脊髓（图5C）。
  9. 继续暴露脊髓，直至腰骶段末端（图5D）。
  10. 使用锋利的刀片，在胸中段脊髓处横向完全切断。
  11. 使用超细弯镊从脊柱外侧切断脊神经，并剪断脊髓前方的筋膜，缓慢将颈段脊髓从椎管中分离。
  12. 继续解剖颈段脊髓，直至其完全脱离椎骨（图5E）。将颈段至胸中段的脊髓放入标记为cervical的离心管中。将该管置于4 °C保存，直至脊髓完全沉底（约过夜）。
  13. 继续按步骤4.22至4.25所述方法，逐节折断胸段椎骨，直至暴露马尾神经。当马尾神经暴露后，使用锋利刀片在腰段脊髓下方1 cm处切断脊髓（图5F）。
  14. 按照步骤4.26–4.27所述方法，将腰段脊髓从椎骨中分离。将腰段至腰中段马尾神经的脊髓放入标记为lumbar的离心管中。将该管置于4 °C保存，直至脊髓完全沉底（约过夜）。
  15. 当所有组织在20%蔗糖溶液中完全沉底后，将其转移至标记好的30%蔗糖溶液管中，继续保存至沉底或最多3天。
    注：脊髓组织在30%蔗糖溶液中常不易沉底。

显示肌腱（标记为 A-H）的解剖过程，用于解剖学研究的显微镜特写图像。
图 5：固定脊髓节段的切除。（A）对颈椎椎板进行初步切割。（B）使用弯头镊子逐个折断椎骨。（C）暴露的颈椎。（D）暴露的颈椎、胸椎和腰椎。（E）切断脊神经后切除颈椎。（F）切断骶椎。（G）分离出的颈椎。（H）分离出的腰椎。比例尺 = 1 cm（G 和 H）。 请点击此处查看该图的放大版本。

5. OCT包埋与组织保存

  1. 每只小鼠准备四个矩形冷冻模具，分别标记为：小鼠编号，右半脑，包埋日期；小鼠编号，左半脑，包埋日期；小鼠编号，颈段，包埋日期；小鼠编号，腰段，包埋日期。
  2. 准备一个泡沫塑料容器，并在容器上方悬挂一个金属杯。
  3. 向泡沫塑料容器中注入约一半体积的液氮。向金属杯中注入约一半体积的新鲜2-甲基丁烷。
    注意：2-甲基丁烷具有毒性、高度挥发性和易燃性。操作时必须在通风橱内进行，并远离火源，避免吸入。
  4. 缓慢将金属杯浸入液氮中，避免液氮溅入金属杯内。
  5. 待2-甲基丁烷开始冻结。在此期间，从小鼠取出所需组织，从30%蔗糖溶液中取出，并用无尘擦拭纸吸干表面液体。
  6. 将组织放入冷冻模具中，头端朝向模具顶部（无标记端）。
  7. 向冷冻模具中的组织上少量加入最佳切割温度包埋介质（OCT），仅需覆盖组织即可。避免使用过量OCT，以防产生裂纹。清除OCT中的所有气泡。
  8. 当冻结的2-甲基丁烷完全覆盖金属杯内壁后，将冷冻模具完全浸入上层液态2-甲基丁烷中12秒。12秒后，将冷冻模具置于已标记的铝箔方块上沥干，并用铝箔完全包裹。立即将包裹好的冷冻模具置于干冰上，避免解冻。确保冷冻的OCT/冷冻模具始终被干冰覆盖。
  9. 对所有组织重复步骤5.6至5.8。将同一只小鼠的组织放入密封的小塑料袋中，再放入密封的耐冻容器内。将该容器保存于-80 °C超低温冰箱中，直至进行切片。

