人源肝脏微生理系统用于体外评估药物性肝毒性 In Vitro

摘要

药物性肝损伤（DILI）是导致药物研发失败的主要原因之一。目前已开发出一种利用肝脏微生理系统（MPS）准确预测化合物DILI风险的实验方案。该肝脏模型通过原代肝细胞的共培养体系，并结合具有临床转化意义的检测终点，评估细胞对药物处理的反应。

摘要

药物性肝损伤（DILI）是导致药物研发失败的主要原因之一，目前已知有超过1000种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物可能在人体中引发DILI。遗憾的是，DILI通常直到药物进入临床阶段后才被发现，这不仅威胁患者安全，也给制药行业带来巨大经济损失。考虑到标准的二维（2D）模型在检测DILI方面存在局限性，开发更具预测能力的体外模型以提高数据的可转化性显得尤为重要。为了深入理解DILI的因果关系及其作用机制，已开发出一种由人原代肝实质细胞和非实质细胞（NPCs）组成的人肝类器官模型，该模型在工程化支架上以三维微组织形式培养，并在灌注条件下维持。在该MPS平台上，将冻存的人原代肝细胞（PHHs）和库普弗细胞（HKCs）共培养为微组织，最长可达两周时间；针对每种目标化合物，在最多四天内以七种测试浓度重复给药。通过分析肝脏特异性功能终点指标（包括丙氨酸氨基转移酶等临床生物标志物ALT），评估肝脏功能。通过比较单次给药与多次给药微组织的反应，可评估不同DILI严重程度化合物的急性和慢性暴露效应。该方法已使用一系列强肝毒性和弱肝毒性化合物进行了验证。本文展示了吡格列酮和曲格列酮的数据，这两种化合物因导致肝功能衰竭而被撤市，是广为人知的肝毒性药物。总体而言，研究表明肝脏MPS模型可作为评估DILI及其与肝功能变化关联性的有效工具。此外，该模型还可用于评估新化合物在不同患者亚群中的表现，以及肝脏疾病状态（如病毒性肝炎、脂肪肝疾病）对毒性特征的影响。

引言

药物性肝损伤（DILI）仍是美国和欧洲急性肝衰竭最常见的原因，也是药物研发过程中化合物被淘汰的主要原因之一¹。几乎所有类别的药物都可能引起肝毒性，其中中枢神经系统药物和抗生素是导致患者发生DILI的最常见治疗药物²。药物诱导的肝毒性由遗传因素、非遗传因素及环境因素之间的复杂相互作用引起，可导致肝细胞及其他肝内细胞类型（包括胆管上皮细胞和内皮细胞）的死亡^1,3。

导致药物性肝损伤（DILI）的药物可通过两种方式进行分类：一类是引起可预测的、剂量依赖性肝损伤的药物，另一类是引起特异质性DILI的药物，后者较为罕见，且与药物剂量、给药途径或用药持续时间无关，但仅在美国就占所有急性肝衰竭病例的六分之一⁴。遗憾的是，DILI通常直到药物进入药物研发的临床阶段后才被发现。药物性肝损伤风险分级（DILIrank）包含一千多种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物，根据其引发DILI的潜在风险分为四类，这些药物在患者中的使用必须进行严密监测⁵。

研究药物性肝毒性的机制仍然极具挑战性，因此已开发出多种临床前模型用于探索药物性肝损伤（DILI）的机制。目前 体外 和 体内 在临床前开发阶段用于预测药物性肝损伤（DILI）的模型在揭示活体人体内复杂且多因素相互作用方面存在多种局限性。目前在药物研发早期阶段，仍采用二维培养的肝癌细胞系（如 HepG2、HepaRG）来评估候选化合物的毒性⁶然而，这些细胞系来源于单一供体，表现出异常的肝功能水平，并不总是对药物性肝损伤（DILI）的检测具有高敏感性。^7,8与癌源性肝细胞系相比，原代人肝细胞（PHHs）在适当培养条件下能更真实地反映人类肝脏的生理特性 体外，尽管其培养存在一些局限性，如药物孵育时间短、寿命相对较短、肝基因表达下降以及药物代谢功能的改变^9,10,11原代人肝细胞（PHHs）可在标准的二维细胞培养板中接种于细胞外基质蛋白上进行培养，但其缺点是细胞功能迅速下降，导致敏感性较低<50%）用于药物性肝损伤（DILI）预测¹².

