方法文章

使用比色法细胞检测技术检测抗AAV中和抗体的逐步操作方法

DOI：

10.3791/63419

⸱

2021年12月7日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology, La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR), The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School, Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health, The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital, Monash University

本文内容

摘要

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本文描述了一种全面的实验室方案和分析流程，用于快速、经济且简便的比色法细胞检测，以检测针对AAV6的中和成分。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

重组腺相关病毒（rAAV）已被证明是在实验室和临床环境中安全有效地递送遗传物质以治疗多种健康状况的载体。然而，针对AAV衣壳的预存中和抗体（NAbs）对在大型动物实验模型和人类群体中成功实施基因治疗构成了持续挑战。为确保以AAV为基础的基因疗法作为研究工具和具有临床可行性的治疗手段的有效性，有必要对宿主针对AAV的免疫反应进行初步筛查。本方案描述了一种比色法 体外 检测针对腺相关病毒6型（AAV6）的中和因子的检测方法。该检测利用编码碱性磷酸酶（AP）报告基因的AAV与其底物NBT/BCIP之间的反应，两者结合后可产生不溶性、可定量的紫色沉淀。

在本实验方案中，将血清样本与表达碱性磷酸酶（AP）的腺相关病毒（AAV）混合，并进行孵育，以允许潜在的中和活性发生。随后将病毒-血清混合物加入细胞中，使未被中和的AAV进行病毒感染和转导。加入NBT/BCIP底物后发生显色反应，其显色程度对应于病毒转导及中和活性。通过一款免费软件工具对显色面积比例进行定量分析，从而计算出中和滴度。该检测方法的显色程度与病毒浓度之间表现出强烈的正相关性。对绵羊在给予重组AAV6前后采集的血清样本进行检测，结果显示中和活性显著升高（从125倍增至>10,000倍）。该方法具有足够的灵敏度，可检测到稀释至>1:32,000血清样本中的中和活性。本检测提供了一种简单、快速且经济有效的方法，用于检测针对AAV的中和抗体（NAbs）。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腺相关病毒（AAV）正越来越多地被用作基因治疗载体，以开展针对影响心血管、肺部、循环、眼部及中枢神经系统等多种健康状况的治疗试验1,2,3,4,5。AAV载体作为领先的基因治疗平台，其受欢迎程度源于其良好的安全性、长期的外源基因表达能力以及广泛的组织特异性趋向性1,6。动物研究中的成功结果已推动五十多项AAV基因治疗的临床试验成功达到疗效终点7，并促成了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首个商业化AAV基因治疗药物的上市8。在取得初步成功后，AAV作为首选载体在基础研究和临床研究领域持续获得广泛应用，目前也是美国和欧洲唯一获批用于临床的体内基因治疗手段9。然而，针对AAV载体衣壳预先存在的中和抗体（NAbs）仍然是限制临床前研究和临床试验疗效的主要障碍。NAbs在未经暴露的人群和动物群体中普遍存在，可在AAV载体体内给药后抑制基因转导过程1。大多数基因治疗试验将AAV血清学阳性列为排除标准，因此在实验室和临床中，对宿主免疫状态进行初步筛查至关重要。建立一种能够检测抗AAV中和抗体的检测方法，是任何基于AAV基因治疗研究项目流程中的关键步骤。本报告聚焦于AAV6，因其在横纹肌（心脏和骨骼肌）中具有高效且特异的转导能力，引起了研究人员的关注1,10,11,12。基因治疗被认为是一种极具前景的心脏靶向治疗策略，因为在不进行侵入性开胸手术的情况下，很难实现对心脏的特异性靶向。

中和活性通常通过基于细胞的检测方法来确定 体外 或 体内 转导抑制实验 体内 中和抗体检测通常包括将受试者（如人或大型动物）的血清注射到小鼠体内，随后给予携带报告基因的腺相关病毒（AAV），再检测报告基因或相应抗原的表达情况。 体外 通过将人或大型动物的血清或血浆进行连续稀释后，与表达报告基因的重组腺相关病毒（rAAV）共同孵育，以测定中和抗体滴度。将细胞感染血清与病毒的混合物，并与对照组比较，评估报告基因表达受抑制的程度。 体外 由于成本相对较低、检测速度快，以及更易于标准化和验证，此类检测方法被广泛用于中和抗体的筛选13,14 与……相比 体内 检测方法 体内 检测方法通常被认为具有更高的灵敏度15,16，但同样的说法也已被提出关于 体外 检测方法14,17.

