药物性肝损伤（DILI）是导致药物研发失败的主要原因之一。目前已开发出一种利用肝脏微生理系统（MPS）准确预测化合物DILI风险的实验方案。该肝脏模型通过原代肝细胞的共培养体系，并结合具有临床转化意义的检测终点，评估细胞对药物处理的反应。
本文内容
摘要
摘要
药物性肝损伤（DILI）是导致药物研发失败的主要原因之一，目前已知有超过1000种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物可能在人体中引发DILI。遗憾的是，DILI通常直到药物进入临床阶段后才被发现，这不仅威胁患者安全，也给制药行业带来巨大经济损失。考虑到标准的二维（2D）模型在检测DILI方面存在局限性，开发更具预测能力的体外模型以提高数据的可转化性显得尤为重要。为了深入理解DILI的因果关系及其作用机制，已开发出一种由人原代肝实质细胞和非实质细胞（NPCs）组成的人肝类器官模型，该模型在工程化支架上以三维微组织形式培养，并在灌注条件下维持。在该MPS平台上，将冻存的人原代肝细胞（PHHs）和库普弗细胞（HKCs）共培养为微组织，最长可达两周时间；针对每种目标化合物，在最多四天内以七种测试浓度重复给药。通过分析肝脏特异性功能终点指标（包括丙氨酸氨基转移酶等临床生物标志物ALT），评估肝脏功能。通过比较单次给药与多次给药微组织的反应，可评估不同DILI严重程度化合物的急性和慢性暴露效应。该方法已使用一系列强肝毒性和弱肝毒性化合物进行了验证。本文展示了吡格列酮和曲格列酮的数据，这两种化合物因导致肝功能衰竭而被撤市，是广为人知的肝毒性药物。总体而言，研究表明肝脏MPS模型可作为评估DILI及其与肝功能变化关联性的有效工具。此外，该模型还可用于评估新化合物在不同患者亚群中的表现，以及肝脏疾病状态（如病毒性肝炎、脂肪肝疾病）对毒性特征的影响。
引言
药物性肝损伤（DILI）仍是美国和欧洲急性肝衰竭最常见的原因，也是药物研发过程中化合物被淘汰的主要原因之一1。几乎所有类别的药物都可能引起肝毒性，其中中枢神经系统药物和抗生素是导致患者发生DILI的最常见治疗药物2。药物诱导的肝毒性由遗传因素、非遗传因素及环境因素之间的复杂相互作用引起，可导致肝细胞及其他肝内细胞类型（包括胆管上皮细胞和内皮细胞）的死亡1,3。
导致药物性肝损伤（DILI）的药物可通过两种方式进行分类：一类是引起可预测的、剂量依赖性肝损伤的药物，另一类是引起特异质性DILI的药物，后者较为罕见，且与药物剂量、给药途径或用药持续时间无关，但仅在美国就占所有急性肝衰竭病例的六分之一4。遗憾的是，DILI通常直到药物进入药物研发的临床阶段后才被发现。药物性肝损伤风险分级（DILIrank）包含一千多种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物，根据其引发DILI的潜在风险分为四类，这些药物在患者中的使用必须进行严密监测5。
研究药物性肝毒性的机制仍然极具挑战性，因此已开发出多种临床前模型用于探索药物性肝损伤（DILI）的机制。目前 体外 和 体内 在临床前开发阶段用于预测药物性肝损伤（DILI）的模型在揭示活体人体内复杂且多因素相互作用方面存在多种局限性。目前在药物研发早期阶段，仍采用二维培养的肝癌细胞系（如 HepG2、HepaRG）来评估候选化合物的毒性6然而，这些细胞系来源于单一供体，表现出异常的肝功能水平，并不总是对药物性肝损伤（DILI）的检测具有高敏感性。7,8与癌源性肝细胞系相比，原代人肝细胞（PHHs）在适当培养条件下能更真实地反映人类肝脏的生理特性 体外，尽管其培养存在一些局限性，如药物孵育时间短、寿命相对较短、肝基因表达下降以及药物代谢功能的改变9,10,11原代人肝细胞（PHHs）可在标准的二维细胞培养板中接种于细胞外基质蛋白上进行培养，但其缺点是细胞功能迅速下降，导致敏感性较低<50%）用于药物性肝损伤（DILI）预测12.
另一方面，在动物模型上进行测试速度慢、成本高，且需要跨物种推断才能将预测结果外推至人类。大多数新开发的药物未能获得批准，使得这一过程既昂贵又充满风险5。此外，由于基因序列或免疫反应与人类存在差异，动物模型在测试新型人源特异性治疗手段时适用性较低13。
因此，人们对更先进的三维（3D）技术的兴趣日益增加 体外 肝脏模型的数量呈指数级增长。将原代人肝细胞（PHHs）在悬滴中或超低吸附表面通过重力聚集形成球状结构进行培养，是一种用于评估化合物毒性的高通量方法。14. 人原代肝细胞球状体已被用于评估疾病背景下（如脂肪变性和胆汁淤积）的药物性肝损伤（DILI）15已开发出多种模型，包括肝细胞与基质成纤维细胞的微图案化共培养体系163D生物打印肝脏组织17，含或不含肝非实质细胞的3D球状体培养15然而，所有这些方法仍然存在缺点，而在更接近生理条件的微环境中培养原代人肝细胞（PHHs），可使其在较长时间内维持更高水平的功能，从而能够研究潜在肝毒性物质的长期暴露效应。此外，为了提高任何先进模型的转化应用价值 体外 原代人肝细胞（PHH）培养中，必须利用临床相关的功能性终点或毒性输出生物标志物，以实现数据的可比性 体内 或临床场景18.
