在保留全长蛋白表达的同时移除 mRNA 中的内部翻译起始位点

摘要

本方案描述了Gja1基因中一个M213L突变，该突变可维持全长连接蛋白43的正常生成，但阻止较小的GJA1-20k内部翻译异构体的翻译。

摘要

CRISPR-Cas9 基因编辑系统基于基因组修复机制，相较于传统的同源重组技术，能够更快、更简便地构建基因修饰小鼠模型。当目标为引入单点突变时，CRISPR-Cas9 系统尤为适用。间隙连接蛋白 Connexin 43（Cx43）由基因 Gja1 编码，该基因仅含一个编码外显子，无法发生剪接。然而，Gja1 不仅可产生全长 Cx43 蛋白，还可通过一种称为内部翻译的机制，在内部 AUG（甲硫氨酸）起始密码子处启动核糖体翻译，生成多达六种 N 末端截短的亚型。GJA1-20k 是最常见的一种截短亚型，由 Gja1 mRNA 第 213 位的 AUG 密码子起始翻译产生。由于第 213 位残基位于 Cx43 最后一个跨膜结构域的末端，GJA1-20k 实质上是作为独立蛋白存在的 Cx43 的 20 kDa C 末端尾部。前期研究已在细胞中发现，GJA1-20k 的关键作用是促进全长 Cx43 间隙连接半通道向细胞膜的转运。为研究这一现象 体内一种携带Gja1点突变的转基因小鼠被构建出来，该突变将第213位残基的ATG（甲硫氨酸）替换为TTA（亮氨酸，M213L突变）。M213L突变的结果是Gja1 mRNA和全长Cx43仍可正常生成，但Gja1-20k的翻译显著减少。本报告重点介绍如何选择限制性酶切位点以构建单氨基酸突变（Gja1^M213L/M213L) 小鼠模型。本方案描述了利用 CRISPR-Cas9 系统构建基因修饰小鼠，并通过结合 PCR 与限制性内切酶处理进行快速基因分型的方法。

引言

全长连接蛋白43（Connexin 43, Cx43）及其N端截短异构体GJA1-20k由同一GJA1 mRNA编码，但利用不同的起始密码子¹启动翻译。Cx43的翻译起始于第一个AUG起始密码子，而GJA1-20k的翻译则起始于第213位残基处的AUG密码子。先前研究发现，GJA1-20k在全长Cx43的转运、肌动蛋白稳定以及线粒体形态调控中具有重要作用in vitro^1,2,3。

为了理解GJA1-20k的作用 体内，一种GJA1-20k "敲除" 小鼠模型保留了生成全长Cx43的能力。该方法采用CRISPR-Cas9系统，将第213位的甲硫氨酸（M）替换为亮氨酸（L）（Gja1^M213L/M213L)⁴内部的 M 至 L 突变显著降低了内部翻译发生的风险，同时保留了全长蛋白的翻译与功能⁴由于野生型（WT）和突变等位基因的大小相同且mRNA产物极为相似，因此在小鼠中确认基因型存在较大困难。DNA测序能够鉴定突变，但成本较高且耗时，不适合常规使用。目前已有多种快速基因分型方法，如实时聚合酶链式反应（RT-PCR）、微测序-连接法、高分辨率熔解曲线分析以及四引物扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）。^5,6,7,8然而，这些替代方法需要多个步骤、特殊的资源和/或多组特异性引物，可能引发非特异性的PCR产物。

本方案介绍了一种利用CRISPR-Cas9进行基因靶向与编辑的详细方法，用于构建单个氨基酸突变，并提供了快速基因分型方法以确认该突变。基因型鉴定采用了一种创新性的限制性内切酶策略，仅需一对引物即可识别目标基因。读者可参考文献⁴，了解单个残基Gja1^M213L/M213L替换突变所导致的严重电生理效应——该突变仍可产生全长蛋白，但无法生成较小的内部翻译截短异构体。本方案将有助于构建其他小鼠模型，通过点突变来降低特定异构体的内部翻译，同时保留内源性全长蛋白的表达。

