本方案介绍了一种用于软材料纳米压痕实验的完整工作流程，包括水凝胶和细胞。首先，详细阐述了获取力谱数据的实验步骤；随后，通过一款新开发的开源 Python 软件对这类数据进行分析，该软件可从 GitHub 免费下载。
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本文内容
摘要
摘要
纳米压痕指的是一类实验技术，通过使用微米级的力探针来量化软性生物材料和细胞的局部力学特性。该方法在力学生物学、生物材料设计 和组织工程领域中已占据核心地位，能够以接近单个细胞尺寸（μm）的空间分辨率，对软材料进行准确的力学表征。目前获取此类实验数据最常用的方法是使用原子力显微镜（AFM）；尽管该仪器在力（低至pN）和空间（亚纳米级）分辨率方面具有前所未有的优势，但其复杂的操作限制了其在常规测量中的应用，例如难以高效获取杨氏模量（E）等整体力学参数。近年来，基于光纤传感技术的新一代纳米压痕仪因其易于集成、并可在微米级空间分辨率下施加亚纳牛（sub-nN）级力而日益受到关注，因此适用于水凝胶和细胞等样品的局部力学性能探测。
本方案详细介绍了使用商用的光纤顶端传感纳米压痕仪获取水凝胶和细胞纳米压痕数据的实验操作步骤。尽管部分步骤针对本文所用仪器而设定，但只要根据制造商指南对某些步骤进行适当调整，该方案也可作为其他纳米压痕设备的操作参考。此外，本文还介绍了一款新的开源 Python 软件，该软件配备用户友好的图形界面，可用于纳米压痕数据的分析，功能包括对采集异常的力-位移曲线进行筛选、数据滤波、通过多种数值方法计算接触点、常规弹性模量 E 的计算，以及适用于单细胞纳米压痕数据的更高级分析方法。
引言
如今，力学在生物学中的基础作用已得到公认1,2。从整个组织到单个细胞，机械特性能够反映被研究生物材料的病理生理状态3,4。例如，受癌症影响的乳腺组织比健康组织更坚硬，这一概念正是常用触诊检测方法的基础5。值得注意的是，最近研究表明，由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）伴随着血细胞机械特性的改变，与未感染SARS-CoV-2的个体相比，表现为红细胞变形能力下降，以及淋巴细胞和中性粒细胞刚度降低6。
通常情况下，细胞与组织的力学特性本质上是相互关联的：每种组织都具有特定的力学性质，这些性质同时影响并依赖于其组成细胞及细胞外基质（ECM）的力学特性5。正因如此，研究生物学中力学特性的策略通常涉及构建具有生理相关力学刺激的工程化基底，以阐明细胞对这些刺激的响应行为。例如，Engler 及其同事的开创性研究证明，间充质干细胞的谱系分化由基质弹性所调控，该结论是在软性和刚性二维聚丙烯酰胺（PAAm）水凝胶上研究得出的7....
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方案
1. 纳米压痕测量用基底/细胞的制备
- 按照补充方案中的步骤制备用于纳米压痕实验的PAAm水凝胶/细胞。该流程在图2中进行了总结。
注：选择PAAm水凝胶是因为它们是力学生物学领域中最常用的水凝胶。然而，本方案同样适用于任何类型的水凝胶25（参见讨论部分中关于方法的修改）。
2. 启动设备、探头选择与探头校准
- 按照补充方案中的步骤启动设备。有关光纤插芯式纳米压痕仪操作的技术细节，请参阅以下参考文献17,18。
- 按以下说明选择纳米压痕探针。
注意：所有市售探针（包括本方案中使用的探针）均配备球形针尖（图3A）。因此，选择主要取决于两个变量：悬臂梁刚度和针尖半径（图3B）。- 为获得最佳结果，应根据样品预期的刚度选择匹配的悬臂梁刚度（k....
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结果
按照方案，可获得一组 F-z 曲线。该数据集很可能包含有效曲线以及需要在继续分析前剔除的无效曲线。通常情况下，若曲线形状与图4A所示形状不同，则应将其剔除。图5AI展示了在预期弹性模量 E 为 0.8 KPa 的软性聚丙烯酰胺（PAAm）水凝胶上获得的大约100条曲线数据集35，已上传至NanoPrepare图形用户界面（GUI）。大多数曲线呈现出清晰且平坦的基线、过渡区域以及一个与材料表观刚度成正比的斜率区域13。然而，少数曲线表现出与图4A所示形状不同的异常情况，例如基线缺失、未检测到接触或基线呈倾斜状。这些曲线可通过NanoPrepare软件轻松从数据集中移除（图5AII，红色曲线），并以标准JSON格式保存干净的数据集（图.......