迄今为止， 体外 中和抗体检测（NAb）主要采用发光法（荧光素酶）作为报告基因来检测中和作用。尽管基于光信号的方法在多种情况下具有优势，但在某些情况下，比色/显色法中和抗体检测可能更具优势。比色法已成功用于评估其他病毒（如流感病毒和腺病毒）的中和作用。18,19其吸引力源于操作简便、成本较低，且仅需常规实验室设备和工具即可完成20基于发光报告基因的中和抗体检测需要昂贵的底物试剂盒、化学发光仪以及相应的分析软件21该比色法检测的优势在于仅需使用光学显微镜和一种成本极低的底物。关于比色法与发光法检测灵敏度的报道结果存在矛盾。一项研究表明，基于发光的ELISA检测具有更高的灵敏度，且重复性与比色法检测相当22而另一项研究发现，基于比色法的ELISA检测具有更高的灵敏度23. 本文提供了一个详细的方案 体外 利用编码碱性磷酸酶（AP）报告基因的腺相关病毒（AAV）与硝基蓝四氮唑/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（NBT/BCIP）底物之间的显色反应，建立了一种针对 AAV 的中和抗体（NAb）检测方法。该逐步操作方案基于先前使用人胎盘碱性磷酸酶（hPLAP）报告基因（AAV6-hPLAP）检测抗 AAV 中和活性的研究报告开发而成。24该检测方法成本低、效率高、易于操作，且对技术要求、实验设备和试剂的需求极少。此外，由于该检测方法操作简便，具有优化后广泛应用于不同类型细胞、组织或病毒血清型的潜力。

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方案

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所有动物护理和实验操作均遵循弗洛里神经科学与心理健康研究所的指南以及《澳大利亚科研用动物护理与使用规范》（参考文献25）。本研究使用了1.5至3岁的美利奴母羊。图1提供了检测方案的示意图概览。

转导抑制实验示意图，包含系列稀释、细胞孵育和显微镜结果。
图1：中和抗体（NAb）检测实验流程示意图。（A）NAb检测实验的可视化图示，展示了为期三天实验方案中的主要步骤。简言之，细胞接种后过夜培养。次日，制备血清的系列稀释液，与腺相关病毒（AAV）孵育后，再加入细胞中过夜孵育。第三天，固定细胞，洗涤后进行孵育，加入底物并再次孵育，随后进行成像与定量分析。（B）最低信号对照（AAV完全被抑制）、最高信号对照（无抑制）以及一份绵羊血清样本（信号抑制约50%）的代表性图像。比例尺 = 0.5 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 初始准备