另一方面，在动物模型上进行测试速度慢、成本高，且需要跨物种推断才能将预测结果外推至人类。大多数新开发的药物未能获得批准，使得这一过程既昂贵又充满风险⁵。此外，由于基因序列或免疫反应与人类存在差异，动物模型在测试新型人源特异性治疗手段时适用性较低¹³。

因此，人们对更先进的三维（3D）技术的兴趣日益增加 体外 肝脏模型的数量呈指数级增长。将原代人肝细胞（PHHs）在悬滴中或超低吸附表面通过重力聚集形成球状结构进行培养，是一种用于评估化合物毒性的高通量方法。¹⁴. 人原代肝细胞球状体已被用于评估疾病背景下（如脂肪变性和胆汁淤积）的药物性肝损伤（DILI）¹⁵已开发出多种模型，包括肝细胞与基质成纤维细胞的微图案化共培养体系¹⁶3D生物打印肝脏组织¹⁷，含或不含肝非实质细胞的3D球状体培养¹⁵然而，所有这些方法仍然存在缺点，而在更接近生理条件的微环境中培养原代人肝细胞（PHHs），可使其在较长时间内维持更高水平的功能，从而能够研究潜在肝毒性物质的长期暴露效应。此外，为了提高任何先进模型的转化应用价值 体外 原代人肝细胞（PHH）培养中，必须利用临床相关的功能性终点或毒性输出生物标志物，以实现数据的可比性 体内 或临床场景¹⁸.

在本研究中，我们评估了一种微生理系统（MPS），也称为器官芯片（Organ-on-a-Chip，OOC）， 体外 肝脏模型可用于深入理解肝毒性的详细作用机制。该微生理系统（MPS）此前已被证明可在流动条件下维持高度功能化的三维肝微组织长达4周。¹⁹该系统近期已通过美国食品药品监督管理局（FDA）测试，在进行药物毒性、代谢和细胞内蓄积实验时表现出高度的可重复性²⁰此外，与球状体和夹心培养相比，该系统在检测多种药物毒性方面具有更稳定的功能和更高的敏感性²⁰迄今为止，MPS 已被广泛应用于涵盖 ADME 的多个领域²¹疾病建模（HBV²², 非酒精性脂肪性肝病^23,24,25，以及药物-药物相互作用²⁶，可能非常适用于评估急性和慢性药物性肝损伤（DILI）。本文介绍的技术为弥补传统细胞培养、动物模型与人体临床试验之间的差距提供了替代方案，推动在药物研发的临床前阶段更真实地模拟人体生物学条件，以支持对候选化合物肝毒性的评估。

方案

所有工作均在实验室中进行，遵循严格的健康与安全规程，并符合实验室自身的风险评估和标准操作程序（SOP）。所使用的所有设备均按照制造商的指南进行维护。微生物安全柜（MBSCs）每年进行一次维护，并依据英国标准进行碘化钾（Ki-Discus）测试。本方案遵循英国人类组织管理局（HTA）的实践规范和指导文件，使用由供应商提供的伦理来源的原代人类细胞，这些供应商完全符合知情同意的一般要求（45 CFR §46.116 和 §46.117）、良好临床实践（GLP）（ICH E6）以及监管和伦理委员会的相关规定。

1. 准备细胞培养基

注意：在第 -1 天配制接种用高级 DMEM 培养基，并于 4 °C 保存。在第 1 天配制维持用高级 DMEM 培养基，并于 4 °C 保存，可保存至多 1 周。

1. 用于PHHs和HKCs共培养的Advanced DMEM培养基接种：向一瓶500 mL的Advanced DMEM培养基（材料表）中加入18 mL Cocktail A（终浓度为3.6%）和25 mL胎牛血清（FBS）（终浓度为5%）。
2. 用于PHHs和HKCs共培养的维持用Advanced DMEM培养基：向一瓶500 mL的Advanced DMEM培养基（材料表）中加入20 mL Cocktail B（终浓度为4%）和500 nM氢化可的松。
   注：氢化可的松需在使用当天新鲜配制，其母液及所需稀释液的配制步骤如下所述。
3. 在维持用Advanced DMEM培养基中配制500 nM氢化可的松溶液
   1. 起始母液（20 mM）的配制：将7.24 mg氢化可的松（材料表）称取至1 mL玻璃小瓶中。记录实际称量的氢化可的松质量，并根据以下公式计算所需二甲基亚砜（DMSO）的体积：
      
   2. 工作用100 μM氢化可的松母液的配制：取5 µL上述20 mM起始母液加入995 μL Advanced DMEM培养基中。
      注：将步骤1中的25 µL DMSO溶液稀释于水或培养基中，终DMSO浓度为0.5%。在最终溶液中，DMSO浓度为0.0025%。在此情况下，额外加入的5 µL体积对总体积的影响可忽略不计。
   3. 在Advanced DMEM培养基中配制工作用500 nM氢化可的松溶液：为配制1 mL含500 nM氢化可的松的Advanced DMEM溶液，将5 μL 100 μM氢化可的松母液加入995 μL维持用Advanced DMEM培养基中。