在本研究中，我们评估了一种微生理系统（MPS），也称为器官芯片（Organ-on-a-Chip，OOC）， 体外 肝脏模型可用于深入理解肝毒性的详细作用机制。该微生理系统（MPS）此前已被证明可在流动条件下维持高度功能化的三维肝微组织长达4周。19该系统近期已通过美国食品药品监督管理局（FDA）测试，在进行药物毒性、代谢和细胞内蓄积实验时表现出高度的可重复性20此外，与球状体和夹心培养相比，该系统在检测多种药物毒性方面具有更稳定的功能和更高的敏感性20迄今为止，MPS 已被广泛应用于涵盖 ADME 的多个领域21疾病建模（HBV22, 非酒精性脂肪性肝病23,24,25，以及药物-药物相互作用26，可能非常适用于评估急性和慢性药物性肝损伤（DILI）。本文介绍的技术为弥补传统细胞培养、动物模型与人体临床试验之间的差距提供了替代方案，推动在药物研发的临床前阶段更真实地模拟人体生物学条件，以支持对候选化合物肝毒性的评估。
方案
所有工作均在实验室中进行，遵循严格的健康与安全规程，并符合实验室自身的风险评估和标准操作程序（SOP）。所使用的所有设备均按照制造商指南进行维护。微生物安全柜（MBSCs）每年进行一次维护，并依据英国标准进行碘化钾（Ki-Discus）测试。本方案遵循英国人类组织管理局（HTA）的实践规范和指导文件，使用由供应商提供的伦理来源的原代人类细胞，这些供应商完全符合知情同意的一般要求（45 CFR §46.116 和 §46.117）以及《良好临床实践》（GLP，ICH E6）和相关监管机构与伦理委员会的规定。
1. 准备细胞培养基
注意：在第 -1 天配制接种用高级 DMEM 培养基，并于 4 °C 保存。在第 1 天配制维持用高级 DMEM 培养基，并于 4 °C 保存，最多可保存 1 周。
- 用于PHHs和HKCs共培养的接种用Advanced DMEM培养基：向一瓶500 mL的Advanced DMEM培养基（材料表）中加入18 mL Cocktail A（终浓度为3.6%）和25 mL胎牛血清（FBS）（终浓度为5%）。
- 用于PHHs和HKCs共培养的维持用Advanced DMEM培养基：向一瓶500 mL的Advanced DMEM培养基（材料表）中加入20 mL Cocktail B（终浓度为4%）和500 nM氢化可的松。
注：氢化可的松需在使用当天新鲜配制，其母液及所需稀释液的配制步骤如下所述。 - 在维持用Advanced DMEM培养基中配制500 nM氢化可的松溶液
- 起始母液（20 mM）的配制：将7.24 mg氢化可的松（材料表）称取至一个1 mL玻璃小瓶中。记录实际称量的氢化可的松质量，并根据以下公式计算所需二甲基亚砜（DMSO）的体积：
- 工作用100 μM氢化可的松母液的配制：取5 µL上述20 mM起始母液加入995 μL Advanced DMEM培养基中。
注：将步骤1中的25 µL DMSO溶液稀释于水或培养基中，DMSO终浓度为0.5%。在最终溶液中，DMSO浓度为0.0025%。在此情况下，额外加入的5 µL体积对总体积的影响可忽略不计。 - 在Advanced DMEM培养基中配制工作用500 nM氢化可的松溶液：为配制1 mL含500 nM氢化可的松的Advanced DMEM溶液，将5 μL 100 μM氢化可的松母液加入995 μL维持用Advanced DMEM培养基中。
- 起始母液（20 mM）的配制：将7.24 mg氢化可的松（材料表）称取至一个1 mL玻璃小瓶中。记录实际称量的氢化可的松质量，并根据以下公式计算所需二甲基亚砜（DMSO）的体积：
2. MPS 系统的设置与预处理（第 -1 天）
- 将控制器连接至细胞培养箱内的对接站机箱，并确保已在控制器后部的干燥剂罐中加入新的干燥剂（材料表）。
注意：控制器会随着时间从培养箱中吸收湿气，需使用新的干燥剂保持其内部干燥。 - 按下控制器后方的船型摇杆开关，将控制器开启，等待5分钟使系统稳定并达到压力。随后检查屏幕上的气动报告，确认：(i) 压力储罐输出值达到约2000 mBar，(ii) 真空储罐输出值达到约850 mBar。
- 从包装中取出每块培养板，目视检查每个孔是否存在可能的缺陷（如支架缺失、裂纹等）。
- 将装有培养板的驱动器插入对接站，确认驱动器已被对接站和控制器识别。检查压力储罐输出值下降小于100 mBar，真空储罐输出值上升小于500 mBar。
