方法文章

在保留全长蛋白表达的同时移除 mRNA 中的内部翻译起始位点

DOI：

10.3791/63405

⸱

2022年3月16日

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1Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center

本文内容

摘要

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本方案描述了Gja1基因中一个M213L突变，该突变可维持全长连接蛋白43的正常生成，但阻止较小的GJA1-20k内部翻译异构体的翻译。

摘要

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CRISPR-Cas9 基因编辑系统基于基因组修复机制，相较于传统的同源重组技术，能够更快、更简便地构建基因修饰小鼠模型。当目标为引入单点突变时，CRISPR-Cas9 系统尤为适用。间隙连接蛋白 Connexin 43（Cx43）由基因 Gja1 编码，该基因仅含一个编码外显子，无法发生剪接。然而，Gja1 不仅可产生全长 Cx43 蛋白，还可通过一种称为内部翻译的机制，在内部 AUG（甲硫氨酸）起始密码子处启动核糖体翻译，生成多达六种 N 末端截短的亚型。GJA1-20k 是最常见的一种截短亚型，由 Gja1 mRNA 第 213 位的 AUG 密码子起始翻译产生。由于第 213 位残基位于 Cx43 最后一个跨膜结构域的末端，GJA1-20k 实质上是作为独立蛋白存在的 Cx43 的 20 kDa C 末端尾部。前期研究已在细胞中发现，GJA1-20k 的关键作用是促进全长 Cx43 间隙连接半通道向细胞膜的转运。为研究这一现象 体内一种携带Gja1点突变的转基因小鼠被构建出来，该突变将第213位残基的ATG（甲硫氨酸）替换为TTA（亮氨酸，M213L突变）。M213L突变的结果是Gja1 mRNA和全长Cx43仍可正常生成，但Gja1-20k的翻译显著减少。本报告重点介绍如何选择限制性酶切位点以构建单氨基酸突变（Gja1M213L/M213L) 小鼠模型。本方案描述了利用 CRISPR-Cas9 系统构建基因修饰小鼠，并通过结合 PCR 与限制性内切酶处理进行快速基因分型的方法。

引言

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全长连接蛋白43（Connexin 43, Cx43）及其N端截短异构体GJA1-20k由同一GJA1 mRNA编码，但利用不同的起始密码子1启动翻译。Cx43的翻译起始于第一个AUG起始密码子，而GJA1-20k的翻译则起始于第213位残基处的AUG密码子。先前研究发现，GJA1-20k在全长Cx43的转运、肌动蛋白稳定以及线粒体形态调控中具有重要作用in vitro1,2,3。

为了理解GJA1-20k的作用 体内，一种GJA1-20k "敲除" 小鼠模型保留了生成全长Cx43的能力。该方法采用CRISPR-Cas9系统，将第213位的甲硫氨酸（M）替换为亮氨酸（L）（Gja1M213L/M213L)4内部的 M 至 L 突变显著降低了内部翻译发生的风险，同时保留了全长蛋白的翻译与功能4由于野生型（WT）和突变等位基因的大小相同且mRNA产物极为相似，因此在小鼠中确认基因型存在较大困难。DNA测序能够鉴定突变，但成本较高且耗时，不适合常规使用。目前已有多种快速基因分型方法，....

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方案

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所有动物护理和研究方案均经西达斯-西奈医学中心和犹他大学的机构动物护理与使用委员会批准。实验使用从商业来源获得的8至9周龄C57BL/6J雌性小鼠（见材料表）。

1. 基因靶向的准备工作

  1. 使用 CRISPOR 网络算法4,9,10（参见材料表），在编码 M213 的靶向突变位点附近选择引导靶序列。
    注意：选择了一个长度为 20 个碱基的引导序列（ATTCAGAGCGAGAGACACCA），位于 GJA1 编码序列的反向链上，其 MIT 评分11 为 62，潜在切割位点位于待突变密码子（ATG）下游 16 个碱基处（图 1；完整的 crRNA 序列见表 1）。
  2. 合成与 Cas9 相互作用作为引导 RNA 的 crRNA 和 tracrRNA12。
    注意：尽管该引导 RNA 的 MIT 评分为 62，但仅存在一个潜在的脱靶突变位点，且该位....