2. MPS 的设置与预处理（第 -1 天）

1. 将控制器连接至细胞培养孵箱内的对接站机箱，并确保已将新的干燥剂（材料表）放入控制器后部的干燥剂罐中。
   注：控制器会随着时间从孵箱中吸收湿气，需使用新的干燥剂保持内部干燥。
2. 按下控制器后方的船型摇杆开关，将控制器开启，等待5分钟使系统稳定并达到压力。随后检查屏幕上的气动报告，确认：(i) 压力储罐输出值达到约2000 mBar；(ii) 真空储罐输出值达到约850 mBar。
3. 从包装中取出每块培养板，目视检查每个孔，排查可能存在的缺陷（如支架缺失、裂纹等）。
4. 将装有培养板的驱动器插入对接站，确认驱动器已被对接站和控制器识别。检查压力储罐输出值下降幅度小于100 mBar，真空储罐输出值上升幅度小于500 mBar。
5. 通过向储液侧加入500 µL预热至37 °C的接种用高级DMEM培养基，对每个孔进行预处理。
6. 在控制器屏幕上选择预处理程序（以2.5 µL/s的流速向上流动3分钟），直至液体流过滤膜支撑结构。注：“向上流动”是控制器上的一个设定，允许培养基从储液侧向上穿过LC12培养板中的支架。
7. 向所有孔中再加入1.1 mL接种用高级DMEM培养基，以覆盖表面通道。此时所有孔的总体积将达到1.6 mL的工作体积。
8. 将装有培养板的驱动器放入37 °C、5% CO₂的孵箱中，连接至对接站，并运行孵育程序。
   注：实验中使用的所有程序（预处理、孵育、接种、换液）均已预先设定在MPS系统中。在准备接种前，持续在孵箱中对培养板进行预处理。

3. 将肝细胞接种至MPS中（第0天）

1. 对所有 PHHS 和 HKCs 进行预验证。在开展细胞培养实验前，所有 PHHs 和 HKCs 批次均需在内部完成预验证（参见 补充材料）。
2. 将 PHHs 和 HKCs 细胞冻存管（材料表）置于 37 °C 水浴中，稳定握住，直至仅剩少量冰晶残留，完成解冻。
3. 将 PHHs 直接用移液器转移至含有预热（37 °C）的冷冻保存肝细胞复苏培养基（CHRM）的离心管中（每管最多加入两支冻存管的细胞）。
4. 轻柔移取细胞，然后用 1 mL CHRM 冲洗冻存管内残留的细胞。解冻及转移至锥形管过程中，务必轻柔操作细胞。
   警告：解冻过程中切勿震荡冻存管，切勿反复吹打内容物。
5. 将 HKCs 细胞从冻存管中轻柔移入含 10 mL 冰冷接种用高级 DMEM 培养基的 15 mL 离心管中。
   注意：最多可合并两支 HKCs 冻存管的细胞。
6. 将两种细胞在室温（RT）下以 100 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
7. 用温热的接种用高级 DMEM 培养基重悬 PHHs，用冰冻的接种用高级 DMEM 培养基重悬 HKCs（以减少细胞聚集），每管加入的细胞对应使用 1 mL 培养基，并将细胞置于冰上。采用轻柔摇动方式重悬细胞。
   警告：切勿通过移液操作重悬 PHHs，以免导致细胞死亡。
8. 可将来自多个离心管的细胞悬液合并（如适用，即所有 PHHs 来自同一供体），但不得混合不同类型的细胞。
9. 进行细胞计数。记录细胞活力（两种细胞 PHHs 和 HKCs 均需高于 85%）及总细胞数量。若细胞活力低于 85%，则需重新解冻新冻存管的细胞，并重新评估细胞活力。
10. 使用以下公式计算细胞活力：
    
11. 计算每孔所需接种的细胞悬液体积，以及需额外添加的接种用高级 DMEM 培养基体积，使总接种体积达到 400 µL。每孔细胞数量：PHHs 为 0.4 × 10⁶，HKCs 为 0.04 × 10⁶；细胞密度分别为 0.25 × 10⁶ PHHs/mL 和 0.025 × 10⁶ HKCs/mL。
12. 将驱动器从对接站断开，并放回 MBSC 中。
13. 从上述支架上方吸除培养基至停止点（沿固定环深凹槽方向），同时吸除通道和储液区的培养基。在培养孔中保留 0.2 mL “死体积”，液面略高于支架即可。操作时需注意避免完全吸除支架上方的培养基，以防产生气泡。
14. 向孔腔中加入 400 µL 接种用高级 DMEM 培养基，将驱动器放回培养箱内的对接站，运行 换液 程序 3 分钟。程序将在 3 分钟后自动暂停。
15. 程序完成后，将驱动器从对接站断开，并放回 MBSC 中。
16. 从支架上方及每个孔的储液端吸除培养基至停止点。
17. 通过轻柔摇动离心管小心重悬 PHHs，然后向每个培养孔中加入所需体积的细胞悬液。小心移取细胞悬液，确保细胞在孔板支架上均匀分布。
    注意：为确保支架各区域覆盖良好，应缓慢旋转移液，使细胞均匀沉降于支架表面。
18. 同样，小心重悬 HKCs 并将细胞悬液加入各培养孔。
    注意：应采用缓慢旋转移液方式接种 HKCs，以确保支架各区域覆盖良好。这两个接种步骤可分别进行，也可将两种细胞按适当密度预先混合后同时接种。
19. 当所有孔中均含有两种细胞后，将 MPS 驱动器置于培养箱内的对接站上（不进行物理连接），静置 1 小时。
20. 1 小时后，向每孔中加入适量额外的接种用高级 DMEM 培养基，使体积达到 400 μL，并运行 接种 程序。
21. 2 分钟后，程序将自动暂停，从培养箱中取出驱动器，缓慢向通道（靠近储液端而非孔腔端）加入 1000 µL 接种用高级 DMEM 培养基，使总体积达到 1.4 mL（通道中另有 200 µL 死体积）。
22. 将孔板转移至培养箱，继续运行 接种 程序剩余的 8 小时。
    注意：8 小时后，流体将自动切换至孵育程序。

