用于量化蚊虫和果蝇杀虫剂毒性的局部施用生物测定法

摘要

我们描述了用于测定蚊虫和果蝇杀虫剂敏感性的局部施用生物测定法的方法学及其重要性。本方法通量高，利用昆虫的总质量——从而能够计算基于质量归一化的致死剂量而非浓度——且相较于其他类似方法可能具有更低的变异性。

摘要

杀虫剂在公共卫生和农业中的持续使用已导致广泛的杀虫剂抗性，阻碍了防控措施的有效性。蚊虫种群杀虫剂抗性监测通常通过美国疾病控制与预防中心（CDC）瓶法生物测定或世界卫生组织（WHO）管式试验进行。然而，由于昆虫与杀虫剂接触程度存在差异，这些方法可能导致死亡率数据变异性较高 昆虫、测试生物数量相对较少、种群间质量差异显著以及环境条件持续变化，导致结果存在变异性。本文介绍了经改进的表面施用生物测定法，作为一种高通量表型生物测定方法，适用于蚊虫和果蝇，可用于大量昆虫的检测 一系列杀虫剂浓度

该检测方法具有以下优势：1）确保每种生物个体均接受一致的处理并充分接触杀虫剂；2）生成高度特异的剂量-反应曲线，能够校正不同品系及性别间平均质量的差异（对于野外采集的生物样本尤为重要）；3）可计算具有严格统计学意义的半数致死剂量（LD₅₀），这对于抗性倍数比较至关重要——这是一种区别于诊断剂量致死率检测的替代性监测方法，后者也常用于幼虫杀虫剂抗性监测。本检测方法可作为精确表型鉴定蚊虫种群的有力补充工具，并且如以果蝇为例所示，该方法可轻松适配于其他昆虫物种。我们认为，该检测方法将有助于弥合多种昆虫中杀虫剂抗性的基因型与表型之间的差距。

引言

蚊子因传播疾病每年导致超过70万人死亡，其中仅疟疾所致死亡就占一半以上¹。目前预防疟疾及其他虫媒传播疾病的主要方法是使用杀虫剂，通常以长效杀虫蚊帐或室内滞留喷洒的形式应用²。然而，杀虫剂抗性在蚊子及其他媒介昆虫中普遍存在，农业害虫中也广泛存在此类抗性^3,4。为了有效管理抗性问题，监测工作至关重要⁵。为此，亟需高准确性和高通量的抗性检测方法。目前，用于蚊子杀虫剂抗性监测最广泛使用的方法是WHO管试验⁶和CDC瓶式生物测定法⁷。对于果蝇，残留接触施药法（类似于CDC瓶式生物测定法） 是一种常用的杀虫剂生物测定方法^8,9,10。然而，这些方法的数据变异性通常较高，当暴露于亚致死剂量时，同一实验室蚊子品系在CDC瓶式测定中的死亡率范围约为20–70%，在WHO管试验中为0–50%¹¹。这种变异令人意外，因为大多数实验室品系的遗传变异有限，理论上应导致种群中杀虫剂敏感性的变异较小。尽管如此，生物测定结果中仍观察到较高水平的变异。

这种变异的潜在来源可能包括：在生物测定过程中，由于通过表面间接接触杀虫剂，导致样本间杀虫剂暴露不均、环境效应异质性、相同基因型个体之间的正常生物学差异，以及同一种群中个体质量的差异¹²。一种较少使用但可重复性更高的方法是点滴法生物测定。在此方法中，杀虫剂被直接施用于每只昆虫^13,14，从而消除了同次测定中不同样本暴露程度不一致的影响因素。然而，由于该方法通量较低，通常不被用作蚊虫种群杀虫剂敏感性监测的常规工具。本文提出了一种改良的点滴法生物测定方案，可在实现较高通量处理的同时，校正昆虫个体质量差异带来的影响——这一参数与杀虫剂敏感性的变化密切相关¹²。减少因杀虫剂暴露不均导致的死亡率数据中的噪声和与质量相关的变异，将有助于更准确地开展技术性抗性监测^11,15。此类数据可用于更精确地将表型抗性与遗传标记、适合度参数和/或媒介能力相关联。此外，我们还展示了如何通过在果蝇（一种体型较小的昆虫物种）上应用点滴法生物测定，轻松将该方法适配于其他昆虫物种。

上述残留接触检测方法的主要局限性在于，在同一次实验中，不同样本所接触的杀虫剂暴露量可能存在差异。在CDC瓶式生物测定和接触法中，同一次实验的不同重复之间，昆虫接触的杀虫剂暴露量也可能存在差异。昆虫暴露于分布在玻璃瓶内壁（CDC瓶式生物测定和接触法）或浸渍纸张（WHO管式试验）上的杀虫剂。玻璃和纸张表面的杀虫剂浓度是已知的，并通过筛选已知基因型的不同物种预先确定。然而，昆虫实际可吸收的杀虫剂量可能因所用表面材料、杀虫剂混合物的成分以及杀虫剂在表面材料上分布的均匀程度而存在显著差异^16,17。在CDC瓶式生物测定中，瓶内壁的杀虫剂涂层依赖于各实验室和操作人员所采用的操作流程。在WHO管式试验中，经杀虫剂处理的纸张为集中生产，因此在不同实验室之间很可能具有较高的均一性。然而，在WHO管式试验中，暴露管允许样本停留在未接触杀虫剂的金属网表面，从而导致每次测试中不同样本之间的杀虫剂暴露可能存在不均一性。通过上述每种方法实际被样本摄取和吸收的杀虫剂量仍需进一步研究¹⁸。

此外，CDC瓶法生物测定、WHO管法试验和接触法通常作为阈值测定方法，仅测试一种预设的杀虫剂浓度。该方法可准确检测抗性的存在，在抗性监测中具有重要价值（尤其是在抗性扩散期间）。然而，阈值测定无法量化抗性的强度，而抗性强度可能更能够预测干预措施的效果。若在这些方法中使用多种杀虫剂浓度，则可将其用作强度测定。针对CDC瓶法生物测定和WHO管法试验，已有研究通过测试预设鉴别剂量的5倍和10倍浓度来弥补监测中的这一不足^6,19。尽管使用多个剂量有助于更好地区分不同抗性种群，但3至5个（预设）剂量所提供的分辨率仍有限，难以精确计算致死浓度。此外，此类测定中常使用不同体型的蚊虫。然而，个体质量至关重要，因为较大的个体可能需要更高的剂量才能致死，其单位质量的有效剂量将远低于较小个体¹²。计算基于质量归一化的致死剂量（单位昆虫质量所对应的杀虫剂用量）将比常用的致死浓度（例如，单位表面积所对应的杀虫剂用量）更具参考价值，因为它考虑了不同性别、种群和基因型之间昆虫质量的差异。此类数据有助于弥合实验室与野外研究中基因型抗性与表型抗性之间的差距，同时也可为计算针对已知平均质量昆虫种群所需的施用浓度提供简便方法。