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结果

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CRISPR/Cas9 基因编辑系统在小鼠 10 号染色体的 56,264,279 至 56,264,281 位点和 56,264,291 至 56,264,293 位点分别引入 ATG 到 TTA 的突变以及一个同义的 TCC 到 TCG 突变，或相当于 Gja1 mRNA 的 869 至 871 位点和 881 至 883 位点。这些突变导致 GJA1 蛋白发生甲硫氨酸 213 到亮氨酸（M213L）的改变，而 TTC 到 TTG 的突变则破坏了邻近的 PAM 序列，以避免发生非预期的基因编辑（图 1）。该突变的详细信息已在先前的报道中描述4。

为了分析正确的基因型，PCR产物在进行琼脂糖凝胶电泳前需用限制性内切酶“NlaIII”进行消化（图2，步骤4）。如图2A所示，野生型（WT）等位基因的PCR产物会被切割成两个不同大小的碱基对片段（227 bp和4.......

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讨论

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基因修饰小鼠模型是研究基因功能的常用方法。然而，由于GJA1-20k这一由内部翻译产生的同源蛋白与全长Cx43蛋白来源于相同的Gja1 mRNA，因此需要设计一种创新策略，在保留全长Cx43表达的同时抑制GJA1-20k的表达。该策略基于对GJA1-20k内部起始密码子的突变。通过单点突变，将Gja1 mRNA上的M213位点突变为L，成功抑制了GJA1-20k的表达，同时保留了全长Cx43的表达4。

然而，单个内部翻译起始位点的点突变带来了另一个难题：小鼠基因型的鉴定。单个氨基酸残基的替换过于微小，难以设计特异性引物。此外，野生型（WT）和突变等位基因具有完全相同的碱基对。为了克服这些问题，在基因分型流程中增加了一个步骤。由于GJA1-20k的起始密码子（目标突变位点）可被限制性内切酶NlaIII识别，因此将该位点突变为不能被NlaIII识别的序列（图1；CATG突变为CTTA）。此外，设计用于扩增PCR产物的引物时，确保其产物中不含任何.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本项目由美国国立卫生研究院基金（R01HL152691、R01HL138577 和 R01HL159983）资助，授予 RMS。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 mL 8联排PCR管托马斯科学公司1148A28
0.5 M EDTA pH 8.0Invitrogen15575-038用于原核显微注射的缓冲液
10x CutSmart 缓冲液新英格兰生物实验室B7204SNlaIII 消化缓冲液
1 M Tris-HCl pH 7.5Invitrogen15567-027用于原核显微注射的缓冲液
50x TAE 缓冲液Invitrogen24710-030
96孔热循环仪应用生物系统公司型号 # 9902
琼脂糖Sigma-AldrichA9539
C57BL/6J杰克逊实验室664小鼠品系
Chemidoc MP 成像系统Bio-rad使用302 nm紫外光拍摄凝胶图像
eSpCas9蛋白MilliporeSigmaESPCAS9PRO-50UG
紫色上样缓冲液（6×）New England BiolabsB7024S电泳上样缓冲液
手套
hCG（人绒毛膜促性腺激素）MilliporeSigma23-073-425G
透明质酸酶MilliporeSigmaH3884-100MG
Image Lab 软件伯乐（Bio-rad）分析凝胶图像
带微分干涉（plasDIC）的倒置体视显微镜ZeissAxiovert A1
KAPA 小鼠基因分型试剂盒罗氏诊断KK7352用于组织或细胞裂解、DNA提取和PCR预混液
KSOM利富高ZEKS-050胚胎培养液
实验室共艺
M2 培养基MilliporeSigmaMR015D
NlaIIINew England BiolabsR0125S消化PCR产物
无核酸酶水AmbionAM9937稀释试剂
石蜡油Nacalai USA2613785
堵塞 20 μL型细口移液管尖端FisherScientific02-707-171拾取囊胚
PMSG（孕马血清促性腺激素）’血清促性腺激素ProSpec-TanyHOR-272
氯化钠InvitrogenAM9760G用于原核显微注射的缓冲液
SYBR safe DNA凝胶染料InvitrogenS33102检测凝胶中的条带
tracrRNADharmaconU-002000-120向导RNA

参考文献

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  1. Smyth, J. W., Shaw, R. M. Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms. Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).
  2. Basheer, W. A., et al. GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercal....

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标签

CRISPR Cas9 43 Gja1 PCR

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