4. 更换培养基（第1天）

1. 将驱动器从对接站断开，并放入MBSC中。
2. 执行换液操作，将小室腔中的接种用Advanced DMEM培养基移除至停止点。
3. 向小室腔中加入400 µL维持用Advanced DMEM培养基，将驱动器放回培养箱内的对接站，并运行换液程序3分钟。程序将在3分钟后自动暂停。
4. 将驱动器从对接站断开，在MBSC中抽吸除去储液腔、通道以及支架上方停止点处的培养基。此时，培养小室将恢复至死体积状态。
5. 用1.4 mL新鲜预热（37 °C）的维持用Advanced DMEM培养基补满储液腔。
6. 将驱动器放回培养箱内的对接站，并运行孵育程序。

5. 肝微组织质量控制（QC）、培养基收集、培养基更换和药物给药（第4天）

1. 第4天使用维持型高级DMEM培养基进行换液，并进行质量控制（QC）检测，以确认接种成功。
   注：QC是通过检测乳酸脱氢酶（LDH）和尿素水平来评估微组织健康状态的过程。
2. 在进行QC检测前，为每种待测化合物配制新鲜的母液（根据化合物的溶解度，使用维持型高级DMEM培养基或含0.1% DMSO的维持型高级DMEM培养基），并按需稀释至各化合物的测试浓度。
3. 将驱动器和培养板从对接站断开，并转移至MBSC中。
4. 使用移液器从每个孔中转移50 µL培养基至96孔板，用于LDH检测（材料表）；另取25 µL用于尿素检测（材料表）。
   注：LDH和尿素检测将依照试剂盒制造商的说明进行。
5. 若LDH读数低于2 AU/10⁶细胞，且尿素产量高于40 µg/天/10⁶细胞，则继续实验。
   注：白蛋白未用于QC检测，因其检测耗时较长，将在实验结束后对第4天采集的样品进行检测。
6. 若任何孔未通过QC检测，应将其从实验设计中剔除。
7. 确认实验设计后，收集各孔中剩余的培养基，注意避免触碰支架而扰动细胞培养。将收集的培养基（标记为给药前样品）储存于-80 °C，用于后续检测。
8. 在MBSC中按照步骤4.3–4.5执行换液操作。根据实验设计，将各孔更换为含有正确药物浓度的维持型高级DMEM培养基。
9. 操作完成后，将驱动器放回培养箱内的对接站，并运行孵育程序。

6. 培养基收集、换液及药物处理（第6天）

1. 为每种待测化合物配制新鲜的储备液（根据各化合物的溶解度，使用维持用高级DMEM培养基或含0.1% DMSO的维持用高级DMEM培养基）。根据板设计图，将储备液相应稀释至各化合物的测试浓度。
2. 将驱动器和培养板从对接站断开，并转移至MBSC中。
3. 使用移液器手动从每个孔中收集培养基（约1 mL），注意避免触碰支架而扰动细胞培养物；收集的样品用于LDH和尿素检测。剩余的培养基储存于-80 °C，用于后续检测，并标记为给药后48小时样品。
4. 按照板设计图，使用与第4天相同的药物浓度，通过执行换液步骤4.3–4.5，对每个孔重新给药。
5. 操作完成后，将驱动器放回培养箱内对接站上，运行孵育程序。