方案

所有动物护理和研究方案均经西达斯-西奈医学中心和犹他大学的机构动物护理与使用委员会批准。实验使用从商业来源获得的8至9周龄C57BL/6J雌性小鼠（见材料表）。

1. 基因靶向的准备工作

1. 使用 CRISPOR 网络算法^4,9,10（参见材料表），在编码 M213 的靶向突变位点附近选择引导靶序列。
   注意：选择了一个长度为 20 个碱基的引导序列（ATTCAGAGCGAGAGACACCA），位于 GJA1 编码序列的反向链上，其 MIT 评分¹¹ 为 62，潜在切割位点位于待突变密码子（ATG）下游 16 个碱基处（图 1；完整的 crRNA 序列见表 1）。
2. 合成与 Cas9 相互作用作为引导 RNA 的 crRNA 和 tracrRNA¹²。
   注意：尽管该引导 RNA 的 MIT 评分为 62，但仅存在一个潜在的脱靶突变位点，且该位点有四个错配，距离 PAM 区域超过 12 个碱基。因此，该引导 RNA 被认为是安全的。
3. 设计一条与引导序列互补的供体寡核苷酸，用于引入单个氨基酸替换（ATG 变为 TTA；M213L），其 5' 和 3' 侧分别具有 60 和 48 个碱基的同源臂。
   注意：该供体寡核苷酸包含一个用于破坏 PAM 序列的点突变（AGG 变为 ACG），通过引入一个同义突变（TCC 变为 TCG；S217S）来避免在 CRISPR 同源定向修复（HDR）¹³ 引入目标突变后发生再次编辑（图 1 和 表 1）。
4. 使用 NaCl（终浓度为 200 mM）沉淀 10 µg 寡核苷酸，以最大限度减少盐分带入原核显微注射缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5；0.1 mM EDTA 和 100 mM NaCl，不含亚精胺和精胺¹⁴）中。
   注意：不要用 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀，因为沉淀可直接溶解于溶液中。
5. 将 50 ng/µL 的供体寡核苷酸、60 ng/µL 的 crRNA/tracrRNA 混合物（1:1 摩尔比）（来自步骤 1.2）和 50 ng/µL 的 eSpCas9 蛋白（参见材料表）混合，配制成终体积为 20 µL 的 CRISPR 混合物（表 2）。若观察到较高毒性，可降低供体寡核苷酸的浓度（例如降至 25 ng/µL）。

2. 超数排卵诱导、卵母细胞采集、CRISPR 混合物原核显微注射及囊胚筛选

注意：本实验步骤遵循先前已发表的通用方案¹⁴。

1. 在第1天下午约15:00，通过腹腔注射方式，将5 IU的PMSG（孕马血清促性腺激素）（参见材料表）溶于100 µL无菌水中，注射至5-10只8周龄的小鼠。
2. 在注射PMSG后46-48小时（第3天），通过腹腔注射方式，将5 IU的hCG（人绒毛膜促性腺激素）（参见材料表）溶于100 µL无菌水中，注射至卵子供体小鼠。随后以1:1比例与种公鼠进行交配设置。
3. 使用透明质酸酶在M2培养基中收集受精卵，并于上午约10:00在100 µL M2培养基中洗涤三次，随后置于mWM¹⁵或KSOM¹⁶培养基中培养（第4天）（参见材料表）。
4. 在倒置显微镜下，使用带对比度增强光学系统的培养皿中，将石蜡油覆盖的100 µL M2培养基中的CRISPR混合物（步骤1.3）通过原核显微注射¹⁴导入从小鼠中收获的1细胞期胚胎中（下午早至晚些时候）（视频1）。
   注：CRISPR混合物的原核显微注射在受精后14-16小时（p.c.）的1细胞期胚胎上进行。注射后的胚胎在5% CO₂培养箱中培养数小时，并于受精后18-20小时手术移植至同日上午发现阴栓的受体ICR小鼠体内。
5. 将20-30个2细胞期胚胎移植至每只受体小鼠，以产生重组个体。
   注：可按照通用方案¹⁴进行操作，或将胚胎在mWM或KSOM培养基中培养4天，以评估效率并检测毒性。当至少三分之一的注射胚胎发育至早期至完全扩张的囊胚阶段，且其中包含多个重组个体时，CRISPR混合物的毒性可接受。同时，在平行培养中，超过90%的未处理胚胎应达到相同的囊胚阶段。如需定量评估HDR成功率，可按步骤2.6-2.9进行囊胚筛选（非必需步骤）。
6. 使用带滤芯的精细移液吸头和移液器，将2 µL培养液连同早期至完全扩张的囊胚逐个转移至单独的PCR管中（第8天；视频2）。
7. 在8 µL裂解消化液（同步骤3.2；参见材料表）中裂解囊胚，75 °C处理10分钟，95 °C处理5分钟，随后冷却至4 °C保存。取2 µL裂解液作为模板，加入总反应体积为15 µL的PCR体系中进行PCR扩增（步骤3）。
8. 通过NlaIII酶切后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳¹⁷，检测HDR效率。
9. 对首建鼠及其后代中668 bp的扩增子进行测序¹⁷，以确认靶向重组的状态并验证突变的完整性。