- 通过向储液侧加入500 µL预热至37 °C的接种用高级DMEM培养基，对每个孔进行预润。
- 在控制器屏幕上选择预润程序（以2.5 µL/s的流速向上流动3分钟），直至液体穿过滤膜支撑结构。注意：“向上流动”是控制器上的一个设定，允许培养基从储液侧向上流经LC12培养板中的支架。
- 向所有孔中再加入1.1 mL接种用高级DMEM培养基，以覆盖表面通道。此时所有孔的总体积将达到1.6 mL的工作体积。
- 将装有培养板的驱动器放入37 °C、5% CO2的培养箱中，连接至对接站，并运行孵育程序。
注意：实验中使用的所有程序（预润、孵育、接种、换液）均已预先设定在MPS系统中。在准备接种前，持续在培养箱中对培养板执行预润程序。
3. 将肝细胞接种至MPS中（第0天）
- 对所有 PHHS 和 HKCs 进行预验证。在开展细胞培养实验前，所有 PHHs 和 HKCs 批次均需在内部完成预验证（参见 补充材料）。
- 将 PHHs 和 HKCs 细胞冻存管（材料表）置于 37 °C 水浴中，稳定持握，直至仅剩少量冰晶残留时停止。
- 将 PHHs 直接用移液器转移至含有预热（37 °C）的冷冻保存肝细胞复苏培养基（CHRM）的离心管中（每管最多加入两支冻存管的细胞）。
- 轻柔移液，随后用 1 mL CHRM 冲洗冻存管内残留的细胞。解冻及转移至锥形管过程中需格外轻柔对待细胞。
警告：解冻过程中切勿震荡冻存管，且不得反复吹打内容物。 - 将 HKCs 细胞从冻存管中轻柔移液至含有 10 mL 冰冷接种用高级 DMEM 培养基的 15 mL 离心管中。
注意：最多可合并两支 HKCs 冻存管的细胞。 - 将两种细胞均在室温（RT）下以 100 × g 离心 10 分钟，随后弃去上清液。
- 使用 1 mL/冻存管的接种量，将 PHHs 重悬于温热的接种用高级 DMEM 培养基中，HKCs 重悬于冰冷的接种用高级 DMEM 培养基中（以减少细胞聚集），并将细胞置于冰上。采用轻柔摇动方式重悬细胞。
警告：切勿通过移液操作重悬 PHHs，以免导致细胞死亡。 - 可将来自多个离心管的细胞悬液合并（如适用，即所有 PHHs 来自同一供体），但不得混合不同类型的细胞。
- 进行细胞计数。记录细胞活力（两种细胞类型 PHHs 和 HKCs 的活力均须高于 85%）及总细胞数量。若细胞活力低于 85%，则需重新解冻新一管细胞并重新评估细胞活力。
- 使用以下公式计算细胞活力：
- 计算每孔所需接种的细胞悬液体积，以及为使总接种体积达到 400 µL 所需额外添加的接种用高级 DMEM 培养基体积。每孔细胞数量：PHHs 为 0.4 × 106，HKCs 为 0.04 × 106；细胞密度分别为 PHHs 0.25 × 106 个/mL，HKCs 0.025 × 106 个/mL。
- 将驱动器从对接站断开，并将其放回 MBSC 中。
- 将上述支架上方的培养基吸除至停止点（沿固定环深凹槽处），同时吸除通道和储液区中的培养基。在培养孔中保留 0.2 mL 的“死体积”，使液面略高于支架。操作时需注意避免将支架上方的培养基完全吸除，以防产生气泡。
- 向孔腔中加入 400 µL 接种用高级 DMEM 培养基，将驱动器放回培养箱内的对接站，并运行 换液 程序 3 分钟。程序将在 3 分钟后自动暂停。
- 程序完成后，将驱动器从对接站断开，并放回 MBSC 中。
- 将支架上方的培养基吸除至停止点，并吸除每孔储液端的培养基。
- 轻柔摇动离心管使 PHHs 充分重悬，随后将所需体积的细胞悬液加入各培养孔中。小心移液，确保细胞在支架表面均匀分布。
注意：为确保支架各区域覆盖良好，应缓慢旋转移液，使细胞均匀沉降于支架上。 - 同样，轻柔重悬 HKCs 并将细胞悬液加入各培养孔中。
注意：应采用缓慢旋转移液方式接种 HKCs，以确保支架各区域覆盖良好。这两个接种步骤可分别进行，也可将两种细胞按适当密度预先混合后同时接种。 - 当所有孔中均含有两种细胞后，将 MPS 驱动器置于培养箱内的对接站上（不进行物理连接），静置 1 小时。
- 1 小时后，向每孔中加入适量额外的接种用高级 DMEM 培养基，使总体积达到 400 μL，并运行 接种 程序。
- 2 分钟后，程序将自动暂停。从培养箱中取出驱动器，缓慢向通道中（靠近储液端而非孔腔端）加入 1000 µL 接种用高级 DMEM 培养基，使总体积达到 1.4 mL（通道中另含 200 µL 死体积）。