7. 结束实验（第8天）

1. 将驱动器和培养板从对接站上取下，并转移至MBSC中。
2. 使用移液器手动从每个孔中取样培养基，注意避免触碰支架，以免干扰细胞培养。
3. 对取出的培养基进行LDH和尿素检测，并将剩余收集的培养基在-80 °C下保存，用于后续检测。
4. 进行CYP3A4-glo检测。
   1. 使用本检测方法，在实验结束时测定所测试药物对PHHs中细胞色素P450 CYP3A4活性的影响。
   2. 按照制造商说明，重悬检测试剂（用于CYP3A4检测，见材料表）。若检测试剂此前已重悬并冷冻保存，请从-20 °C冰箱中取出，在室温下解冻。
   3. 按照制造商说明，配制20 mM的D-荧光素储备标准品。
   4. 用维持用Advanced DMEM培养基以1:1000比例稀释Luciferin IPA，制备发光底物工作液（每孔2 mL）。
   5. 按照步骤4.3–4.5所述进行换液操作，使用发光底物工作液。另取500 µL发光底物工作液置于1.5 mL玻璃小瓶（见材料表）中作为输入样品。
   6. 将驱动器放回培养箱内的对接站，运行孵育程序1.5小时。
   7. 按照制造商说明，在1.5 mL离心管中用培养基配制D-荧光素标准曲线，并将每种标准品各50 µL重复加样至白色不透明96孔板（见材料表），以培养基作为空白对照（0 µM）。
   8. 孵育时间结束后，将驱动器从对接站取下，按照步骤7.4.9–7.4.13采集培养基用于CYP3A4检测。
   9. 孵育完成后，将每个孔的样品培养基及输入样品各50 µL转移至含有标准品的不透明白色96孔发光检测板中。注意在标准品与样品之间至少保留两行空白孔，以避免高光信号从标准品传递至样品读数。
   10. 向每孔加入50 µL Luciferin检测试剂，启动发光反应。
   11. 将检测板置于黑暗环境中，在室温下用板式振荡器振荡孵育20分钟，以稳定发光信号。
   12. 使用发光仪或CCD相机记录发光强度。
   13. 通过取各标准点的平均值并减去空白对照平均值，绘制标准曲线。利用标准曲线线性方程计算其余样品的代谢速率（pmol/min/10⁶细胞），注意计入所有稀释倍数。
5. 使用镊子将支架从培养板中取出，放入含有500 µL D-PBS（不含Ca++和Mg++）的24孔板中，每孔一孔，注意不要扰动微组织。
6. 使用倒置光学显微镜在10倍放大倍数下拍摄每个支架的图像。
7. 按照制造商说明进行ATP检测（见材料表）：
   1. 在室温下解冻试剂。
   2. 每次用500 µL D-PBS（不含Ca++和Mg++）清洗支架两次。
   3. 向每个支架中加入120 μL试剂和120 μL PBS，同时向一个空孔中加入相同体积的液体作为空白对照。将培养板用铝箔包裹后置于振荡器上，剧烈振荡（500 rpm）5分钟，随后孵育30分钟以稳定发光信号。
   4. 将裂解后的样品各100 μL重复加样至透明平底96孔检测板中用于测量。确保空白孔不与高发光强度的检测孔相邻。
   5. 使用酶标仪记录发光强度。
   6. 将样品的发光强度与标准品进行比较，以确定试剂在样品中检测到的ATP含量。

结果

该论文描述了一种用于评估药物性肝损伤（DILI）的肝脏类器官微生理系统（MPS）模型。该MPS系统可生成在流动条件下维持长达4周高度功能性的三维肝微组织。将原代人肝细胞（PHHs）/人肝细胞（HKCs）接种于胶原涂层支架上形成肝微组织，并用生长培养基灌注；通过质量控制（QC）检测后，给予化合物处理。本文展示了曲格列酮和吡格列酮的数据，这两种化合物结构相似，但DILI严重程度不同。

在第4天给药前，对形成的肝微组织进行质量控制检测，包括乳酸脱氢酶（LDH）释放和尿素合成（图1A）。该质量控制旨在确认肝类器官系统能够生成高度一致且功能良好的肝微组织。此处展示的数据来自三次实验，显示出良好的可重复性，且实验内和实验间变异度较低。经过8天培养后，检测多项健康和肝功能指标（白蛋白、尿素、CYP3A4、ATP），对照微组织表现出高水平的肝功能活性和可重复性（图1B、C）。相差显微镜观察及肝微组织的免疫荧光染色（见补充材料）显示，细胞在支架微通道内的接种具有一致性，并揭示了人肝细胞（HKCs）在原代人肝微组织中的分布情况（图1D）

图1：肝脏类器官系统（Liver MPS）可产生高度可重复的数据和一致的微组织。（A）第4天的3D肝脏微组织质量控制指标，以及在第8天研究结束时的功能性评估——（B）白蛋白和尿素，（C）CYP3A4和ATP。数据来自3次独立实验；每次实验包含3个溶剂对照重复组。所示数据为均值±标准差，N = 9。（D）相差显微镜图像（10倍和20倍）以及通过在肝脏MPS平台上共培养PHHs和HKCs生成的3D肝脏微组织的免疫荧光图像，用于评估药物性肝损伤（DILI）。为可视化HKCs，在接种前使用表达eGFP的腺病毒载体对HKCs进行转导（参见补充材料）。图中显示代表性显微照片。转导与成像作为独立实验进行，以展示细胞定位，并未结合本文所述的DILI实验方案。HKCs在用于实验性细胞培养前均经过实验室内部预先验证，必须具有较低的冻存后激活水平；该指标通过检测生物标志物IL-6和TNF-α来评估。请点击此处查看该图的放大版本。

曲格列酮已知可导致严重的药物性肝损伤（DILI）；在获准用于治疗2型糖尿病后，由于其使用相关肝损伤发生率较高，美国食品药品监督管理局（FDA）在该药上市3年后将其撤市。迄今为止，已发表的动物研究未能预测曲格列酮引发严重肝损伤的潜在风险。该化合物的毒性在标准实验中也未被检出 体外 二维肝细胞检测¹⁴.