使用基于单位质量标准化的半数致死剂量（LD₅₀）还具有多项其他优势。在人类和兽医毒理学中，以 mg/kg（= ng/mg）表示特定化合物毒性的评估是标准做法¹⁴，且 LD₅₀ 值通常可在材料安全数据表中找到。致死剂量还可实现不同化学物质对同一物种，或同一化学物质对不同物种毒性的直接比较²⁰，并有助于对新型杀虫剂和化学品进行高质量评价¹³。此外，与基于诊断剂量致死率结果得出的抗性比值相比，LD₅₀ 能提供更具意义且更准确的抗性比值，后者可能高估种群中存在的抗性水平。因此，该检测方法适用于常规监测项目，可通过基于更多样本量计算得出的单位质量标准化致死剂量，实现比其他生物测定推荐样本量更严格的抗性监测²¹。

局部施用法已被用于蚊虫和蝇类的杀虫剂敏感性监测，作为在已知或怀疑存在抗性情况下的标准杀虫剂敏感性生物测定的替代方法^22,23，同时也用于某些害虫昆虫的监测²⁴，以更准确地评估抗性特征和杀虫剂的内在毒性²¹。在局部施用生物测定中，杀虫剂被直接施加于每只昆虫个体，从而最大程度减少杀虫剂暴露量的变异。本文介绍了一种经过轻微改进和优化的方法，可在短时间内对大量昆虫施加杀虫剂处理，同时控制昆虫体重因素²²。这种高通量且具有良好重复性的方法，可作为常规杀虫剂敏感性监测的有力补充工具。

方案

注意：杀虫剂可能对人类、动物和环境造成危害²⁵。强烈建议采取预防措施，接受相关培训，并使用个人防护装备。务必遵守所用所有杀虫剂和溶剂的材料安全数据表中的规定。

1. 标本后处理

1. 饲养3至5日龄的成蚊
   注意：以下方案反映的是特定条件 埃及伊蚊 饲养，严格遵循联合国粮食及农业组织指南²⁶.
   1. 将蚊子的所有生命阶段在 27 ± 1 °C 和 75 ± 5% 相对湿度条件下，以 12:12 小时光照与黑暗循环进行饲养。
   2. 将蚊子卵浸入去离子水中，并加入酵母以孵化蚊卵²⁶或将浸没的卵放入真空室中处理30分钟。
      注意：两种方法均会降低水中的氧气含量，并促进孵化²⁷.
   3. 在托盘中为刚孵化的仔鱼提供鱼饲料（或等效饲料，如研磨过的猫粮颗粒），并尽量保持各托盘间的仔鱼密度一致，因为仔鱼密度会影响其发育。¹² （例如，每个托盘中放置200-250条幼虫，总水量为1.5 L）。
   4. 每隔一天喂食幼虫一次，直至其进入蛹期（约7-10天），根据需要适当增加食物量。
      注意：投喂过少会导致幼虫生长受阻，且幼虫间可能发生相互捕食；投喂过多则可能导致幼虫死亡，使水质恶化。
   5. 蛹发育完成后，每天将其转移至成蚊饲养笼中的盛水容器内，并提供10%蔗糖溶液 随意摄取.
   6. 记录成虫羽化的第一天。在开始羽化两天后，将剩余的蛹从笼中移除。
      注意：雄性蚊子羽化速度较快。需分别记录雄性和雌性蚊子的羽化情况，并确保每次试验均有足够数量的雄性和雌性蚊子可供使用。
   7. 去除蛹后等待3天，以获得用于测试的3至5日龄蚊子。
2. 果蝇后部（大致参照苏黎世大学的实验方案）²⁸).
   1. 后部 果蝇 在23 ± 1 °C、相对湿度60 ± 5%、12小时光照/12小时黑暗循环条件下，将菌株保存于库存瓶中。
      注意： 果蝇 储备瓶中应装有75 mL标准果蝇培养基，先将液态培养基倒入瓶底，然后静置过夜使其凝固。
   2. 每两周将果蝇群体转移至装有新鲜培养基的新培养瓶中，以防止过度繁殖和霉菌生长。操作时，使用手持式二氧化碳（CO₂）装置麻醉果蝇₂) 分配器，将麻醉后的果蝇转移至置于冰袋或冷却板上的称量纸上，使用细头画笔将果蝇刷入新的培养瓶中。操作过程中务必使培养瓶保持水平，以防止果蝇落入培养基中溺亡。

