方法文章

软物质纳米压痕的实验与数据分析流程

DOI：

10.3791/63401

⸱

2022年1月18日

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1Centre for the Cellular Microenvironment, James Watt School of Engineering, University of Glasgow, 2Optics 11 life, 3Laboratory of Biosensors and Bioelectronics, ETH Zürich

本文内容

摘要

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本方案介绍了一种用于软材料纳米压痕实验的完整工作流程，包括水凝胶和细胞。首先，详细阐述了获取力谱数据的实验步骤；随后，通过一款新开发的开源 Python 软件对这类数据进行分析，该软件可从 GitHub 免费下载。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

纳米压痕指的是一类实验技术，通过使用微米级的力探针来量化软性生物材料和细胞的局部力学特性。该方法在力学生物学、生物材料设计 和组织工程领域中已占据核心地位，能够以接近单个细胞尺寸（μm）的空间分辨率，对软材料进行准确的力学表征。目前获取此类实验数据最常用的方法是使用原子力显微镜（AFM）；尽管该仪器在力（低至pN）和空间（亚纳米级）分辨率方面具有前所未有的优势，但其复杂的操作限制了其在常规测量中的应用，例如难以高效获取杨氏模量（E）等整体力学参数。近年来，基于光纤传感技术的新一代纳米压痕仪因其易于集成、并可在微米级空间分辨率下施加亚纳牛（sub-nN）级力而日益受到关注，因此适用于水凝胶和细胞等样品的局部力学性能探测。

本方案详细介绍了使用商用的光纤顶端传感纳米压痕仪获取水凝胶和细胞纳米压痕数据的实验操作步骤。尽管部分步骤针对本文所用仪器而设定，但只要根据制造商指南对某些步骤进行适当调整，该方案也可作为其他纳米压痕设备的操作参考。此外，本文还介绍了一款新的开源 Python 软件，该软件配备用户友好的图形界面，可用于纳米压痕数据的分析，功能包括对采集异常的力-位移曲线进行筛选、数据滤波、通过多种数值方法计算接触点、常规弹性模量 E 的计算，以及适用于单细胞纳米压痕数据的更高级分析方法。

引言

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如今，力学在生物学中的基础作用已得到公认1,2。从整个组织到单个细胞，机械特性能够反映被研究生物材料的病理生理状态3,4。例如，受癌症影响的乳腺组织比健康组织更坚硬，这一概念正是常用触诊检测方法的基础5。值得注意的是，最近研究表明，由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）伴随着血细胞机械特性的改变，与未感染SARS-CoV-2的个体相比，表现为红细胞变形能力下降，以及淋巴细胞和中性粒细胞刚度降低6。

通常情况下，细胞与组织的力学特性本质上是相互关联的：每种组织都具有特定的力学性质，这些性质同时影响并依赖于其组成细胞及细胞外基质（ECM）的力学特性5。正因如此，研究生物学中力学特性的策略通常涉及构建具有生理相关力学刺激的工程化基底，以阐明细胞对这些刺激的响应行为。例如，Engler 及其同事的开创性研究证明，间充质干细胞的谱系分化由基质弹性所调控，该结论是在软性和刚性二维聚丙烯酰胺（PAAm）水凝胶上研究得出的7。

目前存在多种用于力学表征待研究生物材料的策略，这些策略在空间尺度（即从局部到整体）和变形模式（例如轴向与剪切）上各不相同，因此会得到不同的信息，需谨慎解读3,8,9,10。软性生物材料的力学性能通常以刚度来表示。然而，刚度同时依赖于材料特性和几何形状，而弹性模量则是材料的基本属性，与材料的几何形状无关11。因此，不同的弹性模量与特定样品的刚度相关联，每种弹性模量反映了材料在不同边界条件（例如自由膨胀与受限）下对特定变形模式（例如轴向与剪切）的抵抗能力11,12。纳米压痕实验可通过E来量化材料的力学性能，当生物材料未受侧向约束时，该参数对应于单轴变形（压痕）过程10,11,12。

最常用的方法是定量 E 在微尺度上研究生物系统的方法是原子力显微镜（AFM）13,14,15,16原子力显微镜是一种极为强大的工具，其力分辨率可达皮牛（pN）级别。 分辨率可达亚纳米级。此外，原子力显微镜在与互补的光学和机械工具联用方面具有极高的灵活性，从而扩展了其功能，可从被研究的生物材料中获取大量信息13然而，这些吸引人的特性也伴随着实验装置复杂性所带来的入门门槛。原子力显微镜（AFM）在获得可靠数据之前需要经过 extensive 的培训，且在日常生物材料力学表征中往往并不适用，尤其是当无需其独特的力分辨率和空间分辨率时。