  1. 用于绵羊样本检测：使用 8 mL 血清分离促凝管采集血液（参见材料表），将血液样本在室温（RT）下静置 20–30 分钟，随后以 2,100 × g 离心 15 分钟。试管上层形成的透明上清液即为血清。将透明的水相分装至微量离心管中，并在 -80 °C 下保存。
    注：在 -80 °C 下保存的血清稳定性约为 5 年。采血通过颈静脉进行，使用 16 G 针头（针尖截断）和注射器从清醒动物体内采集。
  2. 将胎牛血清（FBS）置于 56 °C 水浴中 30 分钟以进行热灭活，并间歇轻轻摇动。为确保精确，另取一瓶装有等体积水的容器放入温度计，与 FBS 样品同时放入水浴中。当温度计显示达到 56 °C 时开始计时。
  3. 后续所有在细胞培养操作台中进行的步骤均应采用规范的无菌技术和细胞培养操作26,27。使用前用 70% 乙醇喷洒所有物品及操作台表面，操作结束后用 1% 次氯酸钠清洁。
  4. 通过将高糖 DMEM（4.5 g/L）占 89%、热灭活 FBS 占 10% 以及青霉素-链霉素溶液占 1% 混合，制备完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。混合后使用无菌真空过滤系统（孔径 0.22 µm，聚醚砜膜）过滤（参见材料表）。将完全 DMEM 用铝箔包裹后于 4 °C 保存。
  5. 培养 HT1080 细胞（参见材料表），并按照文献28所述方法在 75 cm2 方形培养瓶中传代。建立多个冻存细胞株。细胞传代次数不得超过 20 代，因过度传代可能影响检测结果。

2. 第1天——细胞接种

  1. 当 HT1080 细胞生长至约 80% 汇合度时进行传代。
  2. 将完全 DMEM 培养基（步骤 1.4 中配制）、0.05% 胰蛋白酶-EDTA 和 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）在水浴中预热至 37 °C。使用抽吸系统移除传代细胞的培养基。
    注意：本实验方案中的所有抽吸操作均使用连接无菌 5 mL 刻度吸管的真空系统。
  3. 用 10 mL 预热（37 °C）的 1× PBS 洗涤细胞，随后加入 4 mL 预热的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，消化 3–4 分钟，使细胞从培养瓶上脱落。
  4. 加入 6 mL 预热的完全 DMEM 培养基以终止胰蛋白酶消化作用，并将细胞吹打混匀后转移至 50 mL 离心管中。使用血细胞计数板和台盼蓝排斥法计算活细胞数量和浓度29。
  5. 用预热的完全 DMEM 将细胞稀释至浓度为 1 × 105 个细胞/mL。每孔加入 100 µL 细胞悬液至透明的 96 孔平底板中（每孔含 1 × 104 个细胞）。将培养板置于 37 °C、5% 二氧化碳（CO2）环境中孵育过夜，时间为 16–22 小时。

3. 第2天——感染细胞

  1. 从培养箱中取出培养板，使用倒置显微镜观察，确认细胞在孔内分布均匀，且融合度约为50%。若细胞融合度未处于45%–55%范围内，请重复“第1天”实验步骤，并相应调整初始细胞浓度。
  2. 使用预热的完全DMEM培养基作为稀释液，在1.5 mL微量离心管中对目标血清样本进行系列稀释。表1展示了三个重复样本的稀释梯度制备方法。
    1. 为进行三重复实验，将AAV6-hPLAP病毒储备液（见材料表）用1×PBS稀释，配制浓度为7.5 × 106 拷贝基因组（vg）/µL的工作液。
    2. 向每管含有264 µL血清/培养基稀释液的试管中加入66 µL的7.5 × 106 vg/µL病毒工作液（总体积为330 µL/稀释度，见表1）。
      注意：本实验为稳健性较强的检测方法，无需绝对理想的细胞培养条件。但为了准确定量并确保每次实验结果可靠，必须在所有培养板中设置以下对照：（1）仅含病毒和培养基的对照，（2）仅含培养基的对照，以及（3）中和抗体阳性对照样本，且所有对照需在相同实验条件下进行。上述体积（330 µL）已包含三重复样本及血清与病毒混合液额外10%的余量。强烈建议设置重复样本，以准确测定中和活性。
  3. 用移液器吹打混匀病毒/血清稀释液，将含有病毒/血清混合物的离心管置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育30分钟，以允许潜在的中和反应发生。
  4. 将100 µL病毒/血清混合液加入96孔板的每一孔中，每孔预先接种有1 × 104个细胞（每个稀释度对应一孔）。
    注意：此操作将使每孔最终病毒感染复数（MOI）达到15,000个病毒/细胞。表2提供了一个评估样本至1/512稀释度的96孔板样本排布示例。
  5. 用铝箔纸包裹含有细胞、血清和AAV-hPLAP的96孔板，置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜孵育16–24小时，以允许AAV进入细胞。
稀释梯度标签稀释倍数3 × 样本 (240 μL) + 10% 缓冲液体积 (24 μL)血清:培养基比例
稀释1 (D1)1/2264 μL 血清 + 264 μL 培养基50:50
稀释2 (D2)1/4264 μL D1 + 264 μL 培养基25:75
稀释3 (D3)1/8264 μL D2 + 264 μL 培养基12.5:87.5
稀释4 (D4)1/16264 μL D3 + 264 μL 培养基6.25:93.75
稀释5 (D5)1/32264 μL D4 + 264 μL 培养基3.13:96.87
稀释6 (D6)1/64264 μL D5 + 264 μL 培养基1.56:98.44
稀释7 (D7)1/128264 μL D6 + 264 μL 培养基0.78:99.22
稀释8 (D8)1/256264 μL D7 + 264 μL 培养基0.39:99.61
稀释9 (D9)1/512264 μL D8 + 264 μL 培养基0.2:99.8
稀释10 (D10)1/2048132 μL D9 + 396 μL 培养基0.05:99.95
稀释11 (D11)1/8192132 μL D10 + 396 μL 培养基0.01:99.99
稀释12 (D12)1/32768132 μL D11 + 396 μL 培养基0.003:99.997