2. 采用重量法配制杀虫剂制剂

1. 在通风橱内使用精度为 0.1 mg 的分析天平，采用重量法配制第一份母液。
   注意：重量法通过质量来测量所添加杀虫剂和溶剂的量。常规方法（体积法）在配制第一份母液时需使用分析天平称量所添加的（固体）杀虫剂质量；然而，所添加溶剂的体积及后续所有稀释步骤均仅通过体积测量。重量法具有更高的准确性，因此更受推荐。
   1. 确定第一份母液的目标杀虫剂浓度和目标体积（若使用 15 mL 离心管，建议最大体积为 10 mL，以防止冷冻储存时溢出），并使用公式（1）计算所需添加的杀虫剂有效成分（AI）质量：
        (1)
   2. 准备储存管（建议使用 15 mL 圆底离心管用于较大体积，1.5 mL 微量离心螺口管用于 1 mL 或更小体积），并标注杀虫剂名称、溶剂名称、目标浓度和配制日期。将管子和管盖置于天平上的支架或固定架中，去皮归零。
   3. 称取步骤 2.1.1 中计算所得的所需量的固体或液体杀虫剂有效成分（例如，代表性数据中使用的溴氰菊酯）至管中，并记录质量。
   4. 将天平去皮归零，向管中加入所需体积的溶剂（相当于目标体积），立即盖紧管盖，并记录质量。加入溶剂（此处使用丙酮）后应立即盖紧管盖，以避免蒸发，并混匀溶液。
   5. 记录室温。某些溶剂（如丙酮）的体积（以及相应密度）会随温度发生显著变化。
   6. 若需立即储存，应用封口膜包裹管盖（以减少蒸发），将管子放入管架/固定架中（保持直立，防止泄漏），用铝箔包裹（避免紫外线照射），再放入可密封的塑料袋中（进一步减少蒸发），最后将袋子置于 -20 °C 冰箱中。若不能立即储存，应确保管盖拧紧，并用铝箔或避光容器覆盖。
   7. 通过将所添加杀虫剂有效成分的质量除以所添加溶剂的体积（若杀虫剂为液体形式，还需加上其体积）来计算母液的实际浓度（mg/mL）。为计算所添加溶剂（或液体杀虫剂）的体积，应将所添加的质量除以与记录温度相对应的已知密度。
   8. 通过将所添加的总质量（杀虫剂和溶剂）除以所添加的总体积（溶剂和杀虫剂，若为液体形式）来计算母液的密度（g/mL）。将液体质量换算为体积的方法见步骤 2.1.7。
2. 通过 10% 系列稀释法对初始母液进行逐级稀释。如有需要，可利用这些系列稀释液建立初步的剂量-反应曲线，以确定生物测定中目标杀虫剂浓度范围。
   1. 计算每支试管中需添加的杀虫剂母液体积和溶剂体积（例如，将 1 mL 杀虫剂母液加入 9 mL 溶剂中，得到总体积为 10 mL、浓度为前一级 10% 的稀释液）。
   2. 将母液涡旋振荡 10 秒。将已预先标记的第一级稀释管置于天平上去皮归零。使用移液器将所需体积的母液加入第一级稀释管中。立即盖紧两支试管的管盖，并记录第一级稀释管中的质量。
   3. 再次将第一级稀释管去皮归零，加入所需体积的溶剂。立即盖紧管盖，记录所添加溶剂的质量，并将第一级稀释液涡旋振荡 10 秒。
   4. 对后续各级稀释液重复步骤 2.2.2 和 2.2.3。
   5. 按照上述步骤 2.1.6 所述方法储存所有稀释液。
   6. 参照步骤 2.1.7 计算各稀释液的实际浓度。
   7. 通过将所添加的总质量（杀虫剂溶液和溶剂）除以所添加的总体积（杀虫剂溶液和溶剂）来计算每种杀虫剂稀释液的密度。对于每一级系列稀释，使用前一级杀虫剂稀释液的密度，依据公式（2）计算新稀释液的密度：
      (2)
3. 可选：通过系列稀释法配制浓度增量更小的杀虫剂稀释液。
   1. 借助初始系列稀释的剂量-反应曲线、前期试验结果或已发表文献，选择每种新溶液的目标浓度和体积。
      注意：所选浓度应产生 0–100% 的死亡率范围，且该范围内至少应包含三个浓度点，以便进行概率单位（Probit）分析。
   2. 将系列稀释液作为母液，按照步骤 2.2 的方法，在 10 倍稀释液之间配制新的中间浓度稀释液。
4. 可选：对杀虫剂溶液进行分装。若配制了较大体积的杀虫剂溶液，建议将其分装至 1.5 mL 螺口管中，以避免因频繁操作和光照暴露导致母液污染、蒸发或降解。
   1. 从最低浓度开始，逐步向高浓度方向进行分装，以降低潜在污染风险。每次分装前，先将母液涡旋振荡 10 秒混匀，然后打开管盖，将所需体积（例如 0.5 mL）移取至已预先标记的螺口管中。
   2. 将分装后的样品储存在避光容器中，并置于 -20 °C 冰箱中。
      注意：建议定期（每月）用新鲜的小量分装样品替换原有分装液，这些新分装液应直接从原始杀虫剂稀释母液中取出。此举可避免污染扩散至其他实验，或因样品在实验台使用过程中发生蒸发或紫外线降解而引起变化。本方案在此处可暂停，并可在多年后重启，前提是杀虫剂溶液已妥善储存（参见步骤 2.1.6）并始终保存在 -20 °C 冰箱中。
5. 在储存前使用永久性记号笔标记液面弯月面，以监测溶剂蒸发情况。每次取出杀虫剂溶液进行分装时，均应重新标记液面弯月面。

3. 准备局部施用生物测定工作区

注意：建议在台式昆虫操作帐篷中进行操作，以便更轻松地捕捉逃逸的蚊子或苍蝇。昆虫操作帐篷的图片见补充图S1。

1. 从冷冻柜中取出所需的杀虫剂溶液，立即涡旋振荡，并将其置于避光容器中于室温下放置，使杀虫剂升温至室温后再使用。
   注意：在较低温度下，杀虫剂活性成分可能从溶剂中析出。此外，丙酮的体积会随温度变化，可能导致施用的杀虫剂剂量发生改变。混合溶液并使其升至室温有助于确保使用杀虫剂溶液时的一致性。
2. 根据材料表中所列，在昆虫操作帐篷内准备好进行点滴法测定所需的所有工具和材料。
3. 使用分析纯丙酮清洗注射器筒和针头，每份丙酮进行5次冲洗。共使用5份独立的丙酮，总计完成25次清洗。注射器和重复移液器部件详见补充图S2。
   1. 准备5个微量离心管，每个管中加入0.5 mL丙酮。
   2. 从第一个管中吸取0.025 mL丙酮至注射器筒内，然后迅速推动活塞将丙酮排入废液容器中。重复此操作四次，共完成同一份丙酮的5次清洗。随后，将注射器筒完全吸入空气，并将空气及可能残留的丙酮排入废液容器中。重复该操作两次，共完成三次“空气清洗”。
   3. 对剩余的4个丙酮管重复步骤3.3.2。
   4. 通过轻微上拉活塞（约5 mm），在注射器筒内、活塞与针头顶部之间形成一个气泡。
      注意：此气泡可防止活塞接触杀虫剂溶液，减少杀虫剂残留转移。
   5. 将注射器放置一旁，待准备进行点滴施用时再取出使用。
4. 建立一个包含待施用剂量的对照表，并使用随机数或随机字母生成器分配随机编号（参见补充文件1）。
5. 用随机编号标记塑料饲养杯，以便进行盲法死亡率评估。
   注意：如有需要，可在本步骤暂停实验流程，并在之后的某一天或时间继续。若暂停时间超过数小时，建议重复步骤3.3以确保注射器清洁，并将杀虫剂溶液放回冷冻柜保存，直至施药前约一小时再次取出并重复步骤3.1。