在MPS中，肝脏微组织经曲格列酮处理96小时后引发了急性毒性反应，C_最大 由ALT和乳酸脱氢酶（LDH）释放以及白蛋白和尿素生成的快速减少所检测到，在约15倍浓度下_最大值，经急性暴露于曲格列酮后（图2A）。在暴露96小时后检测的细胞终点指标（ATP含量）和CYP3A4活性（用于评估代谢生物转化）进一步证实了曲格列酮的毒性，其EC:50值与其他终点指标高度一致。图2B）。在MPS中培养8天后拍摄的明场显微镜图像显示，载体对照组中的肝微组织健康，且在支架内均匀接种，而阳性对照组和曲格列酮在最高两个测试浓度下处理的重复样本则表现出广泛的组织死亡/降解图2C).

图 2：利用多种肝毒性终点指标评估曲格列酮的药物性肝损伤（DILI）风险。 肝微组织暴露于七种不同浓度的曲格列酮中96小时，并比较（A）乳酸脱氢酶（LDH）释放、丙氨酸氨基转移酶（ALT）释放、白蛋白生成、尿素合成、CYP3A4 活性以及 ATP 含量。蓝色线条表示48小时暴露（仅培养基终点），红色线条表示96小时暴露。阳性对照为100 μM 氯丙嗪。所有终点指标均来自相同的肝类器官（MPS）培养物。所示数据为均值 ± 标准差（SD），N = 3。（B）由数据生成的E:50数值汇总。N.D. = 数据无法作图；Line = 未进行检测。（C）肝微组织在8天培养后的代表性明场显微镜图像（放大倍数10倍）。请点击此处查看该图的放大版本。

还研究了吡格列酮暴露后的肝毒性。吡格列酮是一种已知引起药物性肝损伤（DILI）风险较低的化合物。⁴ 在经典的二维原代肝细胞培养中未表现出肝毒性，甚至在一些更先进的三维模型中也未表现出肝毒性^{10, 11}在两个测试时间点均观察到轻微的肝毒性作用（图3）。未检测到LDH或ALT释放；然而，在48 h后观察到白蛋白和尿素的生成轻度减少，约为25倍C_最大 (图3A）。在高浓度吡格列酮下也观察到ATP含量略有降低，但无显著性差异。剂量-反应曲线得出的EC50值如图所示。 图3B显微镜观察显示，在最高两个测试浓度的吡格列酮暴露96小时后，微组织出现轻微改变（图3C结果表明，肝脏微生理系统（liver MPS）能够检测出具有轻度药物性肝损伤（DILI）风险化合物的毒性。

图3：使用多种肝毒性终点指标评估吡格列酮的药物性肝损伤风险 肝脏微组织经七种不同浓度的吡格列酮处理96小时后进行比较，以评估（ALDH 释放、ALT 释放、白蛋白生成、尿素合成、CYP3A4 活性及 ATP 含量。蓝色线条：48 小时暴露（仅培养基终点）；红色线条：96 小时暴露。阳性对照为 100 μM 氯丙嗪。所有终点指标均来自相同的肝类器官培养体系。数据表示为均值 ± 标准差，N = 3。B) 根据数据生成的EC:50数值汇总。N.D. = 数据无法作图。Line = 未进行检测。C8天培养后肝微组织的代表性明场显微图像（放大倍数10倍）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

通过评估所有可能代表功能终点和毒性输出生物标志物的指标 体内 或临床情况（LDH释放、尿素合成、白蛋白生成、CYP3A4活性、ATP含量、ALT释放），并通过验证两种受试化合物在七点剂量范围内分别作用48小时和96小时所生成的数据，已绘制热图以获得“肝毒性特征图谱”，有助于识别具有不同程度药物性肝损伤（DILI）风险的化合物（图4).

图 4：利用肝脏多器官芯片（Liver MPS）确定“毒性特征”。 热图显示了曲格列酮和吡格列酮在七点剂量范围内暴露48小时和96小时后，对六个功能性肝脏特异性终点指标的影响（LDH释放、尿素合成、白蛋白生成、ALT释放、CYP3A4活性以及ATP含量）。每个数值均为三次独立实验的平均值（N = 3），并相对于对照组样本进行归一化处理。颜色条上的数值表示相对于基线对照组的倍数变化。请点击此处查看该图的放大版本。

补充材料：微组织的荧光显微镜成像及细胞的预筛选评估。 请点击此处下载该文件。

讨论

MPS 旨在模拟人体器官的功能单元 体外 并已开发出来以克服传统三维细胞培养模型的局限性²⁷肝脏是使用微生理系统（MPS）建模最多的器官之一，已开发出多种多样的系统。人类肝脏负责药物代谢以及有毒药物代谢物的生成，其功能是药物开发中建模的关键要素，包括化合物导致药物性肝损伤（DILI）风险的评估。²⁸在此，我们介绍了一种利用肝脏微生理系统（MPS）评估药物性肝损伤（DILI）的新方法；该方案不仅具有高度敏感性和稳健性，还可针对每种受试化合物提供机制层面的深入分析，以确定其引发DILI的潜在机制。在MPS培养板中形成的肝脏微组织由原代人肝细胞（PHH）和人肝库普弗细胞（HKCs）共培养构成，具有高度功能性，其白蛋白和尿素的生成水平以及CYP3A4活性均显著高于常规培养系统 体外 肝脏模型²⁰.