表1：为血清样本进行三份平行连续稀释时所需的血清与稀释液体积。

血清样本 #1血清样本 #2血清样本 #3单克隆抗体（mAB）、对照及额外样本
123456789101112
A1/21/21/21/21/21/21/21/21/250 ng MAb50 ng MAb50 ng MAb
B1/41/41/41/41/41/41/41/41/45 ng MAb5 ng MAb5 ng MAb
C1/81/81/81/81/81/81/81/81/80.5 ng MAb0.5 ng MAb0.5 ng MAb
D1/161/161/161/161/161/161/161/161/16MO (-C)MO (-C)MO (-C)
E1/321/321/321/321/321/321/321/321/32VO (+C)VO (+C)VO (+C)
F1/641/641/641/641/641/641/641/641/64样本 #1 1/512样本 #1 1/512样本 #1 1/512
G1/2561/2561/2561/2561/2561/2561/2561/2561/256样本 #2 1/512样本 #2 1/512样本 #2 1/512
H1/5121/5121/5121/5121/5121/5121/5121/5121/512样本 #3 1/512样本 #3 1/512样本 #3 1/512

表2：用于检测初始血清样品的96孔板布局示例，血清稀释倍数范围为1/2至1/512。若需检测已知含有AAV中和抗体的样品（给药后样品）或需要更高滴度时，可采用更高倍数的稀释。MO (-C)：仅培养基对照。VO (+C)：仅病毒和培养基对照。mAb：抗AAV单克隆抗体（中和抗体阳性对照）。