6. 冷冻切片

  1. 在进行冷冻切片前，确保冷冻切片机腔室温度和样本头温度已设置为适当参数。
    注意：切割脑组织切片时，采用腔室温度 -20 °C、样本头温度 -20 °C、切片厚度 30 µm；切割脊髓组织切片时，采用腔室温度 -23 °C、样本头温度 -30 °C、切片厚度 30 µm。需注意，冷冻切片过程中（尤其是样本头温度）需根据组织质量情况调整仪器设置。通常，降低样本头温度可纠正组织涂抹现象；反之，提高样本头温度可纠正组织过度卷曲现象。
  2. 从 -80 °C 冰箱中取出所需的 OCT 包埋块，将未包裹的冷冻模具/OCT 包埋块放入冷冻切片机腔室内。
  3. 使 OCT 包埋块在腔室内温度下平衡 30 分钟。
  4. 用 70% 乙醇清洁持样夹具，再用无尘擦拭纸擦干。将清洁后的夹具放入冷冻切片机腔室，在夹具上滴加硬币大小的 OCT 包埋剂，待其冻结（约 1–2 分钟）。
  5. 当 OCT 完全冻结后，在夹具上滴加豌豆大小的新鲜 OCT 包埋剂，并立即将组织 OCT 包埋块置于夹具上。确保在 OCT 完全冻结前，组织与夹具保持完全垂直。
    注意：通常将脑组织最前部朝向夹具，以便从尾端开始切片；对于脊髓组织，通常将最尾部置于夹具上，以便从前端开始切片。
  6. 当 OCT 完全固化后，在 OCT 包埋块底部周围再添加适量 OCT，以在切片过程中提供结构支撑。待支撑部分稍硬化后，将夹具安装至样本头，并使 OCT 包埋块与样本头温度平衡 30 分钟。
  7. 将切片刀安装至刀架，并清洁防卷板。调节防卷板距离，确保切片过程中组织刚好从防卷板下方通过。有关防卷板正确位置的更多信息，请参考冷冻切片机使用手册。
  8. 待 OCT 包埋块与样本头温度平衡后，开始修块直至暴露组织。当组织可见时，从修块模式切换至切片模式，开始切割 30 μm 厚的切片。移开防卷板，使用载玻片接取切片。
  9. 持续切片并收集，直至获得满意解剖位置的切片或完成全部组织切片。将载玻片置于室温下干燥 1–3 天。干燥后，将载玻片放入玻片盒，并将玻片盒密封于塑料袋中。在放入 -80 °C 超低温冰箱前，于袋上标注小鼠编号及组织信息。

7. 免疫荧光染色

  1. 将载玻片在室温下解冻 1 小时。
  2. 将载玻片放入水平切片架中，在摇床上用 PBS 室温洗涤 3 次，每次 10 分钟。
  3. 制备封闭缓冲液（1x PBS 中含 2% BSA 和 0.3% Triton-X-100），每张载玻片使用约 1 mL。
  4. 通过在底部加入水来创建湿盒，将载玻片正面朝上水平放置，避免干燥。每张载玻片加入 1 mL 封闭缓冲液，室温孵育至少 1 小时。
  5. 将一抗用抗体稀释缓冲液（1x PBS 中含 0.7% BSA 和 0.3% Triton-X-100）稀释，配制一抗溶液。
    注意：对于磷酸化 α-突触核蛋白抗体，使用了 1:500 的稀释比例。
  6. 每张载玻片加入 200–300 µL 一抗溶液，加盖盖玻片以均匀分散抗体，4 °C 过夜孵育。
  7. 次日，将载玻片从湿盒中取出，逐个放入盛有 1x PBS 的垂直 Coplin 染色缸中，使盖玻片自然脱落。操作每张载玻片时应单独进行，并在移除盖玻片时注意不要扰动组织切片。
  8. 将载玻片放入水平切片架中，在摇床上用 PBS 室温洗涤 3 次，每次 10 分钟。
    注意：后续所有步骤均需在避光条件下进行，以防止荧光染料发生光漂白！
  9. 将二抗用抗体稀释缓冲液稀释，配制二抗溶液。
    注意：检测磷酸化 α-突触核蛋白时，使用了 Alexa 488 标记的抗兔二抗，按 1:500 比例稀释于抗体稀释缓冲液（1x PBS 中含 0.7% BSA 和 0.3% Triton-X-100）中。
  10. 将载玻片水平放置于湿盒中，每张载玻片加入 200–300 µL 二抗溶液，加盖盖玻片以分散抗体，室温避光孵育至少 2 小时。
  11. 将载玻片从湿盒中取出，逐个放入盛有 1x PBS 的垂直 Coplin 染色缸中，使盖玻片自然脱落。操作每张载玻片时应单独进行，并在移除盖玻片时注意不要扰动组织切片。
  12. 将载玻片放入水平切片架中，在摇床上用 PBS 室温洗涤 3 次，每次 10 分钟。
  13. 用纸巾轻蘸载玻片边缘以吸除水分，并轻轻甩去多余的 PBS。
  14. 每张载玻片滴加 3 滴封片剂，盖上盖玻片，并用镊子轻压盖玻片以排出气泡，随后进行共聚焦显微镜成像。