4. 为局部生物测定准备样品。操作流程概览见图1

1. 分选并称量蚊子
   1. 使用由吸气驱动的吸虫器，吸取实验所需数量的3-5日龄成年蚊子（包括为弥补损伤个体而多准备的数量）。将吸虫器尖端插入锥形管（每管最多100只蚊子），并在尖端周围包裹棉花，轻轻呼气并轻敲吸虫器，使蚊子转移至管中。移开吸虫器尖端后，用棉花塞住管口，再盖上管盖。避免一次性吸入或装入过多蚊子，以免对蚊子造成额外压力，导致死亡。
   2. 通过将装有蚊子的管子置于4 °C环境中至少10分钟，或将其埋入冰盒中的冰块下，短暂使蚊子昏迷。
      注：蚊子在2 °C条件下可存活数小时且死亡率极低²⁹；但为减少潜在的不利影响，应尽量缩短其处于冰上的时间。
   3. 将昏迷的蚊子转移至昆虫操作帐篷中，并小心地将其倾倒至放置在冰上的塑料托盘（例如培养皿）中。每次倾倒约50只蚊子，以确保每只蚊子均接触低温托盘并保持昏迷状态。
   4. 用镊子轻轻夹住蚊子的足部（或翅膀）按性别进行分选，并将不同性别的蚊子分别放入不同的暂存杯中。分选过程中记录每种性别的蚊子数量，达到所需数量后停止。同时剔除受伤（如缺失足部）、异常偏大（如腹部异常膨大）或偏小（肉眼明显小于该种群平均体型）的个体。
      注：通过附肢操作蚊子可减少对其柔软主体部位（如腹部）的结构损伤。
   5. 使用精度为0.1 mg的分析天平记录每杯蚊子的重量。
      1. 将一个空杯加盖培养皿后置于天平上，归零。将蚊子倒入容器中，盖上盖子，再将容器放回天平。
      2. 在记录表中记录总重量及样本数量（参见补充文件2）。立即将样本杯放回冰上，以保持其活动受限状态。
      3. 重复步骤4.1.5.1–4.1.5.2，直至所有样本杯均完成称重。
   6. 将准备好的蚊子按每杯20–25只分组，分别放入标注随机编号的冰上容器中。转移过程中应尽量减少镊子操作带来的应激和物理损伤。理想情况下，每只蚊子仅用镊子夹取1–2次：一次用于分选/称重，另一次（如有需要）用于转移至实验杯中。
      注：每杯20–25只蚊子为理想数量，既可作为一次重复实验，便于评估死亡率，又不会因密度过高导致应激或死亡。
2. 分选并称量果蝇
   1. 使用CO₂对果蝇麻醉7秒。
      注：若果蝇暴露于CO₂超过7秒，苏醒后可能出现爬行或飞行困难³⁰。
   2. 将果蝇倾倒至用实验纸包裹的冰袋上，使用细头画笔分离并计数雄性和雌性果蝇。
   3. 用画笔轻轻夹取选定的果蝇，放入干净的空培养瓶中。选择相同数量的雄性和雌性果蝇（例如15只雄性和15只雌性），并在培养瓶上标注品系名称和果蝇总数（例如Canton-S，30只果蝇）。
      注：保持雄性和雌性果蝇数量相等非常重要，因为雄性果蝇在脱离雌性环境后可能表现出更强的攻击性³¹。因此，为避免非杀虫剂引起的死亡或损伤，最好保持雄雌数量相等（或完全不使用雄性果蝇）。
   4. 使用分析天平记录每瓶果蝇的重量。
      1. 将一个空玻璃瓶（标注随机编号，参见步骤3.4）加盖培养皿后置于天平上，归零。
         注：建议使用玻璃瓶，因其可显著减少静电干扰。
      2. 对与该玻璃瓶随机编号对应的果蝇瓶使用CO₂麻醉7秒。
      3. 将果蝇倾倒至称量纸上，并利用纸张作为漏斗将果蝇引入玻璃瓶中。将培养皿盖在果蝇瓶上，再将瓶子置于天平上。
      4. 在记录表中记录总重量及样本数量，随后立即将果蝇瓶放入盛有冰的托盘中，瓶盖保持盖合，以防果蝇逃逸。
      5. 对每瓶果蝇重复步骤4.2.4.1–4.2.4.4。
3. 完成上述步骤后，立即进入下一环节。

5. 样品给药

1. 使用适当浓度的杀虫剂装填注射器。对每组生物，从最低浓度开始，逐步向最高浓度进行实验。为避免浪费，仅装填所需体积的杀虫剂，并额外加入推荐的2 µL。
2. 将样本轻轻倾倒至置于冰上托盘中的称量纸上。使用洁净且无杀虫剂残留的画笔或棉签将聚集在一起的样本分开，以便于逐个给药。对于蚊虫，还需使用画笔确保每个样本仰卧，使其腹面朝上。
3. 使用注射器将一滴杀虫剂溶液（对照组使用丙酮）施加于蚊虫的胸部和腹部腹面，或果蝇的背面。对于果蝇等体型较小的昆虫，使用0.2 µL的液滴（需使用10 µL注射器）；对于蚊虫，则使用0.5 µL的液滴（需使用25 µL注射器）。
   注意：主要身体部位（如头部、胸部和腹部）与附肢（如翅膀、腿或喙）在杀虫剂敏感性方面无显著差异³²。因此，只要药滴施加在主体部位，施用位置无需十分精确。选择蚊虫的胸腹部腹面作为施药部位，是因为其在击倒后常仰卧；而选择果蝇的背面，是因为其在击倒后常腹面朝下。这种对施药位置较低的精确性要求有助于提高本方法的通量。
4. 立即把样本倒回标记好的塑料杯中，并用网罩和橡皮筋封口。将杯子放入存放托盘，并在杯上注明在此过程中死亡、受损或逃逸的样本（以便在最终统计该杯样本数量时予以排除）。对于第一个杯子，记录完成给药的时间。
5. 更换用于放置样本的称量纸，以避免不同剂量之间的杀虫剂污染。
6. 依次对每个杯子进行给药，直至所有样本均接受相应浓度的杀虫剂处理，并记录全部样本完成给药的结束时间。
7. 通过浸润的棉球向每个杯子提供10%蔗糖溶液，将杯子静置，待次日进行死亡率评估。蚊虫应储存在27 ± 1 °C、相对湿度75 ± 5%的条件下⁵，果蝇则应储存在23 ± 1 °C、相对湿度60 ± 5%的条件下。
   注意：挤压棉球时需小心，避免过湿或过干。棉球应保持湿润但不滴水。若糖水在杯内滴落，可能导致样本死亡，从而影响杀虫剂死亡率的评估结果。