正因如此，一类新型纳米压痕仪由于操作简便，同时仍能提供与原子力显微镜（AFM）相当的数据——具有亚纳牛（sub-nN）级的力分辨率和微米级（µm）的空间分辨率，能够反映细胞在相关尺度下施加和感知的力学作用，近年来日益受到关注2。特别是基于光纤传感技术的套管顶端式纳米压痕装置17,18，在从事力生物学及相关领域研究的科研人员中广受欢迎；已有大量文献利用此类装置报道了生物材料的力学特性，包括细胞19,20、水凝胶8,21以及组织22,23。尽管这些系统具备探测局部动态力学性能（即储能模量和损耗模量）的能力，但目前最常用的方法仍是获得弹性模量（E）的准静态实验8,19,20,21。简而言之，准静态纳米压痕实验 通常以恒定速度对样品进行压入，直至达到预设的目标值（由最大位移、力或压入深度定义），并同时记录悬臂的力和垂直位置，从而获得所谓的力-距离（F-z）曲线。F-z 曲线随后通过确定接触点（CP）转换为力-压入深度（F-δ）曲线，并采用合适的接触力学模型（通常为赫兹模型13）进行拟合，以计算 E。

尽管套管顶式纳米压痕仪的操作类似于原子力显微镜（AFM）测量，但仍有一些特殊之处值得考虑。本文提供了使用商用套管顶式纳米压痕仪从细胞和仿组织水凝胶中稳定获取F-z曲线的逐步操作指南，旨在促进使用此类及其他类似设备的研究团队之间实验流程的标准化。此外，还给出了水凝胶样品和细胞样品制备的最佳建议，并针对实验过程中的常见问题提供了故障排除提示。

此外，纳米压痕实验结果（即弹性模量 E 及其分布）的大部分变异性取决于所采用的数据分析方法，而该过程并非简单。为解决这一问题，本文提供了使用一种新开发的开源软件的操作指南，该软件采用 Python 编程，配备用户友好的图形用户界面（GUI），可用于对 F-z 曲线进行批量分析。该软件支持快速数据筛选、数据过滤、通过多种数值方法计算接触点（CP）、常规 E 值计算，以及一种更为先进的分析方法——弹性谱分析24，从而可估算细胞整体的杨氏模量、肌动蛋白皮层的杨氏模量以及肌动蛋白皮层的厚度。该软件可从 GitHub 免费下载，并可通过添加适当的数据解析器，轻松适配用于分析来自其他系统的数据。需要强调的是，本实验方案也可用于其他光纤端面式纳米压痕装置，以及一般的其他纳米压痕设备，只需根据具体仪器的操作指南对部分步骤进行相应调整即可。本方案在 图1 中进行了示意图式总结。

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方案

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1. 纳米压痕测量用基底/细胞的制备

  1. 按照补充方案中的步骤制备用于纳米压痕实验的PAAm水凝胶/细胞。该流程在图2中进行了总结。
    注：选择PAAm水凝胶是因为它们是力学生物学领域中最常用的水凝胶。然而，本方案同样适用于任何类型的水凝胶25（参见讨论部分中关于方法的修改）。

2. 启动设备、探头选择与探头校准

  1. 按照补充方案中的步骤启动设备。有关光纤插芯式纳米压痕仪操作的技术细节，请参阅以下参考文献17,18。
  2. 按以下说明选择纳米压痕探针。
    注意：所有市售探针（包括本方案中使用的探针）均配备球形针尖（图3A）。因此，选择主要取决于两个变量：悬臂梁刚度和针尖半径（图3B）。
    1. 为获得最佳结果，应根据样品预期的刚度选择匹配的悬臂梁刚度（k，单位为 N/m）15（见图3C及讨论部分中的关键步骤）。对于细胞，应选择 k 在 0.01–0.09 N/m 范围内的探针；对于水凝胶，应选择 k 在 0.1–0.9 N/m 范围内的探针，这适用于弹性模量 E 预期在几 kPa 至 100 kPa 之间的凝胶（见代表性结果）。
    2. 根据压痕过程中所需的空間分辨率选择针尖半径（R，单位为 μm）。对于较小的细胞（如人胚胎肾293T（HEK293T）细胞，平均直径约为10–15 μm26），应选择 R = 3 μm 的球形针尖；对于水凝胶，应选择 R = 10–250 μm 的球形针尖，以便在较大接触面积上探测生物材料的力学性能，并避免局部不均一性的影响。
    3. 参考图3C以及制造商提供的其他指导文件，选择合适的探针。
  3. 选定探针后，按照补充方案中的步骤将其安装到纳米压痕仪上。