尽管本文所述的药物性肝损伤（DILI）模型在药物研发过程的临床前后期阶段可作为一种有用的工具，但它也存在若干局限性。与目前市场上大多数微生理系统（MPS）一样，该平台通量较低，因此较难用于大规模药物筛选。该DILI模型由原代人肝细胞（PHHs）和人肾小管上皮细胞（HKCs）共培养形成的微组织构成，仍无法完全模拟人肝脏的复杂性；若进一步优化，加入其他类型细胞（如免疫细胞），将有助于提升现有模型的价值。此外，这种单器官MPS还可与其他可共享培养基、并能在细胞或内分泌水平实现器官间相互作用的器官平台联用，从而有助于更深入理解毒性机制，而不仅局限于肝脏本身的毒性。此外，作为一种相对较新的技术，该系统可能成本较高，因而可及性有限。

MPS 是一种用于构建单个人体组织或多个人体组织类器官模型的平台。该系统由控制器、脐带电缆和MPS驱动器组成，其中MPS驱动器用于插入培养板（图5A）。每块肝脏MPS板包含12个独立的开放式微孔，可用于在工程化支架上三维培养原代肝细胞。简要而言，系统在第-1天进行质量控制检查并对培养板进行预处理，第0天将PHHs和HKCs接种至培养板上（图5B，见1）。嵌入式微型泵可推动细胞培养基流经支架，从而促进三维微组织的形成（图5B，见2）。微组织在第4天进行质量检测，随后每隔48小时给予不同浓度的待测化合物，持续给药4天，并于第8天检测终点生物标志物（图5C）。MPS培养板中DILI检测的实验时间线如图5D所示。

图5：微生理系统及标准药物性肝损伤（DILI）检测的实验时间线。（A）微生理系统及其组件：控制器（1）、脐带电缆（2）、对接站（3）、MPS驱动器（4）和LC12板（5）。（B）第1天在LC12板上接种原代人肝细胞（PHHs）和人肾细胞（HKCs）（1），嵌入式微泵可促进培养基循环，通过调节流速使培养基流经支架上接种的三维微组织（2）。（C）研究结束时取出支架。（D）实验时间线。请点击此处查看该图的放大版本。

进行该实验方案时，必须在开始前执行严格的整体系统质控检查，确认系统气动功能正常，并对耗材板进行目视检查和高效预润洗，以确保所有孔的功能均一。高质量的原代人源细胞对该方案至关重要，其中肝细胞在细胞培养实验中具有稳定的贴壁特性，并能形成三维相互作用。解冻这些细胞也是一个关键步骤，因为原代肝细胞不应通过移液操作进行重悬，否则会迅速导致细胞死亡。细胞活力需高于85%，这是成功接种的关键，大量细胞碎片将干扰三维微组织的形成。在第4天对形成的肝微组织进行质控检查同样重要，操作者需确保乳酸脱氢酶（LDH）和尿素的检测值处于可接受范围内，因为超出正常范围的参数可能提示组织形成质量不佳，有助于快速排查问题。最后，细胞培养基中使用的氢化可的松必须在使用当天新鲜配制，以防止其发生不必要的降解而影响细胞培养功能，因为该成分对于维持肝细胞的代谢功能至关重要。

尽管肝脏微生理系统（liver MPS）具有显著的复杂性，但它并不包含人类肝脏的所有细胞类型。可以向该模型中添加更多细胞类型以提高其生理相关性^24,29，但这些添加必须基于明确的使用情境并有充分理由支持。在研究药物性肝损伤（DILI）时，原代人肝细胞（PHH）是关键的细胞类型，而在本模型中引入人肝库普弗细胞（HKC）可检测部分免疫学反应。还应注意，从人肝脏分离获得的PHH以及商业来源的冻存PHH在不同批次之间往往存在一定程度的差异。本文已证明，使用高质量的细胞制备物时，该方案可产生可重复的结果。然而，仍可能观察到一定的批次间变异，这一问题可通过合并多个供体的细胞批次来进一步克服。这些局限性也可通过使用诱导性多能干细胞（iPSC）分化而来的肝样细胞来解决，这类细胞可重现PHH的多种功能特性，并已在药物开发过程中得到应用³⁰。HKC同样存在批次间变异，并在解冻后表现出较高水平的活化；因此，在用于实验性细胞培养（与已验证的PHH共培养）前，需对HKC供体进行实验室内部的预先验证，且要求其解冻后活化水平较低；该指标通过检测白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-alpha）等生物标志物来评估（见补充材料）。