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讨论
本方案展示了如何使用市售的光纤顶端纳米压痕仪，在水凝胶和单细胞上稳定地获取力谱纳米压痕数据。此外，还提供了使用基于Python编程的开源软件的操作说明，该软件包含一套精确的纳米压痕数据分析流程。
本方案中的关键步骤
在执行本方案时，以下步骤被确定为尤为重要。
样品制备
在开始测量之前，必须根据测量的限制条件来制备样品。也就是说，样品需要固定在表面上，并尽可能保持平整。这一点在制备那些不像细胞那样能自然附着于表面的样品（例如水凝胶）时尤为重要。首先，样品不能在溶液中漂浮，否则会干扰测量并可能损坏探针。为此，建议对盖玻片进行化学功能化处理，使水凝胶能够在表面聚合并牢固附着，之后可将该表面在浸没状态下粘接到培养皿上。此外，样品表面应尽可能平整，以确保探针能够一致地检测到表面，并在进行矩阵扫描时沿x和y方向移动过程中避免损坏探针。水凝胶溶液可以在疏水性玻璃载片上聚合，这样得到的水凝胶表面平整且不会粘.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
GC 和 MAGO 感谢 CeMi 的所有成员。MSS 感谢相关支持 通过 英国工程与物理科学研究委员会项目资助（EP/P001114/1）
GC：软件（软件开发与算法的贡献）、正式分析（纳米压痕数据的分析）、验证、调查（聚丙烯酰胺凝胶的纳米压痕实验）、数据管理、撰写（初稿撰写、审阅与修改）、可视化（图表与图形）。MAGO：调查（凝胶与细胞样品的制备、细胞的纳米压痕实验）、撰写（初稿撰写、审阅与修改）、可视化（图表与图形）。NA：验证、撰写（审阅与修改）。IL：软件（软件开发与算法的贡献）、验证、撰写（审阅与修改）；MV：概念化、软件（原始软件与算法的设计与开发）、验证、资源、撰写（初稿撰写、审阅与修改）、监督、项目管理、经费获取。MSS：资源、撰写（审阅与修改）、监督、项目管理、经费获取。所有作者均阅读并批准了最终稿件。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12 mm 盖玻片 | VWR | 631-1577P | |
| 35 mm 细胞培养皿 | Greiner CELLSTAR | 627160 | |
| 丙烯酰胺 | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| 丙烯硅烷 | Alfa Aesar | L16400 | |
| 过硫酸铵 | Merk | 7727-54-0 | |
| 双丙烯酰胺 | Merk | 110-26-9 | |
| Chiaro 纳米压痕仪 | Optics 11 Life | 无目录编号 | |
| 乙醇 | 通用 | ||
| 胎牛血清 | Gibco | 16140071 | |
| 高糖 DMEM | Gibco | 11995065 | |
| 异丙醇 | 通用 | ||
| Kimwipe 擦镜纸 | Kimberly Clark | 21905-026 | |
| 显微镜载玻片 | VWR | 631-1550P | |
| MilliQ 超纯水系统 | Merk Millipore | ZR0Q008WW | |
| OP1550 干涉仪 | Optics11 Life | 无目录编号 | |
| Optics 11 Life 探针（k = 0.02–0.005 N/m，R = 3–3.5 µm） | Optics 11 Life | 无目录编号 | |
| Optics 11 Life 探针（k = 0.46–0.5 N/m，R = 50–55 µm） | Optics 11 Life | 无目录编号 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| RainX 防雨剂 | RainX | 26012 | |
| 标准培养皿（90 mm） | Thermo Scientific | 101RTIRR | |
| 四甲基乙二胺 | Sigma-Aldrich | 110-18-9 | |
| 真空干燥器 | Thermo Scientific | 531-0250 | |
| 软件 | |||
| 数据采集软件（v 3.4.1） | Optics 11 Life | ||
| GitHub Desktop（可选） | Microsoft | ||
| Python 3 | Python Software Foundation | ||
| Visual Studio Code（可选） | Microsoft |
参考文献
- Discher, D. E., Janmey, P. Y. W. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
- Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
- Gu....
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重印与许可