结果

高质量灌注的标志是肝脏、脊髓和深部中枢神经系统结构中无血液残留（图4C 和 图5G、H）。硬脑膜下方（例如静脉窦内）或硬脑膜与颅骨之间的残留血液通常不会造成问题，因为这些血液并未进入脑实质。在 图4A 中观察到的血液位于颅骨与硬脑膜之间，因此并不影响灌注质量，也不提示灌注效果不佳。新鲜的脑和脊髓组织质地较软，在操作过程中容易受损。相比之下，充分固定的组织则较为坚实。为评估本灌注方法对组织质量及组织形态保存的效果，本研究展示了在15月龄和7月龄表达人源A53T突变型α-突触核蛋白的小鼠中脑和腰段脊髓中磷酸化α-突触核蛋白的检测结果（图6）。

A53T 突变在常染色体显性遗传帕金森病（PD）患者中出现频率较高。此外，当在小鼠中表达携带 A53T 突变的人源 α-突触核蛋白时，可重现人类帕金森病的多种特征6,7. 已有研究表明，α-突触核蛋白在丝氨酸129位点的磷酸化 体内 和 体外 诱导α-突触核蛋白聚集8路易小体是帕金森病（PD）或路易小体痴呆患者中典型的组织病理学发现。9路易小体中大部分的α-突触核蛋白在丝氨酸129位点被磷酸化10,11因此，磷酸化α-突触核蛋白的累积被用作帕金森病（PD）病理组织学严重程度的标志物。本研究发现，在15.5月龄有症状的小鼠中，磷酸化α-突触核蛋白的累积水平显著高于7月龄无症状的表达人源A53T α-突触核蛋白的小鼠。这一结果与已有报道一致，这些报道描述了在这些小鼠脊髓前角和中脑区域细胞病理学改变的富集现象。6 由此得出结论，本文所述的简化灌注方法可为中枢神经系统组织提供高质量的固定，适用于后续的组织学表征。

中脑、腰椎脊髓的α突触核蛋白A53T突变体荧光显微图像；PS129标记，年龄比较示意图。
图6：帕金森病小鼠模型中脑和腰段脊髓组织中磷酸化α-突触核蛋白的标记。对一只15.5月龄的终末期瘫痪小鼠与一只7月龄的健康小鼠进行比较。这两只小鼠均表达一种易于错误折叠的人源α-突触核蛋白突变体（A53T），可诱导类似帕金森病的病理变化。比例尺 = 100 µm（上排图像）和50 µm（下排图像）。缩写：α syn-A53T = α-突触核蛋白的A53T突变体；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；PS129 = α-突触核蛋白丝氨酸129位点的磷酸化。 请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

本工作描述了进行心脏灌注的关键步骤。在构建灌注装置（方案第1部分）时，重要的是使用足够柔软的管路，以便能被止血钳完全夹闭。一些较硬的管路可能无法被止血钳充分夹闭，从而在初始PBS灌注期间仍允许PFA渗入主线路。在配制4% PFA溶液时，必须确保其pH值为生理水平（7.4）。由于PFA溶液的配制过程需要将其加热至65 °C，因此在测量pH值前必须将其冷却至25 °C，因为pH计的校准是在该温度下进行的。

在进行腹部初始切口时，必须注意避免损伤腹腔器官（方案第2节）。向上分离至横膈膜时，应特别注意避免损伤肝脏，因为肝脏常与腹前壁粘连。为避免此情况，需先将肝脏从腹前壁小心地钝性分离，再继续向横膈膜方向切开。通过横膈膜进入胸腔时，应注意避免损伤心脏、大血管及肺组织。为避免损伤，应保持剪刀尖端浅层操作，并与肋骨呈锐角。

从开始切口到暴露心脏的初步解剖过程大约需要2分钟。在此期间，预计会有一些空气进入蝴蝶针的针尖。若将这些空气注入小鼠循环系统，将导致灌注质量不佳。因此，在插管心脏前，必须打开主通路，并立即用PBS冲洗针头，以去除气泡。理想情况下，应在针尖持续有少量PBS流出的状态下进行心脏插管，以确保穿刺左心室时完全无空气存在。