3. DNA 提取

注意：由于GJA1-20k基因敲除小鼠在出生后2至4周左右会出现突发性死亡，本实验采用出生后第10天的小鼠进行。⁴. 也可参照先前发表的报告采用更为通用的实验方案¹⁸.

1. 使用干净的剪刀剪取脚趾或尾尖1-3 mm，并转移至0.2 mL 8联PCR管中。为避免脚趾或尾部样本之间的污染，请使用预先清洁的剪刀，或每只小鼠使用单独刀片，或每次取样前用70%乙醇或10%次氯酸钠溶液清洁。若取样后尾部出血，可用纱布轻压片刻以止血。尾部样本可在-20 °C保存至多 约一周，直至进行DNA提取。
2. 每管加入100 µL组织裂解液（见材料表），充分混匀，随后使用台式小型离心机离心（室温下2,200 x g，10 s）。确保尾部组织完全浸没于溶液中。
3. 将PCR管置于PCR仪中，按以下程序运行：75 °C孵育10 min（组织裂解），95 °C孵育5 min（酶失活），4 °C保存（暂存）。若无法立即进行PCR反应，组织裂解液可在4 °C保存至多一周。

4. 通过PCR进行DNA扩增

1. 为每个新 PCR 管配制 PCR 溶液，每管包含 5 µL 无核酸酶水（H₂O）、0.75 µL 的 10 µM 正向引物和反向引物，以及 7.5 µL PCR 预混液（参见材料表）。引物序列见表 1。若样本较多，可按比例放大配制，每管分装 14 µL。
2. 向第 3.1 步配制好的 PCR 溶液中加入 1 µL 组织裂解液。注意不要触碰到尾部。
3. 充分混匀后，使用台式小型离心机在室温下以 2,200 × g 离心 10 秒。
4. 将 PCR 管放入已设定好如下程序的热循环仪中。PCR 产物可保存于 4 °C 1–2 个月，或在 -20 °C 保存约 1 年。
   ​注意：95 °C 3 分钟（第 1 步，初始变性），95 °C 15 秒（第 2 步，变性），60 °C 15 秒（第 2 步，退火），72 °C 45 秒（第 2 步，延伸），重复第 2 步共 35 个循环，72 °C 10 分钟（第 3 步，最终延伸），4 °C（第 4 步，保存）。

5. 用限制性内切酶孵育

1. 准备酶溶液，其中包含 7 µL 无核酸酶水（H₂O）、2 µL 10x CutSmart 缓冲液和 1 µL NlaIII 限制性内切酶（见材料表）。如有多个样品，按比例扩大各组分体积配制混合液，并分装为每管 10 µL。
2. 向每管酶溶液中加入 10 µL 第 3 步获得的 PCR 产物。
3. 充分混匀后，使用台式小型离心机离心（室温下 2,200 × g 离心 10 秒）。
4. 将各管置于热循环仪或恒温金属浴中，按照下述程序进行反应。反应完成后，产物可于 4 °C 保存 1–2 个月，或于 -20 °C 保存约 1 年。
   ​注意：37 °C 孵育 16 小时（至少 2 小时；孵育时间过短可能导致切割不完全），随后在 4 °C 保存。

6. DNA 条带检测

1. 制备含有DNA凝胶染料的1.5%琼脂糖凝胶用于电泳。
   1. 将0.75 g琼脂糖加入50 mL的1×TAE缓冲液中，混匀后放入微波炉加热至琼脂糖完全溶解。冷却后，加入5 µL DNA染料并轻轻混匀。
   2. 倒入凝胶模具中（每模具25 mL），静置使其凝固。如需获得更好的分辨率和分离效果，可根据需要将琼脂糖浓度提高至2.5%–4%。
2. 将10 µL酶切后的PCR产物上样至加样孔中。如有需要，可加入6×上样缓冲液并混匀。
3. 以100 V电压电泳35分钟。
   注意：这些参数可能需要优化。
4. 在紫外光（302 nm波长）下成像。