本文提供的数据证实，该检测方法能够准确检测药物性肝损伤（DILI），有助于识别那些通过二维模型^10,11甚至某些三维模型可能无法检出的肝毒性物质。由于缺乏流程标准化和统一性（包括不同实验场所间的可重复性²⁰），目前微生理系统（MPS）产生的数据在制药行业中尚未被用作法规申报或药物筛选的标准。本文展示的数据和实验方法解决了这一问题，表明该肝脏模型可在DILI筛选中被常规且稳健地使用，以准确预测新化合物的肝毒性风险。

通过检测多种终点指标以生成“肝毒性特征谱”，有助于识别具有不同程度药物性肝损伤（DILI）风险的化合物（包括其他体外方法无法检出的化合物），并揭示其毒性作用机制。该技术能够弥合传统细胞培养和动物模型与人体临床试验之间的差距，推动在药物研发过程中，对肝毒性进行临床前评估时更接近模拟人体生物学条件。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔平底细胞培养板	康宁	3524
96孔透明检测板，平底透明塑料	Greiner	655101
96孔黑色平底板	康宁	3915
96孔白色/透明底板，TC表面	赛默飞世尔科技	165306
高级DMEM（1倍）	Gibco	12491015	细胞培养基
AssayMax 白蛋白 ELISA 试剂盒	AssayPro	EA3201-1	稀释比例1:250。时间点为第4、6、8天。
细胞维持混合液B（原代肝细胞维持补充剂）	Gibco	CM4000
CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测	Promega	G9682	稀释比例1:1。时间点第8天。
盐酸氯丙嗪	Sigma Aldrich	C8138
Chromacol 蓝色瓶盖，9 mm 自动进样瓶螺纹盖	赛默飞世尔科技	9-SCK(B)-ST1	玻璃小瓶
Chromacol 小瓶，9 mm 透明玻璃螺纹瓶	赛默飞世尔科技	2-SVW
2级生物安全柜 - Trimat2 1500型排风系统	封闭空气解决方案
50 mL 锥形管	Greiner	227261
冻存肝细胞复苏培养基（CHRM）	赛默飞世尔科技	Gibco CM7000
冻存的人原代肝细胞	BioIVT 欧洲	批次。RAS
CytoTox 96 细胞毒性（LDH）检测试剂盒	Promega	G1781	稀释 - 无需稀释。时间点为第4、6、8天
>用于生成图表和EC50曲线的数据分析模型为非线性回归（曲线拟合）非对称S形，五参数逻辑函数（5PL），其中X为log(浓度)	GraphPad Prism 9
一次性PES滤器单元 500 mL	Fisher Scientific	15913307
一次性移液管容器 50 ml	Fisher Scientific	12369175
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma-Aldrich	Sigma D2650
杜尔贝科’不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲液（D-PBS）	赛默飞世尔科技	14190-144
Easy Reader 圆锥形聚丙烯离心管 15 mL	Fisher Scientific	11889640
胎牛血清	Gibco	10500064
人ALT酶联免疫吸附测定试剂盒	Abcam	ab 234578	稀释比例 1:5。时间点第6天和第8天。
人冻存库普弗细胞	龙沙欧洲	Lot. 190088KC
氢化可的松	默克	H0888-1G
培养箱型号：New Brunswick  Galaxy 170 S，新不伦瑞克  Galaxy 170 R 和 CellXpert® C170.	Eppendorf		每年均进行维护；相关文件可应要求提供。
倒置显微镜	Leica DMIL LED
MPS，即器官芯片（Organ-on-a-Chip，OOC）	CN Bio Innovations Ltd.
MPS LC-12 板	CN Bio Innovations Ltd.
Neubauer 改良 C 型芯片一次性血细胞计数板（双通道）	剑桥生物科学	DHC-N01-50
P450-Glo CYP3A4 检测与筛选系统	Promega	V9002	稀释 - 无需稀释。时间点 第8天
PhysioMimix MPS 平台	CN Bio Innovations Ltd.
吡格列酮	MedChemExpress Tocris	HY-13956/CS-1700
Quantichrom 尿素检测试剂盒 – 生物测定系统	生物测定系统	DY970-05	初始读数过高时按1:2稀释。时间点为第4、6、8天。
硅胶	Sigma-Aldrich	S7625
用于分析和生成所有图表的软件为	GraphPad Prism 9
Stripettes 10 mL	Fisher Scientific	11839660
Stripettes 25 mL	Fisher Scientific	11839181
解冻培养板用鸡尾酒A（原代肝细胞解冻与接种辅助添加剂）	Gibco	CM3000
曲格列酮	MedChemExpress Tocris	97322-87-7
0.4% 台盼蓝溶液	Gibco	15250061
1.5 mL 离心管	Greiner	616201
分析天平 - 型号 PA214C 和 AV213C	奥豪斯公司