4. 第3天——固定细胞并添加底物

  1. 预热一份1x PBS至37 °C（约25 mL/96孔板）。另取PBS（约25 mL/96孔板）和双蒸水分别冷却2O（去离子水，约25 mL/96孔板）置于4 °C。溶解一粒BCIP/NBT（见 材料表在50 mL锥形离心管中，用10 mL去离子水溶解（10 mL足以用于2块96孔板），并通过涡旋混合。
  2. 使用连接于负压吸引系统或通风橱真空装置的移液管，吸除96孔板各孔中的培养基。将移液管管尖轻轻插入孔中，小心吸取培养基，注意避免扰动贴壁细胞。
    1. 使用移液器向每孔加入50 µL室温4% PFA。用铝箔包裹培养板，室温孵育10分钟以固定细胞。
      警告：多聚甲醛（PFA）可能具有致癌性，且通过皮肤接触、眼睛接触或吸入均具毒性。应在通风橱内操作，并佩戴适当的个人防护装备及面罩。用 PBS 新鲜配制 4% 多聚甲醛溶液（每块 96 孔板约需 7 mL）。
  3. 用 200 µL 室温 1x PBS 洗涤并吸弃上清，重复该步骤两次。
    注意：多通道移液器是移液步骤中的高效选择。
  4. 将200 µL预热的PBS加入每个孔中，用铝箔包裹培养板，在65 °C孵育90分钟，以变性内源性碱性磷酸酶活性30.
  5. 吸弃孔内液体，用 200 µL 冷（4 °C）PBS 洗涤细胞。再次吸弃液体，加入 200 µL 冷的去离子水（DDW）洗涤，再吸弃。
  6. 将50 µL溶解的BCIP/NBT（步骤4.1中配制）加入每个孔中。
  7. 用锡箔纸包裹培养板，在室温下孵育2-24小时。
    注意：不同实验组之间需保持孵育时间的一致性；时间上的灵活性允许用户在第3天或第4天拍摄孔板图像。
  8. 使用光学显微镜相机，采用4倍物镜对每个孔拍照，确保所有检测均使用相同的曝光、白平衡和光照设置。
    1. 将每个孔的位置保持一致，并确保孔的边缘在照片中不可见。以 TIF 格式或类似格式保存照片。
      注意：不同显微镜的具体设置可能有所差异，但为了获得最佳定量效果，应确保各孔内的背景光照强度较高且均匀一致。图1B).

5. 使用 ImageJ 定量测定中和活性

  1. 下载并安装免费提供的软件“ImageJ”（参见材料表）。
  2. 在 ImageJ 中通过选择 文件 > 打开 来打开待分析的图像（图2）。
  3. 如果使用彩色图像，请通过选择 图像 > 类型 > 8位 将其转换为灰度图像。
  4. 点击 图像 > 调整 > 阈值。调整阈值，直到所有着色区域显示为红色，而背景不被着色。加入 NBT/BCIP 后，着色产物将沉积在表达 hPLAP 的细胞周围区域。
    注：建议对同一块板上获取的所有图像使用相同的阈值设置。
  5. 点击 分析 > 设置测量，勾选 面积、限定于阈值、面积占比 和 显示标签 复选框，然后点击 确定。
  6. 要确定某个孔的信号读数（着色百分比），请点击 分析 > 测量。弹出窗口中的“% 面积”列即显示信号读数。
  7. 对所有样本重复孔进行定量分析。排除任何被污染的孔、细胞分布不均的孔，或细胞密度或光照条件存在差异的孔。
    ​注：参见 补充图1 了解应予以排除的孔的示例。通常，在一块 96 孔板中可能需要排除 3–4 个孔。图2 提供了使用 ImageJ 进行定量分析过程的可视化示意图。

图像分析过程；阈值调整示意图；用于覆盖率测量的软件界面。
图2：使用ImageJ软件确定染色百分比的步骤。（A）使用ImageJ软件打开待分析图像。（B）将图像转换为8位灰度图像。（C）打开阈值窗口。（D）调整最大阈值，使所有染色区域被覆盖，但背景区域不被覆盖（该阈值应在整块板上保持一致）。（E）选择“分析”下拉菜单，点击“设置测量”，勾选“面积”、“面积分数”、“限制阈值”和“显示标签”，然后点击“确定”。（F）点击“测量”以测定被覆盖的面积。“%面积”表示图像中被染色部分所占的比例。随后可结合对照样本用于确定TI50滴度。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 转导抑制（TI50）滴度的测定