- 将培养板转移至培养箱，继续运行 接种 程序剩余的 8 小时。
注意：8 小时后，流体将自动切换至孵育程序。
4. 更换培养基（第1天）
- 将驱动器从对接站断开，并放入 MBSC 中。
- 执行换液操作，将小室腔中的接种用 Advanced DMEM 培养基移除至停滞点。
- 向小室腔中加入 400 µL 维持用 Advanced DMEM 培养基，将驱动器放回培养箱内的对接站，并运行换液程序 3 分钟。程序将在 3 分钟后自动暂停。
- 将驱动器从对接站断开，在 MBSC 中，吸除储液腔、通道以及支架上方停滞点处的培养基。此时，培养小室将恢复至死体积状态。
- 用 1.4 mL 新鲜预热（37 °C）的维持用 Advanced DMEM 培养基补满储液腔。
- 将驱动器放回培养箱内的对接站，并运行孵育程序。
5. 肝微组织质量控制（QC）、培养基收集、换液及药物处理（第4天）
- 第4天使用维持型高糖DMEM培养基进行换液，并进行质量控制（QC）检测，以确认接种成功。
注意：QC是通过检测乳酸脱氢酶（LDH）和尿素水平来评估微组织健康状态的过程。 - 在进行QC检测前，为每种待测化合物配制新鲜的母液（根据化合物的溶解度，使用维持型高糖DMEM培养基或含0.1% DMSO的维持型高糖DMEM培养基），并按需稀释至各化合物的测试浓度。
- 将驱动器和培养板从对接站取下，转移至MBSC中。
- 使用移液器从每个孔中转移50 µL培养基至96孔板，用于LDH检测（材料表）；另取25 µL用于尿素检测（材料表）。
注意：LDH和尿素检测应按照试剂盒制造商的说明进行。 - 若LDH读数低于2 AU/106细胞，且尿素产量高于40 µg/天/106细胞，则继续实验。
注意：白蛋白不作为QC指标，因其检测耗时较长，将在实验结束后，利用第4天采集的样品进行检测。 - 若任何孔未通过QC检测，应将其从实验设计中剔除。
- 确认实验分组后，收集各孔中剩余的培养基，注意避免触碰支架而干扰细胞培养。将收集的培养基（标记为给药前样品）于-80 °C保存，用于后续检测。
- 在MBSC中按照步骤4.3–4.5执行换液操作，根据实验设计将各孔更换为含有相应药物浓度的维持型高糖DMEM培养基。
- 操作完成后，将驱动器放回培养箱内的对接站，并运行孵育程序。
6. 培养基收集、换液及药物处理（第6天）
- 为每种待测化合物配制新鲜的储备液（根据各化合物的溶解度，使用基础维持培养基或含0.1% DMSO的基础维持培养基）。根据板图将储备液进行相应稀释，以获得每种化合物的测试浓度。
- 将驱动器和培养板从对接站上取下，转移至MBSC中。
- 使用移液器手动从每个孔中收集培养基（约1 mL），注意避免触碰支架而扰动细胞培养物；收集的样品用于LDH和尿素检测。剩余的培养基储存于-80 °C，用于后续检测，并标记为给药后48小时样品。
- 按照板图，使用与第4天相同的药物浓度，通过执行Media Change步骤4.3–4.5，对每个孔重新给药。
- 操作完成后，将驱动器放回培养箱内的对接站，并运行Incubate 程序。
7. 结束实验（第8天）
- 将驱动器和培养板从对接站上断开，并转移至MBSC。
- 使用移液器手动从每个孔中取样培养基，注意避免触碰支架，以免干扰细胞培养。
- 检测吸取的培养基中的LDH和尿素，并将剩余收集的培养基在-80℃保存80 °C 用于后续检测。
- 进行 CYP3A4-glo 检测
- 使用该检测方法在实验结束时测定受试药物对原代人肝细胞中细胞色素P450 CYP3A4活性的影响。
- 重悬检测试剂（用于CYP3A4检测，参见 材料表）按照制造商的说明进行操作。如果检测试剂 previously 已经被重悬并冷冻，请将其从 -20 °C 冷冻机中取出并在室温下解冻。
- 按照制造商说明配制 20 mM 的 D-荧光素储备标准品。
- 在维持用Advanced DMEM培养基中按1:1000比例稀释Luciferin IPA，配制发光底物工作液（每孔2 mL）。
- 执行 更换培养基 如步骤4.3–4.5所述，使用发光底物培养基。保存 500 µL 1.5 mL 玻璃小瓶中的发光底物培养基材料表作为输入材料。
- 将驱动器放回培养箱内的对接站并运行 孵育 程序运行1.5 h。
- 按照说明书在1.5 mL离心管中用培养基配制D-荧光素标准曲线，并用移液器移取 50 µL 在白色不透明96孔板中，每种标准品设两个复孔（参见 材料表），以培养基作为空白对照或 0 µM.