3. 探针校准

注意：以下步骤专用于基于光纤传感技术的套管式纳米压痕装置，并针对软件版本 3.4.1 进行了详细说明。对于其他类型的纳米压痕装置，请遵循设备制造商推荐的操作步骤。

  1. 在软件的主窗口中，单击 初始化校准菜单将出现。输入探头详细信息（可在探头包装盒侧面找到）； k 单位为 N/m R 以 µm 为单位，并在输入框中填写空气中的校准因子。
  2. 准备校准培养皿：一个底部平坦的厚玻璃培养皿（参见 讨论，方案中的关键步骤）。用与样本培养皿相同的培养基填充该培养皿（也可为空气）。使培养基的温度与样本温度一致。
  3. 将校准皿置于探针下方。如有需要，可将探针从纳米压痕仪的臂架中滑出，并用手握住，以便放置校准皿。随后将探针重新滑回原位。
  4. 在液体中进行校准时，请执行接下来的两个步骤。若在空气中测量，则使用提供的聚四氟乙烯基底进行校准，并跳至步骤5。
    1. 使用巴斯德移液管，将管尖轻轻接触玻璃套管，滴加一滴70%乙醇润湿探针，使液滴沿悬臂和球形探头表面滑过27 （参见 讨论，方案中的关键步骤。
    2. 手动将纳米压痕仪的机械臂向下移动，直至探针完全浸入液体，但仍远离培养皿底部。如有需要，可向校准皿中添加更多培养基。等待5分钟，使液体达到平衡状态。
  5. 在软件中 初始化 菜单，单击 扫描波长干涉仪的屏幕将显示一个进度条和 实时信号 计算机软件窗口将显示所示的图案 图 S1A，左侧。要检查光学扫描是否成功，请转至 波长扫描 干涉仪盒子上的面板。如果成功，应可见正弦波（图1A，右侧）。参见 讨论 （该方法的故障排除）如果出现错误。
  6. 在 初始化 菜单，单击 寻找表面，将逐步降低探针，直至悬臂弯曲达到预设阈值。当探针接触玻璃培养皿时，即停止移动。
  7. 检查探针是否与表面接触。使用微调装置将探针向下移动 1 µm。 y 软件主窗口上的向下箭头按钮。观察绿色信号（悬臂的偏转）在 实时窗口 软件在悬臂与基底接触时，每一步对基线变化的监测图S1B）。如果没有变化，则悬臂未接触（见下一步）。
  8. 增加 阈值 值在 选项 菜单下方 寻找表面 将选项卡从其默认值 0.01 开始，每次以 0.01 为步长进行调整，并重复该过程 寻找表面 逐步下移探针直至接触。或者，以每次1 µm的微小步长降低探针，直至每次向下移动时绿色基线开始发生偏移。
    注意：对于最柔软的悬臂梁（k = 0.025 Nm-1），增加 阈值 值在 选项 菜单下方的 寻找表面 标签 先验的 执行步骤6时，从0.06或0.07的阈值开始，必要时可逐步增加至0.1。这是因为环境噪声可能导致悬臂在接触前就发生弯曲并超过阈值。对于较软的探针，可适当降低 进近速度（μm/s） 同一菜单中的设置也能优化该操作流程。
  9. 在 初始化 菜单，单击 校准.
  10. 检查 实时信号 软件窗口，并确保压电陶瓷的位移信号与悬臂梁的偏转信号同时向上移动（图S1C).
    1. 如果时间不匹配，则表明探针未完全接触玻璃。以1 µm为步长向下移动探针，直至悬臂信号的基线发生变化（见步骤7），然后重复步骤9。
    2. 如果悬臂梁信号在期间完全不发生变化 校准 步骤，此时探针远离表面。逐步增加接触阈值（参见步骤8），直至准确找到表面，然后从波长扫描开始重复整个校准过程。
  11. 校准完成后，在弹出窗口中检查旧的和新的校准因子。如果新的校准因子处于正确范围内，请点击 使用 新因子如果校准失败，且新因子为 NaN 或不在预期范围内，请参见 讨论 （该方法的故障排除）以解决问题。
    注意：新因子应约为 ~n 比探针盒上提供的数值低若干倍，具体取决于校准所用液体介质的折射率 n (n 水的折射率约为1.33。若校准是在空气中进行的，则新的和旧的校准因子应大致相等。
  12. 检查解调圆是否已正确校准，步骤如下。导航至 解调 干涉仪桌面标签。轻轻敲击光学平台或纳米压痕仪以引入足够的噪声。由离散数据点组成的白色圆圈应大致覆盖红色圆圈图 S1D).
  13. 如果白色圆圈未与红色圆圈重叠，或干涉仪显示屏上出现警告，则需要重新校准解调圆。可通过以下两种方法进行。
    1. 持续轻敲纳米压痕仪的机身，以产生一圈完整的噪声，然后按下 校准 干涉仪上的按钮
    2. 与玻璃基底接触并按压 校准 来自 初始化 软件主窗口的菜单。不要保存校准因子。此时，再次检查并确保白色圆圈与红色圆圈完全重合。
      注意：如果信号并非只是略微偏离解调圆，而是变得非常微弱或完全不可见，则表明悬臂梁已粘附到光纤上。请参照此问题的故障排除建议（见 讨论，对该方法进行故障排除），然后重复步骤13.1或13.2。一旦悬臂恢复至水平位置（图3A），信号将恢复到解调圆。
  14. 校准完成后，立即按照下述方法在玻璃基底上进行压痕操作，以验证校准结果。
    1. 单击以加载或创建实验文件 配置实验 并添加一个 寻找表面 步骤和 压痕 步骤。对于压痕步骤，使用默认的位移模式设置，并将最大位移调整为校准距离（3,000 nm），以使探针压向坚硬基底。
    2. 点击 运行实验 检查干涉仪窗口中的解调圆。观察白色信号，并确保在压痕过程中它始终位于红色圆圈的上方。
    3. 在软件主窗口中查看结果 时间数据 图表，并确保压电元件的位移（蓝线）等于悬臂梁的挠度（绿线），因为压痕从接触开始，且预期无材料变形。如果信号不平行，请参见 讨论 （方法的故障排除）
  15. 在校准菜单中通过设置更改本地路径 校准保存路径 到适当的目录。
  16. 探针成功校准后，将压电装置向上移动500 μm。