  1. 确定以下各项的重复样本平均读数（使用步骤5中描述的步骤）：（1）仅培养基对照（基线信号读数）；（2）病毒+仅培养基对照（最大信号读数）；（3）目标病毒+血清样本。
  2. 使用以下公式计算抑制百分比：
    100 - [（测试样本信号读数（病毒 + 目标血清样本） - 基线信号读数（仅培养基对照））/（最大信号读数（仅病毒和培养基） - 基线信号读数） × 100] = % 转导抑制率13。
  3. 使用6.2中的公式计算所有样本各稀释度重复样本的转导抑制率%。针对所有样本和对照，计算每个稀释度技术重复之间的平均转导抑制率%。
  4. 通过确定能够使hPLAP活性转导抑制率达到或超过50%的最低样本稀释度，计算目标样本的50%转导抑制滴度（TI50滴度）。例如，若某样本在1/8稀释度下的转导抑制率根据6.2步骤计算结果大于50%（而1/4稀释度未达到），则报告其TI50滴度为1/8。

7. 中和腺相关病毒颗粒的测定

  1. 通过使用以下公式计算给定样本每微升血清中被中和的 AAV 粒子数量：
    ((MOI × 每孔细胞数) / (血清体积 / TI50 滴度的稀释倍数)) / 2 = 每微升血清中被中和的 AAV 粒子数9。
    注意：除以 2 是因为 TI50 测量的是 50% 的中和粒子。例如，若某样本的 TI50 滴度为 1/4（25% 血清，75% 稀释液），且检测中使用了 80 μL 未稀释血清，MOI 为 15k，接种至 1 × 104 个细胞，则计算如下：((15000 × 10000) / (80/4)) / 2 = 3.75×106 个被中和的粒子 / μL 血清。

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结果

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用于确定实现孔板覆盖的最佳病毒剂量的转导实验
本实验选用HT1080细胞，这是一种被广泛认可的纤维肉瘤细胞系。以每孔1 × 104个HT1080细胞的浓度接种，可在96孔板的每个孔中实现约50%的细胞融合度。为确定实验所需的最优病毒浓度，使用携带人胎盘碱性磷酸酶（hPLAP）报告基因的重组腺相关病毒（AAV6-hPLAP）31，在每孔中以不同病毒基因组颗粒数与细胞数的比值（MOI：0、150、500、1500、5000、15000、50000 和 150000）进行三复孔处理（图3A）。结果显示，MOI为15000（即每孔1.5 × 108 vg）时，孔板显色率达到36%，被确定为最佳病毒剂量。在MOI为0至15000范围内，显色程度与病毒浓度之间呈现显著正相关关系（n = 6，r = 0.995，P<0.001）。该浓度在中和抗体（NAbs）高浓度存在下（孔板显色较弱）仍能清晰显示报告基因信号，高于背景...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

This report describes a colorimetric assay that assesses the extent of AAV neutralization in a given serum sample by evaluating a chromogenic reaction corresponding to the degree of in vitro viral transduction. The development of the protocol was based on the known chromogenic reaction between the enzyme alkaline phosphatase and NBT/BCIP, which has been widely utilized as a staining tool for the detection of protein targets in applications such as immunohistochemistry and as a reporter tool for evaluating viral ...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由澳大利亚国家健康与医学研究理事会项目资助（JRM 和 CJT，编号 1163732）以及维多利亚州政府运营基础设施支持计划部分资助。SB 获巴克心脏与糖尿病研究所与拉筹伯大学联合博士奖学金支持。KLW 获 Shine On 基金会及澳大利亚心脏基金会未来领袖奖学金（编号 102539）支持。JRM 获澳大利亚国家健康与医学研究理事会高级研究奖学金（编号 1078985）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶/EDTAGibco25300-054
50 mL 锥形离心管Falcon14-432-22或同等产品
75 cm2 方形培养瓶Falcon353136或同等产品
96孔平底板Falcon353072
AAV6-CMV-hPLAP 载体肌肉研究 & 治疗学实验室（澳大利亚墨尔本大学）可根据要求提供 AAV6-CMV-hPLAP。
铝箔
抗完整AAV6小鼠单克隆抗体（ADK6）PROGEN610159阳性对照单克隆抗体
BCIP/NBTSIGMAFASTB5655
细胞和组织培养安全柜
电子移液器5 &和10 mL移液管吸头
胎牛血清Gibco10099-141
血细胞计数板
高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）Gibco11965118
HT1080 细胞ATCC
ImageJ 软件免费提供：https://imagej.nih.gov/ij/download.html
培养箱37 °C，5% CO2
带摄像头的光学显微镜能够使用4倍物镜拍摄照片
烘箱对于65 °C孵育
多聚甲醛MERCK30525-89-4
青霉素-链霉素Gibco15140-122
磷酸盐缓冲液
移液器和吸头20 μL, 200 μL &和1 mL单通道移液器及吸头 &和 200 μ多通道移液器
Stericup 快速释放滤器MilliporeS2GPU10RE用于混合培养基试剂
台盼蓝溶液Sigma-AldrichT8154
VACUETTE 真空采血管 8 ml CAT 血清分离促凝管Greiner BIO-ONE455071用于血清采集 &和绵羊样品的处理
水浴锅