- 时间结束后，将驱动器从对接站中取出，并按照步骤 7.4.9–7.4.13 采集样品培养基用于 CYP3A4 检测。
- 孵育后，转移 50 µL 从每个孔中取出样品培养基，并将输入材料加入含有标准品的96孔不透明白色发光检测板中。注意在不透明板上的标准品与样品之间至少保留两行空白孔，以避免最高浓度标准品与样品读数之间的光信号交叉干扰。
- 添加 50 µL 向每个孔中加入荧光素检测试剂以启动发光反应。
- 在室温下将酶标板置于摇床上避光孵育20分钟，以稳定发光信号。
- 使用光度计或CCD相机记录发光信号。
- 通过取每个点的平均值，然后减去空白孔的平均值，绘制标准曲线。利用直线方程计算代谢速率（pmol/min/106 细胞）在其余样品中的数量，记得计入所有已进行的稀释倍数。
- 使用镊子将支架从培养板中取出，并放入含有 500 µL 每孔加入 D-PBS（不含 Ca++ 和 Mg++），注意不要扰动微组织。
- 使用倒置光学显微镜在10倍放大倍数下拍摄每个支架的图像。
- 运行ATP检测实验（参见 材料列表按照制造商的说明进行：
- 在室温下解冻试剂。
- 用缓冲液将支架清洗两次 500 µL 每次洗涤步骤使用 D-PBS（不含 Ca++ 和 Mg++）。
- 添加 120 μL 试剂的 120 μL 向每个支架加入 PBS，并向空孔中加入相同体积的 PBS（作为空白对照）。将培养板用铝箔覆盖后置于摇床上，剧烈振荡（500 rpm）5 分钟，随后孵育 30 分钟以稳定发光信号。
- 转移 100 μL 将裂解后的样品重复取两份，加入至透明平底96孔检测板中用于测定。确保空白孔不与高发光信号的检测孔相邻放置。
- 使用酶标仪记录发光信号。
- 将样品的发光强度与标准品的发光强度进行比较，以确定试剂在样品中检测到的ATP含量。
结果
该论文描述了一种用于评估药物性肝损伤（DILI）的肝脏类器官微生理系统（MPS）模型。该MPS系统可生成在流动条件下维持长达4周高度功能性的三维肝微组织。将原代人肝细胞（PHHs）/人肝细胞（HKCs）接种于胶原涂层支架上形成肝微组织，并用生长培养基灌注；通过质量控制（QC）检测后，对微组织施加药物处理。本文展示了曲格列酮和吡格列酮的数据，这两种化合物结构相似，但DILI严重程度不同。
在第4天给药前，对形成的肝微组织进行质量控制检测，包括乳酸脱氢酶（LDH）释放和尿素合成（图1A）。该质量控制旨在确认肝类器官系统能够生成高度一致且功能良好的肝微组织。此处展示的数据来自三次实验，显示出良好的可重复性，且实验内和实验间变异度较低。经过8天培养后，检测多项健康和肝功能指标（白蛋白、尿素、CYP3A4、ATP），对照微组织表现出高水平的肝功能活性和可重复性（图1B、C）。相差显微镜观察及肝微组织的免疫荧光染色（见补充材料）显示，细胞在支架微通道内的接种具有一致性，并揭示了HKCs在PHH微组织中的分布情况（图1D）
图1：肝脏MPS可生成高度可重复的数据和一致的微组织。（A）第4天的3D肝脏微组织质量控制指标，以及在第8天研究结束时的功能评估——（B）白蛋白和尿素，（C）CYP3A4和ATP。数据来自3次实验；每次实验包含3个溶剂对照重复组。所示数据为均值±标准差，N = 9。（D）相差显微镜图像（10倍和20倍）及免疫荧光图像，显示在肝脏MPS平台上通过共培养PHHs与HKCs生成的3D肝脏微组织，用于评估药物性肝损伤（DILI）。为可视化HKCs，在接种前使用表达eGFP的腺病毒载体转导HKCs（见补充材料）。图中展示代表性显微照片。转导与成像作为独立实验进行，以证明细胞定位，并未纳入本文所述的DILI实验方案。HKCs在用于实验性细胞培养前均经过实验室内部预先验证，必须具有较低的解冻后活化水平；该指标通过检测生物标志物IL-6和TNF-α来评估。请点击此处查看该图的放大版本。
曲格列酮已知可导致严重的药物性肝损伤（DILI）；在获批用于治疗2型糖尿病后，由于其使用相关肝损伤发生率较高，美国食品药品监督管理局（FDA）在该药上市3年后将其撤市。迄今为止，已发表的动物研究未能预测曲格列酮引发严重肝损伤的潜在风险。该化合物的毒性在标准实验中也未被检出 体外 二维肝细胞检测14.