当针头进入左心室（LV）时，不得刺入过深，以免针尖进入右心室（RV）。若针头置于右心室或越过二尖瓣，则在开始灌注时会立即导致肺部"膨胀"，这是不理想的情况，必须将针头略微回撤以确保其位于左心室内。若针头位置正确，灌注过程中肺部将保持扁平状态。开始灌注时，有时可观察到有透明液体从动物张开的口腔中流出，这通常是由于灌注压力过高或针头在心脏内位置不当所致。作者推测，过高的灌注压力会导致灌注液从微动脉毛细血管床外渗，并经支气管树逆流进入食管和口腔。

必须通过降低PBS瓶中PBS液面高度或降低PBS瓶的位置来减小灌注压力。或者，如果针头插入左心室过深，可能会穿过二尖瓣，将灌注液送入左心房，从而导致灌注液经肺静脉逆流，并渗入小动脉，如上所述。使用PBS彻底清除循环系统中的血液尤为重要，以避免后续固定液灌注时因固定液诱导血液成分发生交联而导致血管阻塞。可通过观察肝脏颜色变化以及从尾部腹侧基部切口处流出的PBS液体颜色变化来有效评估清除效果。通常在PBS灌注3分钟后血液清除即已完成；然而，若在更短时间内已观察到明显的清除迹象，则可提前于3分钟时开始引入固定液。不建议延长清除时间，因为固定液灌注延迟会导致中枢神经系统细微结构出现人工假象1。

灌注PFA时，需密切监测PFA瓶中溶液的液面高度。当PFA液面降至距离PFA瓶口不足4 cm时，应及时补充。灌注完成后，必须用蒸馏水彻底冲洗灌注装置。这一点至关重要，因为主管路中残留的PFA会污染后续的初始PBS灌注液，导致灌注质量下降。 通常建议对体重在20–30 g范围内的普通成年小鼠使用25 G蝶形针。然而，对于体型较大或较小的小鼠，可能需要适当调整针头规格（即使用稍粗或稍细的针头），并相应调节固定液瓶的高度，以获得最佳的灌注流速。

对于中枢神经系统解剖和OCT包埋（方案第3部分），脊髓组织在30%蔗糖溶液中通常无法完全沉底。因此，无论组织是否沉底，均将其在蔗糖溶液中放置2天后进行OCT包埋。当在OCT中冷冻组织时，某些组织在放入冷却的2-甲基丁烷中可能会出现开裂。这种情况在脑组织中更为常见，通常是由于在组织上使用了过多的OCT所致。为避免此问题，在立即冷冻前仅需使用足以覆盖组织表面的OCT量即可。在某些方案中，即使组织完全浸没于OCT中，开裂现象也较少发生，这通常是由于采用了较慢的冷冻方法，例如使用干冰冷却的2-甲基丁烷或将冷冻模具直接放置在干冰块上。本研究中优先选用液氮冷却的2-甲基丁烷，因其冷冻速度显著更快，可能比慢速冷冻方法更有利于保持组织形态。

在进行组织冷冻切片（方案第4部分）时，应避免多次冻融循环。因此，最佳做法是从单个OCT包埋块中切下所有切片，以获取特定脑区用于分析，而不是反复冻融选定区域。如果无法实现这一点，用户在获得若干切片后，可将OCT包埋块重新冷冻，并在-80 °C超低温冰箱中保存1至2次，以供后续使用。

与更传统的泵或气压灌注液输送方法相比，本方法的主要优势如下：（1）灌注装置成本低且易于获取；（2）使用者在整个灌注过程中无需手动维持灌注装置内的压力；（3）相较于其他低成本灌注方式（如注射器推注），本法的灌注压力更低且更稳定。根据伯努利方程计算，当灌注液瓶相对于针头抬高1 m时，本实验构建的重力驱动灌注装置可维持约73 mm Hg的灌注压力。由于该压力显著低于这些动物的收缩压，因此足以避免血管破裂12。

研究人员已成功利用该灌注系统在帕金森病小鼠模型中检测到磷酸化α-突触核蛋白的存在。在此期间，该灌注方法并未出现除泵灌注递送方法本身固有的问题之外的显著局限性。该技术的主要局限在于，与滴注固定相比，灌注过程较为耗时。然而，由于灌注能使固定剂更深入地渗透至中枢神经系统结构，因此该方法优于滴注固定。该技术的第二个局限是操作需要一定的外科技能，因为在打开胸腔后必须迅速完成心脏插管。不过，经过训练的操作人员在积累经验后，通常可在腹部初始切口后1分钟内完成心脏插管。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