6. 评估死亡率

1. 在开始杀虫剂暴露后24小时记录样本死亡率。根据世界卫生组织（WHO）的描述⁶，若蚊虫能够飞行并保持直立姿态，则归类为存活；若无法移动或出现共济失调（无法站立或起飞），则归类为死亡。果蝇的死亡率评估也采用相同标准^8,33。
   注意：如需评估延迟死亡率，可在48小时和72小时后再次进行死亡率评估，并每日更换糖水。
2. 记录死亡率后，将所有装有样本的容器放入密封袋中，置于冰箱冷冻至少1小时，以确保所有样本均已死亡，然后再进行处理或后续使用（如分子或化学分析）。

7. 进行重复实验

1. 在新的一组样本上重复步骤 3-6，注意每天在同一时间进行重复实验，因为杀虫剂的敏感性可能随一天中的时间而变化³⁴。
2. 每种浓度至少进行 3 次重复，以准确估算致死剂量（LD₅₀，即杀死 50% 样本的剂量）。若观察到变异性较高，应增加重复次数。
3. 在收集完所有数据后完成分析。

8. 分析结果

1. 在电子表格程序中记录数据，并使用随机 ID 编码对数据进行解盲（参考步骤 3.4）。将数据保存为文本文件（示例数据见补充文件 3），用于统计软件 R³⁵（示例 R 代码见补充文件 4）或其他选定软件的分析³⁶。
2. 在软件程序中完成以下分析。示例 R 代码见补充文件 4。
   1. 根据下方公式（3）计算每单位标本质量（mg）所接受的杀虫剂剂量（ng）：
      （3）
   2. 计算死亡率，并应用 Abbott 公式³⁷，根据各对照组观察到的死亡率对死亡率进行校正³⁷。或者，也可使用 Schneider-Orelli（1947）公式对死亡率进行校正³⁸。无论对照组死亡率如何，均应对所有数据应用上述任一公式进行校正（如先前所述³⁷并已实施³⁹），除非对照组数据异常偏高（见下文讨论）。
      注：Abbott 公式及类似替代公式（如 Schneider-Orelli 公式）会按对照组未观察到的死亡程度对死亡率进行比例性调整，且不会降低死亡率为 100% 的样本杯的死亡率。有关更多信息，请参阅上述公式的引用文献。
   3. 将校正后的死亡率数据转换为概率单位（probit）值⁴⁰，并对杀虫剂剂量与转换后的死亡率数据进行线性回归分析。使用卡方检验评估线性模型的拟合优度。
      注：在进行概率单位转换前，需从数据中剔除死亡率为 0（0% 死亡率）或 1（100% 死亡率）的值。这是由于概率单位转换本身的性质所决定的。因此，最终绘图中的数据将不包括阳性或阴性对照，以及其他经 Abbott 校正后死亡率为 0% 或 100% 的数据点。
   4. 根据已发表的方法^39,41,42，按标本品系、种群和/或性别分别计算 LD₅₀ 及其 95% 置信区间（CI）。
   5. 注：若两个品系的 95% 置信区间无重叠，则表明这两个品系的剂量反应存在显著差异。
   6. 如适用，通过将目标品系的 LD₅₀ 除以参照/对照品系的 LD₅₀ 来计算抗性比值（RR）。

图1局部应用实验方案示意图 局部应用实验方案首先开始于（A) 在冰上分选样本，随后进行（B) 使用分析天平称量样品，(C）用杀虫剂溶液处理样本，以及（D杀虫剂暴露后，提供10%蔗糖溶液，静置24小时 随意 （通过浸湿的棉球），随后进行死亡率评估。红色箭头指示蚊虫（左）和果蝇（右）的杀虫剂施用位置。注意：图像未按比例绘制。 请点击此处以查看此图的放大版本。

结果

这些代表性结果展示了两种不同的菌株 埃及伊蚊、Rockefeller（ROCK）品系，以及来自佛罗里达州、具有已知击倒抗性突变F1534C和V1016I（IICC基因型）的独立野外分离株。此外， 黑腹果蝇 （中国台湾：S品系）被展示。

图2 和 图3 展示了按照上述方案测试的不同品系和性别的每种生物体的剂量反应关系。在每个蚊子品系内，雄性和雌性蚊子之间的剂量-反应曲线未观察到显著差异（ROCK品系：t = 1.70，p = 0.098；IICC品系：t = 0.64，p = 0.527），因此将同一蚊子品系中两性别的数据合并分析。ROCK和IICC品系的质量标准化LD₅₀分别为0.008 ng/mg（95% CI：0–0.104）和0.336 ng/mg（95% CI：0.235–0.438）。这些值的95%置信区间无重叠，表明两个品系的剂量反应存在显著差异。IICC品系相对于ROCK品系的抗性比（RR）为41.7，根据世界卫生组织（WHO）标准，属于高度抗性⁵。对于Canton-S果蝇，其质量标准化LD₅₀为0.213 ng/mg（95% CI：0–0.490）。