在MPS中，肝脏微组织经曲格列酮处理96小时后出现急性毒性反应，该反应由Cmax驱动，在约15倍Cmax浓度下即可通过丙氨酸氨基转移酶（ALT）和乳酸脱氢酶（LDH）的释放以及白蛋白和尿素生成的迅速减少检测到（图2A）。在暴露96小时后取样检测的细胞终点（ATP含量）和CYP3A4活性（用于评估代谢生物转化）进一步证实了曲格列酮引起的毒性，其EC:50值与其他终点高度一致（图2B）。在MPS中培养8天后拍摄的明场显微镜图像显示，对照组（溶剂对照）肝脏微组织健康，细胞在支架内均匀分布；相比之下，阳性对照组及高两个测试浓度的曲格列酮处理组则出现广泛的组织死亡或降解（图2C）。
图 2：利用多种肝毒性终点评估曲格列酮的药物性肝损伤（DILI）风险。 肝微组织暴露于七种不同浓度的曲格列酮中96小时，并检测（A）LDH释放、ALT释放、白蛋白生成、尿素合成、CYP3A4活性和ATP含量。蓝色线条表示48小时暴露（仅培养基终点），红色线条表示96小时暴露。阳性对照为100 μM氯丙嗪。所有终点均来自相同的肝类器官（MPS）培养物。数据显示为均值±标准差，N = 3。（B）由数据生成的E:50数值汇总。N.D. = 数据无法作图；线条 = 未检测。（C）肝微组织在8天培养后的代表性明场显微镜图像（放大倍数10x）。请点击此处查看该图的放大版本。
还研究了吡格列酮暴露后引起的肝毒性。吡格列酮是一种已知引起药物性肝损伤（DILI）风险较低的化合物。4 在经典的二维原代肝细胞培养中未表现出肝毒性，甚至在一些更先进的三维模型中也是如此10, 11在两个测试时间点均观察到轻微的肝毒性作用（图3）。未检测到LDH或ALT释放；然而，在48 h后观察到白蛋白和尿素生成轻度减少，约为25倍C最大值 (图 3A）。在高浓度吡格列酮下也观察到ATP含量略有降低，但无显著性差异。剂量-反应曲线所得的EC50值如下所示 图3B显微镜观察显示，在最高两个测试浓度的吡格列酮暴露96小时后，微组织出现轻微改变（图3C结果表明，肝脏微生理系统（MPS）能够检测具有轻度药物性肝损伤（DILI）风险化合物的毒性。
图3：使用多种肝毒性终点评估吡格列酮的药物性肝损伤风险。 肝脏微组织经七种不同浓度的吡格列酮处理96小时后进行比较（ALDH 释放、ALT 释放、白蛋白生成、尿素合成、CYP3A4 活性及 ATP 含量。蓝色线条表示 48 小时暴露（仅培养基终点），红色线条表示 96 小时暴露。阳性对照为 100 μM 氯丙嗪。所有终点指标均来自相同的肝脏MPS培养物。所示数据为均值 ± 标准差，N = 3。 (B) 根据数据生成的EC:50数值汇总。N.D. = 数据无法作图。Line = 未进行检测。C8天培养后肝微组织的代表性明场显微镜图像（放大倍数10倍）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
通过评估所有可能代表功能终点和毒性输出生物标志物的指标 体内 或临床情况（LDH释放、尿素合成、白蛋白生成、CYP3A4活性、ATP含量、ALT释放），并通过验证两种受试化合物在七点剂量范围内分别作用48小时和96小时所生成的数据，已绘制热图以获得“肝毒性特征图谱”，有助于识别具有不同程度药物性肝损伤（DILI）风险的化合物（图4).
图4：利用肝脏MPS确定“毒性特征”。 热图显示了曲格列酮和吡格列酮在七点剂量范围内暴露48小时和96小时后，六个功能性肝脏特异性终点指标（LDH释放、尿素合成、白蛋白生成、ALT释放、CYP3A4活性和ATP含量）的变化情况。每个数值均为均值（N = 3），并相对于对照样本进行归一化处理。颜色条上的数值表示相对于基线对照的倍数增加。请点击此处查看该图的放大版本。
补充材料：微组织的荧光显微镜成像及细胞的预筛选评估。 请点击此处下载该文件。
讨论
MPS 旨在模拟人体器官的功能单元 体外 并已开发用于解决传统三维细胞培养模型的局限性27肝脏是使用微生理系统（MPS）建模最为广泛的器官之一，已开发出多种多样的系统。人类肝脏负责药物代谢以及有毒药物代谢产物的生成，其功能是药物开发中建模的关键要素，包括对化合物药物性肝损伤（DILI）风险的评估。28在此，我们介绍了一种利用肝脏微生理系统（MPS）评估药物性肝损伤（DILI）的新方法；该方案不仅具有高度敏感性和稳健性，还可针对每种受试化合物提供机制层面的深入分析，以确定其引发DILI的潜在机制。在MPS培养板中形成的肝脏微组织由原代人肝细胞（PHH）和人肝库普弗细胞（HKCs）共培养构成，功能高度活跃，表现出高水平的白蛋白和尿素生成能力，以及相较于标准培养条件下显著更高的CYP3A4活性。 体外 肝脏模型20.