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
  2. Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M. Ocular gene therapy with adeno-associated virus vectors: current outlook for patients and researchers. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 15 (3), 396-399 (2020).
  3. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 16(2018).
  4. Guggino, W. B., Cebotaru, L. Adeno-Associated Virus (AAV) gene therapy for cystic fibrosis: Current barriers and recent developments. Expert Opinion on Biological Therapy. 17 (10), 1265-1273 (2017).
  5. Perrin, G. Q., Herzog, R. W., Markusic, D. M. Update on clinical gene therapy for hemophilia. Blood. 133 (5), 407-414 (2019).
  6. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  7. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: A randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. Weber, T. Anti-AAV Antibodies in AAV gene therapy: Current challenges and possible solutions. Frontiers in Immunology. 12, 658399(2021).
  10. Weeks, K. L., et al. Phosphoinositide 3-kinase p110alpha is a master regulator of exercise-induced cardioprotection and PI3K gene therapy rescues cardiac dysfunction. Circulation: Heart Failure. 5 (4), 523-534 (2012).
  11. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  12. Bernardo, B. C., et al. Gene delivery of medium chain acyl-coenzyme A dehydrogenase induces physiological cardiac hypertrophy and protects against pathological remodelling. Clinical Science (London). 132 (3), 381-397 (2018).
  13. Meliani, A., et al. Determination of anti-adeno-associated virus vector neutralizing antibody titer with an in vitro reporter system. Human Gene Therapy Methods. 26 (2), 45-53 (2015).
  14. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  15. Wang, D., et al. Adeno-Associated virus neutralizing antibodies in large animals and their impact on brain intraparenchymal gene transfer. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 65-72 (2018).
  16. Wang, M., et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Therapy. 22 (12), 984-992 (2015).
  17. Kruzik, A., et al. Detection of biologically relevant low-titer neutralizing antibodies against adeno-associated virus require sensitive in vitro assays. Human Gene Therapy Methods. 30 (2), 35-43 (2019).
  18. Lehtoranta, L., Villberg, A., Santanen, R., Ziegler, T. A novel, colorimetric neutralization assay for measuring antibodies to influenza viruses. Journal of Virological Methods. 159 (2), 271-276 (2009).
  19. Johnston, P. B., Grayston, J. T., Loosli, C. G. Adenovirus neutralizing antibody determination by colorimetric assay. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 94 (2), 338-343 (1957).
  20. Xiaoli Zhu, T. G. Nano-Inspired Biosensors for Protein Assay with Clinical Applications. , Elsevier. 237-264 (2019).
  21. Jungmann, A., Muller, O., Rapti, K. Cell-based measurement of neutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV). Methods in Molecular Biology. 1521, 109-126 (2017).
  22. Samineni, S., et al. Optimization, comparison, and application of colorimetric vs. chemiluminescence based indirect sandwich ELISA for measurement of human IL-23. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 27 (2), 183-193 (2006).
  23. Siddiqui, J., Remick, D. G. Improved sensitivity of colorimetric compared to chemiluminescence ELISAs for cytokine assays. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 24 (3), 273-283 (2003).
  24. Arnett, A. L., Garikipati, D., Wang, Z., Tapscott, S., Chamberlain, J. S. Immune responses to rAAV6: The Influence of canine parvovirus vaccination and neonatal administration of viral vector. Frontiers in Microbiology. 2, 220(2011).
  25. National Health and Medical Research Council. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. National Health and Medical Research Council. , Canberra, Australia. Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