4. 测量软材料的杨氏模量

  1. 水凝胶的纳米压痕
    1. 将含有样品的培养皿放置在显微镜载物台上，并手动移动纳米压痕探针至样品上方所需的 x-y 位置。
    2. 手动在溶液中滑动探针，注意在此阶段使探针与样品表面之间保持 1–2 mm 的距离。等待 5 分钟，使探针在介质中达到平衡。
    3. 调节光学显微镜的 z 焦平面，使探针清晰可见。
    4. 执行一次单点压痕以优化实验参数，具体步骤如下：
      1. 在软件主窗口中配置新实验。点击 配置实验，将打开一个新窗口。添加一个 寻找表面 步骤。如有需要，可在软件的 选项 菜单中修改 寻找表面 步骤的所有参数。
        注： 寻找表面 将降低探针直至检测到表面，然后将探针回撤至距离样品表面一定高度，该高度由 Z Above Surface (µm) 定义。如果所选悬臂梁相对于样品过刚硬，或样品具有黏性，则在该步骤后探针可能仍与样品接触，导致力-位移曲线缺乏基线（图4C）。为解决此问题，请增大 Z Above Surface (µm) 的设定值。
      2. 添加一个 压痕 步骤。选择 轮廓 选项卡并点击 位移控制。保留默认的压痕轮廓设置。
      3. 在软件主窗口中点击 运行实验。该操作将定位表面并执行一次单点压痕。如果单次压痕结果不符合预期，请根据 图4 和 讨论 部分（方法的故障排除）中所述调整实验参数。
    5. 当压痕结果符合预期后，配置矩阵扫描，以确保对样品足够大的区域进行压痕。点击 配置实验，添加一个使用先前确定参数的 寻找表面 步骤，并添加一个 矩阵扫描 步骤。
    6. 对于平坦的水凝胶，配置包含 50–100 个点（即 x 和 y 方向为 5 × 10 或 10 × 10）的矩阵扫描，点间距为 10–100 µm（即 dx = dy = 10–100 µm）。点击 使用载物台位置，以当前载物台位置作为矩阵扫描的起始点。确保勾选 自动寻找表面 选项，以便在每次压痕时使用设定的实验参数重新定位表面。
      1. 为避免过度采样，应将步长设置为至少两倍接触半径（静力平衡方程，a=√Rδ，符号分析，物理公式研究。，其中 δ 为压痕深度）。
      2. 在位移控制模式下设置矩阵扫描轮廓。确保该轮廓不违反赫兹模型的假设条件（参见 讨论 部分：本方案中的关键步骤）。
      3. 将段数保留为默认值 5，并使用默认的位移轮廓。如有必要，可调整最大位移和每段斜坡的时间，分别影响最大压痕深度和应变率。切勿超过 10 μm/s 的应变率（> 见 讨论 部分：方法的局限性）。
      4. 输入接近速度值，该值决定探针在接触前向样品移动的速度。建议将回撤速度设置为与接近速度相同（见下文注释）。
        注：对于较软的悬臂梁和噪声较大的环境，建议使用 1,000–2,000 nm/s 的接近速度；对于较硬的悬臂梁和受控环境，可适当提高该值。
      5. 在 配置实验 窗口的 常规 选项卡中，将已配置的实验保存至所需的 实验路径，并在 保存路径 中选择数据存储目录。点击 运行实验。
    7. 完成矩阵扫描后，将探针抬高 200–500 µm，并将其移至样品上远离前一区域的另一位置。
    8. 至少重复实验两次，以确保每个样品获得足够的数据（即每个样品至少进行两次矩阵扫描，每次包含 50–100 条曲线）。
  2. 细胞的纳米压痕
    1. 如上所述，将样品装载到显微镜上。
    2. 对于单细胞压痕，调节 z 焦平面，使细胞和探针在 20× 或 40× 放大倍数下均可见，具体取决于细胞大小和铺展程度。
    3. 将探针移至待压痕细胞的正上方。