尽管本文所述的药物性肝损伤（DILI）模型在药物研发过程的临床前后期阶段可作为一种有用的工具，但也存在若干局限性。与目前市场上大多数微生理系统（MPS）一样，该模型属于低通量平台，因此在大规模药物筛选应用中使用较为困难。该DILI模型由原代人肝细胞（PHHs）和人肾小管上皮细胞（HKCs）共培养形成的微组织构成，仍无法完全模拟人肝脏的复杂性；若进一步优化，引入其他类型细胞（如免疫细胞），将有助于提升现有模型的价值。此外，这种单器官MPS还可与其他可共享培养基、并能在细胞或内分泌水平实现器官间相互作用的器官平台联用，从而有助于更深入地理解毒性机制，而不仅局限于肝脏本身的毒性。此外，作为一种相对较新的技术，该模型可能成本较高，因而可及性有限。
MPS 是一种用于构建单个人体组织或多种人体组织类器官模型的平台。该系统由控制器、脐带电缆和MPS驱动器组成，其中MPS驱动器用于插入培养板（图5A）。每块肝脏MPS板包含12个独立的开放式微孔，可用于在工程化支架上三维培养原代肝细胞。简要而言，系统首先经过质量控制（QC）检测，在第-1天对培养板进行预处理；在第0天将PHHs和HKCs接种至培养板上（图5B，见1）。嵌入式微泵可推动细胞培养基流经支架，从而促进三维微组织的形成（图5B，见2）。在第4天对形成的微组织进行质量控制检测，随后每隔48小时给予不同浓度的待测化合物，持续给药4天，并于第8天检测终点生物标志物（图5C）。MPS培养板中DILI检测的实验时间线如图5D所示。
图 5：微型生理系统及标准药物性肝损伤（DILI）检测的实验时间线。（A）微型生理系统及其组件：控制器（1）、脐带电缆（2）、对接站（3）、MPS驱动器（4）和LC12板（5）。（B）第1天在LC12板上接种原代人肝细胞（PHHs）和人肾细胞（HKCs）（1），嵌入式微泵可促进培养基在支架上接种的3D微组织中以可调流速循环（2）。（C）研究结束时取出支架。（D）实验时间线。请点击此处查看该图的放大版本。
进行该实验方案时，启动前必须执行严格的系统质控检查，确认系统气动功能正常，并对耗材板进行目视检查和高效预润洗，以确保所有孔的功能均一。高质量的原代人源细胞对该方案至关重要，其中肝细胞在细胞培养实验中具有稳定的贴壁特性，并能形成三维相互作用。解冻这些细胞也是一个关键步骤，因为原代肝细胞不应通过移液操作进行重悬，否则会迅速导致细胞死亡。细胞活力需高于85%，这是成功接种的关键，大量细胞碎片将干扰三维微组织的形成。在第4天对形成的肝微组织进行质控检查同样重要，操作者需确保乳酸脱氢酶（LDH）和尿素的检测值处于可接受范围内，因为超出正常范围的参数可能提示组织形成质量不佳，便于及时排查问题。最后，细胞培养基中使用的氢化可的松必须在使用当天新鲜配制，以防止其发生不必要的降解而影响细胞培养功能，因为该成分对于维持肝细胞的代谢功能至关重要。
尽管肝脏类器官具有显著的复杂性，但其并未包含人类肝脏的所有细胞类型。可以向该模型中添加更多细胞类型以提高其生理相关性24,29，但添加时必须基于明确的使用场景提供合理依据。在研究药物性肝损伤（DILI）时，原代人肝细胞（PHH）是关键的细胞类型，而本模型中引入人肝库普弗细胞（HKC）可检测部分免疫学反应。还应注意，从人肝脏分离的原代人肝细胞与市售的冷冻保存原代人肝细胞在不同批次间往往存在一定程度的差异。本文已证明，使用高质量的细胞制备物时，该方案可产生可重复的结果。然而，仍可能预期存在一定的批次间差异，这一问题可通过合并多个供体的细胞批次来进一步克服。这些局限性还可通过使用诱导性多能干细胞（iPSC）分化而来的肝样细胞来解决，这类细胞可重现原代人肝细胞的多种功能特性，并已应用于药物开发过程30。人肝库普弗细胞同样表现出较大的批次间变异性和解冻后高度活化的特征；因此，在用于实验性细胞培养（与已验证的原代人肝细胞共培养）前，必须在实验室内部预先验证供体来源的人肝库普弗细胞，并确保其解冻后活化水平较低；该指标通过检测白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-alpha）等生物标志物来评估（见补充材料）。
本文提供的数据证实，该检测方法能够准确检测药物性肝损伤（DILI），有助于识别那些可能无法通过二维模型10,11甚至某些三维模型检出的肝毒性物质。由于缺乏流程标准化和统一性（包括不同实验场所间的可重复性）20，目前器官芯片系统（MPS）产生的数据尚未被制药行业作为标准用于法规申报或药物筛选。本文展示的数据和实验方法解决了这一问题，表明该肝脏模型可在DILI筛选中被常规且稳健地使用，以准确预测新化合物的肝毒性风险。
通过检测多种终点指标以生成“肝毒性特征谱”，有助于识别具有不同程度药物性肝损伤（DILI）风险的化合物（包括其他体外方法无法检出的化合物），并揭示其毒性作用机制。该技术可弥合传统细胞培养和动物模型与人体临床试验之间的差距，推动在药物研发过程中，更接近模拟人体生理条件，用于临床前肝毒性评估。
披露
所有作者均为 CN Bio Innovations Limited 的员工。
致谢
本研究由 CN Bio Innovations Ltd. 资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔平底细胞培养板 | 康宁 | 3524 | |
| 96孔透明检测板，平底透明塑料 | Greiner | 655101 | |
| 96孔黑色平底板 | 康宁 | 3915 | |
| 96孔白色/透明底板，TC表面 | 赛默飞世尔科技 | 165306 | |
| 高级DMEM（1倍） | Gibco | 12491015 | 细胞培养基 |
| AssayMax 白蛋白 ELISA 试剂盒 | AssayPro | EA3201-1 | 稀释比例1:250。时间点为第4、6、8天。 |
| 细胞维持混合液B（原代肝细胞维持补充剂） | Gibco | CM4000 | |
| CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测 | Promega | G9682 | 稀释比例1:1。时间点第8天。 |
| 盐酸氯丙嗪 | Sigma Aldrich | C8138 | |
| Chromacol 蓝色瓶盖，9 mm 自动进样瓶螺纹盖 | 赛默飞世尔科技 | 9-SCK(B)-ST1 | 玻璃小瓶 |
| Chromacol 小瓶，9 mm 透明玻璃螺纹瓶 | 赛默飞世尔科技 | 2-SVW | |
| 2级生物安全柜 - Trimat2 1500型排风系统 | 封闭空气解决方案 | ||
| 50 mL 锥形管 | Greiner | 227261 | |
| 冻存肝细胞复苏培养基（CHRM） | 赛默飞世尔科技 | Gibco CM7000 | |
| 冻存的人原代肝细胞 | BioIVT 欧洲 | 批次。RAS | |
| CytoTox 96 细胞毒性（LDH）检测试剂盒 | Promega | G1781 | 稀释 - 无需稀释。时间点为第4、6、8天 |
| >用于生成图表和EC50曲线的数据分析模型为非线性回归（曲线拟合）非对称S形，五参数逻辑函数（5PL），其中X为log(浓度) | GraphPad Prism 9 | ||
| 一次性PES滤器单元 500 mL | Fisher Scientific | 15913307 | |
| 一次性移液管容器 50 ml | Fisher Scientific | 12369175 | |
| DMSO（二甲基亚砜） | Sigma-Aldrich | Sigma D2650 | |
| 杜尔贝科’不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲液（D-PBS） | 赛默飞世尔科技 | 14190-144 | |
| Easy Reader 圆锥形聚丙烯离心管 15 mL | Fisher Scientific | 11889640 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10500064 | |
| 人ALT酶联免疫吸附测定试剂盒 | Abcam | ab 234578 | 稀释比例 1:5。时间点第6天和第8天。 |
| 人冻存库普弗细胞 | 龙沙欧洲 | Lot. 190088KC | |
| 氢化可的松 | 默克 | H0888-1G | |
| 培养箱型号：New Brunswick Galaxy 170 S，新不伦瑞克 Galaxy 170 R 和 CellXpert® C170. | Eppendorf | 每年均进行维护；相关文件可应要求提供。 | |
| 倒置显微镜 | Leica DMIL LED | ||