  26. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (3), 261-287 (2005).
  27. Journal of Visualized Experiments. General Laboratory Techniques. Journal of Visualized Experiments Database. , (2018).
  28. AAV-HT1080 Cells. Stratagene. , Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/240109.pdf (2003).
  29. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (3), 1-3 (2015).
  30. Bieber, S., et al. Extracorporeal delivery of rAAV with metabolic exchange and oxygenation. Scientific Reports. 3, 1538(2013).
  31. Winbanks, C. E., Beyer, C., Qian, H., Gregorevic, P. Transduction of skeletal muscles with common reporter genes can promote muscle fiber degeneration and inflammation. PLoS One. 7 (12), 51627(2012).
  32. Thomas, C. J., et al. Evidence that the MEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection from myocardial ischemia-reperfusion injury by 3',4'-dihydroxyflavonol. European Journal of Pharmacology. 758, 53-59 (2015).
  33. Barger, A., et al. Use of alkaline phosphatase staining to differentiate canine osteosarcoma from other vimentin-positive tumors. Veterinary Pathology. 42 (2), 161-165 (2005).
  34. Gregorevic, P., et al. Evaluation of vascular delivery methodologies to enhance rAAV6-mediated gene transfer to canine striated musculature. Molecular Therapy. 17 (8), 1427-1433 (2009).
  35. Sharma, A., Ghosh, A., Hansen, E. T., Newman, J. M., Mohan, R. R. Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 273-278 (2010).
  36. Smejkal, G. B., Kaul, C. A. Stability of nitroblue tetrazolium-based alkaline phosphatase substrates. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (9), 1189-1190 (2001).
  37. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  38. Orlowski, A., et al. Successful transduction with AAV Vectors after selective depletion of anti-aav antibodies by immunoadsorption. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 16, 192-203 (2020).
  39. Goossens, K., et al. Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples. Analytical Biochemistry. 423 (1), 93-101 (2012).
  40. Entrican, G., Wattegedera, S. R., Griffiths, D. J. Exploiting ovine immunology to improve the relevance of biomedical models. Molecular Immunology. 66 (1), 68-77 (2015).
  41. Walters, E. M., Prather, R. S. Advancing swine models for human health and diseases. Molecular Medicine. 110 (3), 212-215 (2013).
  42. Rapti, K., et al. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy. 20 (1), 73-83 (2012).
  43. Tellez, J., et al. Characterization of naturally-occurring humoral immunity to AAV in sheep. PLoS One. 8 (9), 75142(2013).
  44. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55 (5), 878-888 (2011).
  45. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321 (1-2), 1-18 (2007).
  46. Shankar, G., et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (5), 1267-1281 (2008).
  47. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. , (2019).
  48. Baatartsogt, N., et al. A sensitive and reproducible cell-based assay via secNanoLuc to detect neutralizing antibody against adeno-associated virus vector capsid. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 162-171 (2021).
  49. Watano, R., Ohmori, T., Hishikawa, S., Sakata, A., Mizukami, H. Utility of micro mini pigs for evaluating liver-mediated gene expression in the presence of neutralizing antibody against vector capsid. Gene Therapy. 27 (9), 427-434 (2020).
  50. Majowicz, A., et al. Therapeutic hFIX activity achieved after single AAV5-hFIX treatment in Hemophilia B patients and NHPs with pre-existing anti-AAV5 NABs. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 14, 27-36 (2019).

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