图2：采用点滴法生物测定获得的蚊虫代表性数据。 根据上述方案，使用溴氰菊酯对蚊虫进行点滴法生物测定所获得的代表性剂量-反应数据：（A）雌性Ae. aegypti ROCK（n = 880）和 IICC（n = 550）品系，（B）雄性Ae. aegypti ROCK（n = 880）和 IICC（n = 569）品系。溴氰菊酯测试浓度范围为 0.00075 ng/µL 至 9.68705 ng/µL，横轴表示每只蚊虫平均质量（mg）所施加的溴氰菊酯剂量（ng）。纵轴表示死亡率的比例。穿过每组数据点的黑线代表针对不同品系和性别的线性回归曲线。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：采用点滴法生物测定获得的果蝇代表性数据。 根据上述方案使用溴氰菊酯和果蝇进行点滴法生物测定所获得的代表性剂量-反应数据：D. melanogaster Canton-S 品系（n = 1014）。溴氰菊酯测试浓度范围为 0.00499 至 5.02876 ng/µL，x 轴表示每只平均果蝇质量（mg）所施加的溴氰菊酯剂量（ng）。y 轴以比例形式显示死亡率。黑色线条代表线性回归结果。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图 S1：台式昆虫操作帐篷。 台式昆虫操作帐篷用于在进行表面施用实验时更方便地捕捉逃逸的蚊子或苍蝇。图中结构在 A 中为关闭状态，在 B 中为打开状态。该结构由聚氯乙烯（PVC）管和细网眼织物制成。请点击此处下载此文件。

补充图 S2：注射器和重复给样装置单元。 用于昆虫给药的注射器和重复给样装置单元。主要部件包括 1）针头，2）注射器筒体，3）推杆，4）重复装置，以及 5）重复按钮。请点击此处下载该文件。

补充文件1：随机化脚本：用于为每个实验的所有杯子生成无偏标签的随机化脚本。请点击此处下载该文件。

补充文件2：死亡率评分表：用于辅助评估死亡率的评分表。该表格还包含记录本方案中提及的所有其他重要信息的位置，例如杀虫剂施用的开始和结束时间。请点击此处下载此文件。

补充文件3：示例死亡率数据：用于生成图2的示例数据文件。各列标题说明如下：“id” = 每个数据点的识别代码；“species” = 物种名称（例如，Aedes aegypti）；“insecticide” = 局部施用的杀虫剂名称（例如，Deltamethrin）；“strain” = 蚊株名称（例如，ROCK）；“date” = 局部施用的起始日期；“sex” = 蚊虫性别；“age” = 蚊虫年龄（young = 3–5日龄；old = 4周龄）；“total.mosq” = 批次中称重的蚊虫总数；“weight” = 批次内所有蚊虫的总重量（mg）；“concentration” = 杀虫剂浓度（µg/mL）；“syringe” = 注射器液滴体积（mL）；“dose” = 施加到每只蚊虫的杀虫剂有效成分量（ng）；“total” = 每杯中蚊虫数量；“dead” = 每杯中死亡蚊虫数量。请点击此处下载该文件。

补充文件4：R分析代码：可用于完成Probit分析（如方案第8步所述）的示例R代码。该R代码可与代表性结果（可通过补充示例数据文件获取）配合使用。请点击此处下载此文件。

讨论

本文介绍了一种适用于蚊子和果蝇的局部施用检测的改进方案。该方法所需专用设备极少，因此可轻松修改后用于野外工作及其他生物的研究。下文将详细说明本方案的关键步骤、可能的修改方法、故障排除建议、方法的局限性及其重要意义。

实验方案中的关键步骤： 本方案中有三个关键步骤，若操作不当，将极大影响生物测定的结果：杀虫剂浓度的准确性、试虫击倒情况以及死亡率评估。

杀虫剂浓度准确性：
准确配制杀虫剂溶液对于获得可重复的剂量-反应曲线和有意义的结果至关重要。在文献中，无论是CDC瓶法生物测定⁷还是点滴法应用^13,14,43，通常采用体积法配制杀虫剂溶液。然而，本文所述的重量法由于引入了（与温度相关的）密度参数，考虑了温度的影响，因而具有更高的内在准确性，可实现更精确的溶液配制。

标本击倒：
击倒标本是本方法的关键步骤之一，有助于准确施用杀虫剂并进行称重测量。然而，击倒生物体不可避免地存在造成物理应激和损伤的风险，此前已有研究证实³⁰。因此，在击倒标本时应谨慎操作，注意确保：i）每个标本的击倒时间相近，ii）击倒持续时间尽可能短，iii）所有标本采用一致的击倒方法。此外，建议在施用杀虫剂前单独测试击倒方法，以确认该方法有效，且不会导致对照组死亡率超过10%。初学者在初次测试时可能耗时较长，从而延长击倒时间。因此，在解读首次实验结果时应格外谨慎。

死亡率评估：
评估死亡率可能具有挑战性，尤其是当杀虫剂并未完全杀死蚊子或苍蝇，而仅仅是将其击倒或致残时。因此，了解杀虫剂对靶标生物的影响，并对死亡标准有明确定义至关重要。 "死亡的" （或基因敲低）的生物体。此外，建议由同一人评估不同剂量组和重复组之间的死亡率，以减少变异。

方案修改：以下描述的多种修改可用于改进本方案的通用性和可操作性。

将检测方法适用于体型更小或更大的昆虫：
使用体型更小或更大的样本时，建议相应地减少或增加杀虫剂的施用体积。例如，我们将蚊子实验方案调整用于果蝇时，将0.5 µL的剂量减少至0.2 µL。请确保根据所选的剂量体积选用合适规格的注射器。

将检测方法应用于野外昆虫：
使用野外昆虫时，昆虫个体大小可能存在更大差异。因此，建议将昆虫按较小群体（例如，每杯）分别称重，而不是以大群体（例如，一次实验所用的全部昆虫）整体称重。这有助于反映因野外昆虫质量差异而导致的杀虫剂敏感性潜在变化。

设备改装：
昆虫操作帐篷：可在由PVC管和蚊帐网简单搭建的昆虫操作帐篷内完成样本给药。该帐篷可作为封闭房间（例如昆虫饲养室）的替代方案，有助于避免在可能进行昆虫饲养的区域产生杀虫剂污染。这种昆虫操作帐篷易于搭建且成本低廉（约70美元）。此外，也可购买专用的昆虫操作笼（约425美元）。

冷藏台：可使用冰袋或冰盘来麻醉标本和/或保持标本处于麻醉状态。

培养箱：建议使用培养箱来饲养标本，并在杀虫剂处理后将标本保持24小时。如果无法获得培养箱，也可自行构建。构建培养箱所需的设备包括保温容器、加湿器、加热电缆、温湿度控制器以及光源，总成本约为170美元，该方案基于并扩展了先前的方法⁴⁴。