    4. 在软件主窗口中配置新实验。点击 配置实验，将打开一个新窗口。添加一个 寻找表面 和 压痕 步骤，使用位移模式下的默认参数。
    5. 点击 运行实验，系统将定位表面并执行一次单点压痕。检查压痕是否成功。如果曲线不符合预期，请调整实验参数（参见 图4 和 讨论 部分：方法的故障排除）。
    6. 若压痕成功，则在实验中添加矩阵扫描。参照水凝胶纳米压痕实验的步骤进行操作；配置矩阵扫描时，设置步长以确保仅对细胞的小区域进行压痕；例如，对于 HEK293T 细胞，可设置 25 个点，点间距为 0.5–5 µm。
      1. 根据细胞大小调整矩阵扫描设置，确保探针尖端不会压痕到细胞边界之外，例如采用不同的扫描图样或减少探测点数。
    7. 点击 运行实验 并等待其实验完成。
    8. 完成矩阵扫描后，将探针抬离接触位置（在 z 方向上提升 50 µm）。
    9. 将探针移至另一个新细胞上方，并重复上述过程（参见 讨论 部分：本方案中的关键步骤）。
  3. 探针清洁与仪器关闭
    1. 按照 补充方案 中提供的步骤清洁探针并关闭纳米压痕设备。

5. 数据分析

  1. 下载并安装软件
    1. 按照补充方案中的步骤下载并安装用于数据分析的软件28,29。
  2. 筛选 F-z 曲线并生成JSON格式的清洗后数据集
    1. 在实验室计算机上，按照步骤2至3所述，从命令行启动prepare.py。
    2. 如果使用Windows计算机，按住Shift键的同时右键单击NanoPrepare文件夹，然后点击在此处打开PowerShell窗口。输入python prepare.py命令，然后按Enter键。此时屏幕上将弹出一个图形用户界面（GUI）（图S2）。
    3. 如果使用MacOS计算机，右键单击NanoPrepare文件夹，然后点击在文件夹中新建终端。输入python3 prepare.py命令，然后按Enter键，这将启动图形用户界面（GUI）（图S2）。
    4. 从下拉列表中选择O11NEW数据格式。如果数据未能正确加载，请重新启动GUI并选择O11OLD。
      注意：O11NEW格式适用于使用软件版本3.4.1的套管顶部光纤传感纳米压痕设备所获取的数据。该格式也适用于之前的软件版本，至少包括2019–2020年安装的纳米压痕仪所使用的版本。
    5. 点击加载文件夹。选择包含待分析数据的文件夹——可以是单个矩阵扫描或多个矩阵扫描。上方图表（原始曲线）将显示上传的数据集。要查看特定曲线，请点击该曲线，它将以绿色高亮，并在下方图表（当前曲线）中显示。
    6. 使用GUI右侧的选项卡对数据集进行清洗，具体步骤如下：
      1. 使用“分段”按钮选择需要分析的正确分段，即F-z曲线的前进段。具体编号取决于在进行实验时纳米压痕软件中设置的分段数量。
      2. 使用裁剪50 nm按钮，在最左侧（若勾选L）、右侧（若勾选R）或两侧（若同时勾选R和L）将曲线裁剪50 nm。可多次点击此按钮以实现所需的裁剪程度。此操作用于去除F-z曲线起始或结束位置存在的伪影。
      3. 检查悬臂梁选项卡中的弹簧常数、探针几何形状和探针半径。检查该选项卡以确保元数据已被正确读取。
      4. 使用筛选选项卡设置力阈值，所有未达到该力值的曲线将被舍弃。被舍弃的曲线将以红色高亮显示。
      5. 使用手动切换按钮手动移除采集不正确的曲线。通过点击特定曲线并选择OUT来移除曲线，该曲线将以红色高亮显示。
    7. 点击保存JSON。为清洗后的数据集输入合适的名称，生成单个JSON文件。将该JSON文件发送至已安装NanoAnalysis软件的计算机。