| MPS，即器官芯片（Organ-on-a-Chip，OOC） | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| MPS LC-12 板 | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Neubauer 改良 C 型芯片一次性血细胞计数板（双通道） | 剑桥生物科学 | DHC-N01-50 | |
| P450-Glo CYP3A4 检测与筛选系统 | Promega | V9002 | 稀释 - 无需稀释。时间点 第8天 |
| PhysioMimix MPS 平台 | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| 吡格列酮 | MedChemExpress Tocris | HY-13956/CS-1700 | |
| Quantichrom 尿素检测试剂盒 – 生物测定系统 | 生物测定系统 | DY970-05 | 初始读数过高时按1:2稀释。时间点为第4、6、8天。 |
| 硅胶 | Sigma-Aldrich | S7625 | |
| 用于分析和生成所有图表的软件为 | GraphPad Prism 9 | ||
| Stripettes 10 mL | Fisher Scientific | 11839660 | |
| Stripettes 25 mL | Fisher Scientific | 11839181 | |
| 解冻培养板用鸡尾酒A（原代肝细胞解冻与接种辅助添加剂） | Gibco | CM3000 | |
| 曲格列酮 | MedChemExpress Tocris | 97322-87-7 | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Gibco | 15250061 | |
| 1.5 mL 离心管 | Greiner | 616201 | |
| 分析天平 - 型号 PA214C 和 AV213C | 奥豪斯公司 |
参考文献
- Lisi, D. M. Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34 (2016).
- Kuna, L., et al. Models of drug induced liver injury (DILI)-current issues and future perspectives. Current Drug Metabolism. 19 (10), 830-838 (2018).
- Katarey, D., Verma, S. Drug-induced liver injury. Clinical Medicine. 16 (6), London, England. 104-109 (2016).
- Kullak-Ublick, G. A., et al. Drug-induced liver injury: recent advances in diagnosis and risk assessment Recent advances in clinical practice. Gut. 66, 1154-1164 (2017).
- Dirven, H., et al. Performance of pre-clinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review. Scientific Reports. 11 (1), 6403(2021).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Current Drug Metabolism. 9 (1), 1-11 (2008).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
- Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).
- Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
- Lin, C., Khetani, S. R. Advances in engineered liver models for investigating drug-induced liver injury. BioMed Research International. 2016, 1829148(2016).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 32 (1), 56-67 (2000).
- Bell, C. C., et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: A multicenter study. Toxicological Sciences. 162 (2), 655-666 (2018).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187(2016).
- Khetani, S. R., et al. Use of micropatterned co-cultures to detect compounds that cause drug-induced liver injury in humans. Toxicological Sciences. 132 (1), 107-117 (2013).
- Ma, X., et al. Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).
- Dieterle, P. Y. M., Dieterle, F. Tissue-specific, non-invasive toxicity biomarkers: translation from pre-clinical safety assessment to clinical safety monitoring. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (9), 1023-1038 (2009).
- Rowe, C., et al. Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins. Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).
- Rubiano, A., et al. Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation. Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).
- Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682(2018).
- Kostrzewski, T., et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).
- Kostrzewski, T., et al. A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).
- Vacca, M., et al. Bone morphogenetic protein 8B promotes the progression of non-alcoholic steatohepatitis. Nature Metabolism. 2 (6), 514-531 (2020).
- Long, T. J., et al. Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms. Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).
- Bai, J., Wang, C. Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery. Frontiers in Pharmacology. 11, 407(2020).
- Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).
- Clark, A. M., et al. A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).
- Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083(2021).
重印与许可