持杯：尽管使用塑料杯来分类和盛放处理后的样本，但涂蜡的纸杯或玻璃容器也可作为合适的替代品。

生物体及生活史阶段的修饰：
该方法具有高度适应性，可用于其他载体、昆虫和/或节肢动物，例如Culex quinquefasciatus蚊子³²、家蝇³²和蟑螂⁴⁵，也可用于非成虫生活史阶段，例如蚊子幼虫⁴⁶。

局部施用位置的调整：
本方法描述了将杀虫剂施用于蚊虫的腹胸部及腹部区域（果蝇则施用于背部）。然而，只要暴露部位保持一致，也可采用其他施用位置。保持一致性非常重要，因为杀虫剂的敏感性可能因施用位置不同而有所差异³²。

故障排除建议：该方法包含若干在初始阶段具有挑战性的步骤。以下列出了一些可能遇到的最常见问题。

杀虫剂溶液泄漏/挥发：
杀虫剂通常溶解于丙酮中，丙酮是一种高度挥发性的化合物。这意味着丙酮在室温下会迅速蒸发，导致杀虫剂浓度随时间升高。如果发现杀虫剂溶液出现泄漏或蒸发现象，应重新配制溶液，确保管盖拧紧，并再次确认是否严格遵循储存规程（例如是否使用了封口膜，以及试管是否直立存放）。若泄漏问题持续存在，可尝试减少试管中的液体体积，以预留更多空间，适应丙酮在不同温度下体积的变化。此外，若使用丙酮作为溶剂，应确保试管材质适用于丙酮储存（例如FEP、TFE和PFA塑料）。若使用疏水性杀虫剂，应将溶液储存于玻璃小瓶中（因为疏水性杀虫剂易吸附于塑料表面） 玻璃比塑料更不易渗透）。储存前标记溶液的弯月面位置以监测蒸发情况也是一种良好做法。

称量生物体时微量天平出现重量漂移：
如果天平读数发生漂移（缓慢上升或下降），可能是由于静电所致。在塑料器皿中称量生物体时最常出现此类漂移，因为塑料容易携带静电荷。为避免此问题，可在被称量的塑料容器下方放置称量纸，或使用玻璃等非塑料材质的容器进行称量。

异常死亡率结果：
死亡率结果可能出现异常的情况有多种，例如在对照组中观察到较高的死亡率，或在所有杀虫剂剂量下均出现较高或较低的死亡率。请查看以下各种情况，以针对每种情形进行故障排查。

对照组死亡率过高
如果对照组出现较高的死亡率（10%或以上），应评估击倒方法以及标本暴露于击倒条件的时间长度。如有可能，应缩短标本的击倒时间。导致对照组死亡率升高的其他潜在因素包括：i）检查培养箱设置是否正确——异常的温度和/或湿度可能导致死亡率升高，应使用独立的数据记录仪检测温度和湿度；ii）评估昆虫操作过程，过度或粗暴地处理昆虫可能导致较高的死亡率；iii）检查用于处理对照组的100%丙酮或实验仪器上是否存在杀虫剂污染。应更换丙酮，并用丙酮或乙醇彻底清洁所有仪器。为避免污染，应频繁更换手套，防止液体溢出，并定期清洁仪器。请注意，在补充文件3中，对照组（仅使用丙酮）的容器内最多仅有两只蚊子死亡。该水平的死亡率不被视为过高（低于10%），因此无需担忧。

所有暴露组均出现高死亡率（但对照组未出现）
使用较低浓度的杀虫剂或较小的剂量体积进行测试。所使用的剂量可能超过了不会引起死亡的最低剂量。可通过设置多个10倍梯度稀释浓度来确定合适的剂量范围，并排除污染的可能性。为避免污染，应从最低浓度开始施加剂量，并逐步向最高浓度进行。此外，务必定期使用丙酮和/或乙醇清洁所有使用过的设备，施加到样本上的剂量应非常微小，即使极轻微的交叉污染也可能影响实验结果。

所有暴露组的死亡率均较低
使用更高浓度的杀虫剂。所使用的剂量可能均过低，不足以在种群中引起死亡。为确定正确的剂量范围，应将样本暴露于若干个更高10倍浓度梯度的剂量中。确保杀虫剂溶液未过期或降解（可能由于高温或光照暴露所致）。如果溶液已过期或怀疑已降解，请重新配制溶液，并确保遵循正确的储存条件。

不同重复组/天之间的死亡率不一致
昆虫暴露于杀虫剂的时间点可能影响其表现出的抗性水平，尤其是代谢抗性³⁴。每天在相同的时间窗口内重复本实验方案，以避免因时间差异成为导致死亡率变化的潜在变量。其他可能导致重复组间死亡率不一致的因素包括：i) 不同实验间昆虫的饲养条件存在差异。确保所有个体处于相同的年龄范围，并在相同的温度、相似的饲养密度和食物供应条件下培育。ii) 杀虫剂浓度随时间降解 或因丙酮挥发而 导致浓度升高。应重新配制溶液，并确保适当的储存条件。iii) 死亡率评分不一致。应由同一人进行死亡率评分，或制定明确的评分流程供团队成员统一使用。采用盲法评分以减少死亡率判定中的偏倚。

昆虫粘附在分拣托盘表面的问题：
丙酮会与本实验方案中使用的塑料材料（如培养皿）发生反应。若在培养皿或类似的塑料表面使用丙酮，标本很可能粘附于表面。可通过在分拣托盘内铺垫称量纸或使用非塑料材质的分拣托盘来避免此类粘附现象。此外，分拣托盘或盛放杯的塑料表面产生冷凝水，也可能导致昆虫粘附在水珠上；或者标本温度过低，可能冻结在表面。应调整击晕方法，以减少冷凝水的形成，同时防止 标本温度过低或冻结（例如，在标本与塑料分拣托盘之间放置称量纸）。

R 分析错误：
收集死亡率数据后，在分析过程中可能会出现多种问题。导致 R 代码无法对数据文件执行操作的最常见原因是数据格式与代码不匹配（例如，列标题和/或空单元格）。如果出现更严重的问题，请参考 Rstudio 内置的 R 帮助页面³⁵。