6. 正式数据分析

  1. 启动 nano.py 通过命令行导航到文件 纳米分析 文件夹并按照之前所述方法启动终端。输入 python nano.py 或 python3 nano.py 命令（根据操作系统而定）并按下 输入 关键。此时屏幕上将弹出一个图形用户界面（GUI）图 S3).
  2. 在图形用户界面的左上角，单击 加载实验 并选择 JSON 文件。这将填充文件列表和 原始曲线 显示数据集的图表 F-z 曲线。两者 F 和 z 坐标轴相对于CP坐标显示，CP坐标在加载数据集时于后台计算得出（见下文注释）。在 统计信息 盒中，检查三个参数的数值：N活化的，N 失败 和 N排除.
    注意：N活化的 表示将在后续的Hertz/弹性谱分析中被分析的曲线数量，并以黑色显示在 原始曲线 图。N失败 表示无法找到可靠 CP 值的扩增曲线数量，这些曲线在图中以蓝色显示。这些曲线将在后续分析中被自动剔除。软件打开时，部分曲线可能已被自动归入失败曲线组，这是因为软件在启动时会使用默认的阈值算法（见下文）计算 CP 值。N排除 表示手动选择从分析中排除的曲线，这些曲线将在图中以红色显示（见下文）。
  3. 检查失败、排除和激活的曲线数量是否合理。检查 原始曲线 用于可视化曲线的图表。
  4. 要更详细地查看特定曲线，请单击该曲线。该曲线将变为绿色高亮显示，并在图中突出呈现 电流曲线 图。选定单条曲线后， R 和 k 参数（所有曲线必须相同）将填入 统计数据 图形用户界面的框
  5. 使用以下方法更改给定曲线的状态 切换 框。单击您想要更改状态的特定曲线，然后单击以下任一选项 激活，失败，或 排除. 计数在 统计信息 盒子会自动更新。
    注意：要更改数据集的视图方式，请在 原始曲线 图表使用 查看 盒。单击 全部 显示所有曲线（即分别以对应颜色表示的激活、失败和排除曲线）。单击 失败 显示激活和失败的曲线，然后单击 激活的 仅显示已激活的曲线。要重置所有曲线在已激活与已排除之间的状态，请点击 激活的 或 排除 在 重置 盒子
  6. 数据集进一步清理后，请遵循以下数据处理流程进行分析。
    1. 使用图形用户界面（GUI）中内置的滤波器对曲线中存在的任何噪声进行过滤过滤箱），即一种名为显著性滤波器（Prominency filter）的自定义滤波器，以及Savitzky Golay30,31 （SAVGOL）滤波器，以及基于计算给定窗口内数据中位数的平滑滤波器（中值滤波器）。参见 讨论 （实验方案中的关键步骤）有关滤光片的详细信息。
    2. 检查过滤后的曲线 电流曲线 曲线图中，经过滤的曲线以黑色显示，未经过滤的曲线以绿色显示。
      注意：建议尽可能减少对数据的滤波处理，以保留原始信号的特征。过度滤波可能会平滑掉数据中存在的差异。在进行纳米压痕数据的赫兹分析时，仅启用显著性滤波（prominency filter）已足够。如果数据噪声特别严重，可额外应用 SAVGOL 滤波或中值滤波（median filter）。
    3. 选择一种算法来寻找CP。在 接触点 选择框中，从软件已实现的一系列数值方法中选择一种，即拟合优度（Goodness of Fit, GoF）32，方差比（RoV）32，二阶导数33，或阈值33。参见 讨论，有关算法的详细信息，请参见方案中的关键步骤。
      注意：CP 是探针与材料接触的点，需要识别该点才能进行转换 F-z 数据到 F-δ 数据（针对软材料， δ 是有限的，需要进行计算）。所选算法将应用于数据集中的所有活动曲线，对于算法无法稳健确定CP值的曲线，将被移至失败集。
    4. 调整算法参数以适应您的数据集，确保CP被准确定位，具体方法详见 讨论，方案中的关键步骤。要查看CP值在单条曲线上的位置，可通过单击选择该曲线，然后单击 检查检查弹出的窗口以确定 CP 的位置。