结果

CRISPR/Cas9 基因编辑系统在小鼠 10 号染色体的 56,264,279 至 56,264,281 位点和 56,264,291 至 56,264,293 位点分别引入 ATG 到 TTA 的突变以及一个同义的 TCC 到 TCG 突变，或相当于 Gja1 mRNA 的 869 至 871 位点和 881 至 883 位点。这些突变导致 GJA1 蛋白发生甲硫氨酸 213 到亮氨酸（M213L）的改变，而 TTC 到 TTG 的突变则破坏了邻近的 PAM 序列，以避免发生非预期的基因编辑（图 1）。该突变的详细信息已在先前的报道中描述⁴。

为了分析正确的基因型，PCR产物在进行琼脂糖凝胶电泳前需用限制性内切酶“NlaIII”进行消化（图2，步骤4）。如图2A所示，野生型（WT）等位基因的PCR产物会被切割成两个不同大小的碱基对片段（227 bp和4...

讨论

基因修饰小鼠模型是研究基因功能的常用方法。然而，由于GJA1-20k这一由内部翻译产生的同源蛋白与全长Cx43蛋白来源于相同的Gja1 mRNA，因此需要设计一种创新策略，在保留全长Cx43表达的同时抑制GJA1-20k的表达。该策略基于对GJA1-20k内部起始密码子的突变。通过单点突变，将Gja1 mRNA上的M213位点突变为L，成功抑制了GJA1-20k的表达，同时保留了全长Cx43的表达⁴。

然而，单个内部翻译起始位点的点突变带来了另一个难题：小鼠基因型的鉴定。单个氨基酸残基的替换过于微小，难以设计特异性引物。此外，野生型（WT）和突变等位基因具有完全相同的碱基对。为了克服这些问题，在基因分型流程中增加了一个步骤。由于GJA1-20k的起始密码子（目标突变位点）可被限制性内切酶NlaIII识别，因此将该位点突变为不能被NlaIII识别的序列（图1；CATG突变为CTTA）。此外，设计用于扩增PCR产物的引物时，确保其产物中不含任何...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL 8联排PCR管	托马斯科学公司	1148A28
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15575-038	用于原核显微注射的缓冲液
10x CutSmart 缓冲液	新英格兰生物实验室	B7204S	NlaIII 消化缓冲液
1 M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027	用于原核显微注射的缓冲液
50x TAE 缓冲液	Invitrogen	24710-030
96孔热循环仪	应用生物系统公司	型号 # 9902
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9539
C57BL/6J	杰克逊实验室	664	小鼠品系
Chemidoc MP 成像系统	Bio-rad		使用302 nm紫外光拍摄凝胶图像
eSpCas9蛋白	MilliporeSigma	ESPCAS9PRO-50UG
紫色上样缓冲液（6×）	New England Biolabs	B7024S	电泳上样缓冲液
手套
hCG（人绒毛膜促性腺激素）	MilliporeSigma	23-073-425G
透明质酸酶	MilliporeSigma	H3884-100MG
Image Lab 软件	伯乐（Bio-rad）		分析凝胶图像
带微分干涉（plasDIC）的倒置体视显微镜	Zeiss	Axiovert A1
KAPA 小鼠基因分型试剂盒	罗氏诊断	KK7352	用于组织或细胞裂解、DNA提取和PCR预混液
KSOM	利富高	ZEKS-050	胚胎培养液
实验室共艺
M2 培养基	MilliporeSigma	MR015D
NlaIII	New England Biolabs	R0125S	消化PCR产物
无核酸酶水	Ambion	AM9937	稀释试剂
石蜡油	Nacalai USA	2613785
堵塞 20 μL型细口移液管尖端	FisherScientific	02-707-171	拾取囊胚
PMSG（孕马血清促性腺激素）’血清促性腺激素	ProSpec-Tany	HOR-272
氯化钠	Invitrogen	AM9760G	用于原核显微注射的缓冲液
SYBR safe DNA凝胶染料	Invitrogen	S33102	检测凝胶中的条带
tracrRNA	Dharmacon	U-002000-120	向导RNA