上述局部施药方法的局限性：
通过局部施药方式吸收杀虫剂无法模拟自然暴露情况：
在昆虫主要体表进行局部施药并非杀虫剂吸收的自然途径。在实际环境中，昆虫主要通过足部在接触杀虫剂处理表面的整个过程中吸收药剂，或通过翅膀接触微小的气溶胶颗粒^47,48，而非通过腹面快速暴露。然而，直接施加已知剂量的杀虫剂能够准确建立昆虫对杀虫剂的表型反应，这对于遗传学和进化研究，或在不同空间和时间尺度上比较昆虫对杀虫剂的敏感性至关重要。因此，该方法适用于检测技术性抗性，但无法直接衡量实际抗性（即在田间条件下实际干预工具的有效性¹⁵）。但需要注意的是，目前的标准方法（例如 WHO 试管试验和 CDC 瓶式生物测定）同样无法捕捉或模拟田间气溶胶（如喷雾）杀虫剂暴露的情况。

局部施用试验仅可用于评估具有接触吸收作用的杀虫剂：
该方法适用于通过接触和吸收起效的杀虫剂，不适用于胃毒型杀虫剂，例如常用于诱杀性毒糖饵中的硼酸⁴⁹。

该方法的意义：
局部施用法通过计算致死剂量（而非浓度）并测量技术性（而非实用性）抗性，进一步拓展了杀虫剂生物测定中已确立的标准¹⁵。以下是该方法相较于现有杀虫剂敏感性测定方法的优势与局限性。

致死剂量计算：
该方法用于确定杀虫剂的致死剂量，而非美国疾病控制与预防中心（CDC）和世界卫生组织（WHO）生物测定中用于确定区分剂量的致死浓度¹¹。致死剂量更具意义，因为它是已知可引发死亡反应的杀虫剂量化剂量。相比之下，致死浓度并未考虑生物体实际摄入的杀虫剂量。在使用致死剂量计算时，可更准确地观察和量化不同性别或体型依赖的敏感性差异，使该测量方法具有更高的适用性。

技术抗性：
该方法用于评估技术抗性，即在标准化、受控环境中测得的抗性。此类测量适用于监测杀虫剂抗性的传播情况，并将表型抗性与潜在的抗性标志物相关联¹⁵。由于采用点滴法生物测定所导致的死亡率变异较小，因此更有利于识别新的抗性标志物。然而，由于该方法使蚊虫接触杀虫剂的方式不符合自然暴露条件，因此不适用于评估特定干预措施在特定人群中的实际效果。对于此类实际抗性的测定，需要采用其他生物测定方法¹⁵。

样本适用性：
该方法可通过简单调整击倒方式和/或杀虫剂剂量、体积和/或浓度（如上所述），应用于其他重要的节肢动物，例如农业害虫（如科罗拉多马铃薯甲虫）、家居害虫（如蟑螂和床虱）或传粉昆虫（如蜜蜂）。其易于调整的特性有助于在不同研究领域之间类比杀虫剂抗性研究。采用半数致死剂量（LD₅₀）而非半数致死浓度（LC₅₀）进行评估，可实现不同物种间的准确比较。

成本：
与美国疾病控制与预防中心（CDC）瓶饲生物测定法和世界卫生组织（WHO）管测试类似，表面施用测定法的运行成本极低（参见材料表）。所需关键设备为注射器（约70美元）和分配器（约100美元），这些设备可在多次测定中重复使用。

所需样本数量：
每次进行点滴法测定实验时，每个处理杯中至少应使用 20–25 个样本。建议每项实验至少测试五种杀虫剂浓度，每种浓度至少设置三个重复。总体而言，完成一次完整的测试至少需要 300–375 个样本，这一数量与使用 WHO 筒法或 CDC 瓶法进行抗药性强度测试所需的样本量相当。然而，若点滴法生物测定能够实现更小的变异度，则相同数量的样本可能提供更强的统计效能，用于比较不同空间或时间下的敏感性数据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Thomas Scientific	20A00L068	丙酮分装储存
1.5 mL 螺口管	Thomas Scientific	1182K23	杀虫剂稀释液储存
15 mL 锥形管	VWR	339651	杀虫剂稀释液储存
20 mL 玻璃闪烁瓶	Fisher Scientific	0334125D	果蝇称重
25 μL 注射器	Fisher Scientific	14815288	局部施药器
丙酮	Fisher Scientific	AC423240040	ACS 级，纯度 99.6%，4 L
Aedes aegypti（IICC 品系）	USDA CMAVE	NA	杀虫剂抗性
Aedes aegypti（Rockefeller 品系）	CDC	NA	杀虫剂敏感
分析天平	Fisher Scientific	14-557-409	精度达 0.1 mg
吸虫器	Amazon	6.49986E+11	蚊虫采集装置
实验台纸	VWR	89126-794	置于工作台面下方
棉签	Amazon	B092S8JVQN	用于昆虫分选
脱脂棉球	Amazon	B0769MKZWT	用于蔗糖溶液
移液器分配器	Fisher Scientific	1482225	重复移液器
Drosophila melanogaster（Canton-S 品系）	威斯康星大学麦迪逊分校	NA	杀虫剂敏感
细头毛笔	Amazon	B07KT2X1BK	用于昆虫分选
果蝇培养瓶	Fisher Scientific	AS355	用于果蝇饲养与分选
手持式 CO2 麻醉装置	Fisher Scientific	NC1710679	用于击倒昆虫
暂存杯	Amazon	B08DXG7V1S	透明塑料杯
冰袋	Amazon	B08QDWMMW5	用于击倒果蝇
制冰盒	Amazon	9301085269	用于击倒昆虫
昆虫镊子	Amazon	B07B4767WR	昆虫镊子
杀虫剂	Sigma-Aldrich Inc	45423-250MG	溴氰菊酯
标签贴纸	Amazon	B07Q4X9GWX	3/4" 彩色圆点贴纸
标签胶带	Amazon	B00X6A1GYK	白色胶带
网布	Amazon	B07F2PHHWV	用于覆盖暂存杯及昆虫操作帐篷
培养皿	Fisher Scientific	FB0875712H371	100 mm × 15 mm
PVC 管	Lowe’s	23971	昆虫操作帐篷材料
橡皮筋	Amazon	B00006IBRU	用于固定杯口网罩
蔗糖	Amazon	B01J78INO0	白砂糖
称量纸	VWR	12578-165	4" × 4"