    5. 检查所出现的红线（即算法在选定兴趣区域中计算出的参数）是否具有对应于CP位置的最大值或最小值（例如，对于GoF，该参数为 R2）。如有需要，对所有曲线重复此过程。
      注意：弹出窗口的坐标轴使用绝对坐标，以便显示控制点（CP）的位置。相反， 原始曲线 和 当前曲线 相对于CP（即CP位置为(0,0)）显示。
    6. 点击 赫兹分析这将生成以下所述的三个图表。
      1. 检查个体 F-δ 数据集中的曲线及平均赫兹拟合结果（红色虚线）。调整赫兹模型拟合所采用的压痕深度，单位为 nm 结果 盒下 最大压痕深度（nm）. 将其设定为最大约10% R 赫兹模型成立的有效条件（参见 讨论，方案中的关键步骤。
      2. 检查平均值 F-δ 显示一个标准差（SD）的误差带曲线，以及平均赫兹拟合结果（红色虚线）。在图中可视化平均赫兹拟合 原始曲线 参考图谱及每条曲线的赫兹拟合 电流曲线.
      3. 检查散点图 E 源自将赫兹模型拟合到每条独立曲线。
    7. 单击文件名即可 F-z 曲线， F-δ 曲线或散点图中的某个数据点，以在每个图中突出显示相应的曲线。如果散点图中的某个数据点看似偏离数据分布范围，可点击该点并检查其对应的曲线。通过点击相应曲线，验证CP是否已被正确识别。 检查 按钮。如有必要，将该曲线排除在分析之外。
    8. 检查 结果 计算均值的框 E 及其标准差（SD）Eγ ± σ）并确保其对于给定实验是合理的。
    9. 在 保存 框中，单击 赫兹在弹出窗口中输入文件名和目录。完成后，点击 保存将生成一个 .tsv 文件。使用任意 preferred 的附加软件打开该 .tsv 文件，并利用其中的数值进行统计分析和进一步作图。
      注意：该文件包含 E 从每条曲线获得的值及其平均值 E 及其标准差（SD）。此外，该文件还包含与分析相关的元数据，包括被分析曲线的数量， R, k, 以及用于赫兹模型的最大压痕深度。
    10. 此步骤为可选。点击 平均F-Ind 导出平均力和平均压痕深度，以及力的标准差。
    11. 对于细胞纳米压痕数据，请点击 弹性光谱分析 （参见 代表性结果 和 讨论）。检查生成的两个图，即 E 作为压痕深度的函数（E(δ）作为每条曲线的参数，并计算平均值 E(δ）误差带表示一个标准差（实心红线及阴影区域），通过模型拟合（黑色虚线），可估算细胞肌动蛋白皮层的杨氏模量、细胞整体的杨氏模量以及肌动蛋白皮层的厚度。此外，检查平均值 E(δ）在上方图表中以红色显示。
    12. 确保 插值 选中该选项框，可确保在插值信号上计算弹性光谱分析所需的导数（参见 代表性结果).
    13. 检查 结果 盒，报告皮层的杨氏模量（E0 ± σ)，细胞的整体杨氏模量（Eb ± σ)，以及皮质厚度（d0 ± σ
      注意：平均弹性谱最初可能显得嘈杂，呈现明显的正弦振荡。因此，方程（3）可能无法正确拟合。若出现此情况，可迭代增加平滑 SAVGOL 滤波器的窗口长度34 解决了这一问题。
    14. 分析完成后，单击 ES 在 保存 框中。这将在指定目录下导出一个 .tsv 文件，其中包含平均弹性随平均压痕深度和接触半径的变化数据、与实验相关的元数据（见上文），以及上述估计的模型参数。最后，忽略依赖关系的平均弹性 δ 及其标准差（SD）也一并报告。
    15. 关闭软件，并将保存的结果导入其他任意偏好的软件中，以进一步绘制数据图表并进行统计分析。
    16. 此步骤为可选：在图形界面上右键点击图表，然后选择导出图表 导出将图表导出为 .svg 格式，以便在其他选定软件中编辑字体、字号、线型等参数。 
      注意：可编程并添加自定义的CP算法和滤波器，以扩展已有的算法和滤波器。参见 补充说明 1 详情请见。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