作者感谢王晓雯、Liam Coyne 和 Jason Grullon 在本方案开发过程中提供的帮助。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 AG061204 和 AG063499。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-甲基丁烷（ACS认证），Fisher ChemicalFisher Scientific03551-4
Andwin Scientific Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂Fisher ScientificNC1029572
Artman Instruments 4.5" 直型卡斯特罗维霍弹簧剪亚马逊B0752XHK2X"精细剪刀"
BD通用型与PrecisionGlide皮下注射针头，18 GFisher Scientific14-826-5D
BD通用型与PrecisionGlide皮下注射针头，22 GFisher Scientific14-826B
康宁PES针筒式滤器Fisher Scientific09-754-29
Cytiva HyClone 磷酸盐缓冲液（PBS），10 倍浓缩液Fisher ScientificSH30258
Falcon 50 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific14-432-22
Fisher BioReagents 牛血清白蛋白（BSA）无蛋白酶粉末Fisher ScientificBP9703100
Fisherbrand 弯头中等尖端通用镊子Fisher Scientific16-100-110"弯头有孔镊"
Fisherbrand 弯曲超细精密尖头镊Fisher Scientific16-100-123"弯头精细镊"
Fisherbrand 一次性刻度移液管Fisher Scientific13-711-9AM
Fisherbrand 高精度直头超细尖镊子/钳子Fisher Scientific12-000-122"直头精细镊子"
Fisherbrand 圆头微量刮勺Fisher Scientific21-401-5
Fisherbrand 瓷质布氏漏斗（带固定式穿孔板）Fisher ScientificFB966J
Fisherbrand 优质盖玻片，24 x 50Fisher Scientific12-548-5M
Fisherbrand 优质组织镊，1×2 齿，5 英寸，德国钢Fisher Scientific13-820-074"皮肤镊"
Fisherbrand 可重复使用厚壁过滤瓶Fisher ScientificFB3002000
Fisherbrand 标准解剖剪Fisher Scientific08-951-20"解剖剪"
Fisherbrand 一次性无菌注射器Fisher Scientific14-955-464
Fisherbrand 直型锁扣式止血钳Fisher Scientific16-100-115
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15
Fisherbrand 乙烯基管路和连接器套装，1/4 英寸Fisher Scientific14-174-1C
Fisherbrand 湿强定性滤纸圆片Fisher Scientific09-790-12F
Fisherbrand Y型连接器，内径1/4英寸 - 聚丙烯 - 质量控制Fisher Scientific01-000-686
加维经济型单刃切割刀片亚马逊B001GXFAEQ
山羊抗兔IgG（H+L）二抗，DyLight 488赛默飞世尔科技35552
理想钳 Stant 高压夹具Fisher Scientific14-198-5A"软管夹"
IMEB公司 Sakura Accu-Edge低剖面一次性切片刀片Fisher ScientificNC9822467
Kawasumi 25 号标准带翼采血套装Fisher Scientific22-010-137"蝴蝶针"
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 一次性擦拭纸（单层）Fisher Scientific06-666
含DAPI的Molecular Probes ProLong Diamond抗荧光淬灭封片剂Fisher ScientificP36962
Nalgene 窄口 Right-to-Know LDPE 洗瓶赛默飞世尔科技2425-0506"缓冲液瓶"
PAP笔abcamab2601
多聚甲醛颗粒电子显微镜系统19210
Pyrex 玻璃干燥皿，34.9 x 24.9 x 6 cmFisher Scientific15-242D
重组抗α-突触核蛋白（磷酸化 S129）抗体 [EP1536Y]abcamab51253
氢氧化钠Sigma-Aldrich221465-2.5kg
18盎司不锈钢饮水杯亚马逊B0039PPO9U
蔗糖（分子生物学级）CAS：57-50-1Us BiologicalS8010
Triton X-100Us BiologicalT8655
Vetone Fluriso 异氟烷 USPMWI动物健康502017

参考文献

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一种用于小鼠中枢神经系统组织学分析的重力驱动经心灌注方法
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