按照方案，可获得一组 F-z 曲线。该数据集很可能包含有效曲线以及需要在继续分析前剔除的无效曲线。通常情况下，若曲线形状与图4A所示形状不同，则应将其剔除。图5AI展示了在预期弹性模量 E 为 0.8 KPa 的软性聚丙烯酰胺（PAAm）水凝胶上获得的大约100条曲线数据集35，已上传至NanoPrepare图形用户界面（GUI）。大多数曲线呈现出清晰且平坦的基线、过渡区域以及一个与材料表观刚度成正比的斜率区域13。然而，少数曲线表现出与图4A所示形状不同的异常情况，例如基线缺失、未检测到接触或基线呈倾斜状。这些曲线可通过NanoPrepare软件轻松从数据集中移除（图5AII，红色曲线），并以标准JSON格式保存干净的数据集（图...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案展示了如何使用市售的光纤顶端纳米压痕仪，在水凝胶和单细胞上稳定地获取力谱纳米压痕数据。此外，还提供了使用基于Python编程的开源软件的操作说明，该软件包含一套精确的纳米压痕数据分析流程。

本方案中的关键步骤
在执行本方案时，以下步骤被确定为尤为重要。

样品制备

在开始测量之前，必须根据测量的限制条件来制备样品。也就是说，样品需要固定在表面上，并尽可能保持平整。这一点在制备那些不像细胞那样能自然附着于表面的样品（例如水凝胶）时尤为重要。首先，样品不能在溶液中漂浮，否则会干扰测量并可能损坏探针。为此，建议对盖玻片进行化学功能化处理，使水凝胶能够在表面聚合并牢固附着，之后可将该表面在浸没状态下粘接到培养皿上。此外，样品表面应尽可能平整，以确保探针能够一致地检测到表面，并在进行矩阵扫描时沿x和y方向移动过程中避免损坏探针。水凝胶溶液可以在疏水性玻璃载片上聚合，这样得到的水凝胶表面平整且不会粘...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GC 和 MAGO 感谢 CeMi 的所有成员。MSS 感谢相关支持 通过 英国工程与物理科学研究委员会项目资助（EP/P001114/1）

GC：软件（软件开发与算法的贡献）、正式分析（纳米压痕数据的分析）、验证、调查（聚丙烯酰胺凝胶的纳米压痕实验）、数据管理、撰写（初稿撰写、审阅与修改）、可视化（图表与图形）。MAGO：调查（凝胶与细胞样品的制备、细胞的纳米压痕实验）、撰写（初稿撰写、审阅与修改）、可视化（图表与图形）。NA：验证、撰写（审阅与修改）。IL：软件（软件开发与算法的贡献）、验证、撰写（审阅与修改）；MV：概念化、软件（原始软件与算法的设计与开发）、验证、资源、撰写（初稿撰写、审阅与修改）、监督、项目管理、经费获取。MSS：资源、撰写（审阅与修改）、监督、项目管理、经费获取。所有作者均阅读并批准了最终稿件。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12 mm 盖玻片VWR631-1577P
35 mm 细胞培养皿Greiner CELLSTAR627160
丙烯酰胺Sigma-AldrichA4058
丙烯硅烷Alfa AesarL16400
过硫酸铵Merk7727-54-0
双丙烯酰胺Merk110-26-9
Chiaro 纳米压痕仪Optics 11 Life 无目录编号
乙醇通用
胎牛血清Gibco16140071
高糖 DMEMGibco11995065
异丙醇通用
Kimwipe 擦镜纸Kimberly Clark21905-026
显微镜载玻片VWR631-1550P
MilliQ 超纯水系统Merk MilliporeZR0Q008WW
OP1550 干涉仪Optics11 Life无目录编号
Optics 11 Life 探针（k = 0.02–0.005 N/m，R = 3–3.5 µm）Optics 11 Life无目录编号
Optics 11 Life 探针（k = 0.46–0.5 N/m，R = 50–55 µm）Optics 11 Life无目录编号
青霉素/链霉素Gibco15140122
RainX 防雨剂RainX26012
标准培养皿（90 mm）Thermo Scientific101RTIRR
四甲基乙二胺Sigma-Aldrich110-18-9
真空干燥器Thermo Scientific531-0250
软件
数据采集软件（v 3.4.1）Optics 11 Life
GitHub Desktop（可选）Microsoft
Python 3Python Software Foundation
Visual Studio Code（可选）Microsoft

参考文献

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