本文描述了一种全面的实验室方案和分析流程，用于快速、经济且简便的比色法细胞检测，以检测针对AAV6的中和成分。
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摘要
摘要
重组腺相关病毒（rAAV）已被证明是在实验室和临床环境中安全有效地递送遗传物质以治疗多种健康状况的载体。然而，针对AAV衣壳的预存中和抗体（NAbs）对在大型动物实验模型和人类群体中成功实施基因治疗构成了持续挑战。为确保以AAV为基础的基因疗法作为研究工具和具有临床可行性的治疗手段的有效性，有必要对宿主针对AAV的免疫反应进行初步筛查。本方案描述了一种比色法 体外 检测针对腺相关病毒6型（AAV6）的中和因子的检测方法。该检测利用编码碱性磷酸酶（AP）报告基因的AAV与其底物NBT/BCIP之间的反应，两者结合后可产生不溶性、可定量的紫色沉淀。
在本实验方案中，将血清样本与表达碱性磷酸酶（AP）的腺相关病毒（AAV）混合，并进行孵育，以允许潜在的中和活性发生。随后将病毒-血清混合物加入细胞中，使未被中和的AAV进行病毒感染和转导。加入NBT/BCIP底物后发生显色反应，其显色程度对应于病毒转导及中和活性。通过一款免费软件工具对显色面积比例进行定量分析，从而计算出中和滴度。该检测方法的显色程度与病毒浓度之间表现出强烈的正相关性。对绵羊在给予重组AAV6前后采集的血清样本进行检测，结果显示中和活性显著升高（从125倍增至>10,000倍）。该方法具有足够的灵敏度，可检测到稀释至>1:32,000血清样本中的中和活性。本检测提供了一种简单、快速且经济有效的方法，用于检测针对AAV的中和抗体（NAbs）。
引言
腺相关病毒（AAV）正越来越多地被用作基因治疗载体，以开展针对影响心血管、肺部、循环、眼部及中枢神经系统等多种健康状况的治疗试验1,2,3,4,5。AAV载体作为领先的基因治疗平台，其受欢迎程度源于其良好的安全性、长期的外源基因表达能力以及广泛的组织特异性趋向性1,6。动物研究中的成功结果已推动五十多项AAV基因治疗的临床试验成功达到疗效终点7，并促成了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首个商业化AAV基因治疗药物的上市8。在取得初步成功后，AAV作为首选载体在基础研究和临床研究领域持续获得广泛应用，目前也是美国和欧洲唯一获批用于临床的体内基因治疗手段9。然而，针对AAV载体衣壳预先存在的中和抗体（NAbs）仍然是限制临床前研究和临床试验疗效的主要障碍。NAbs在未经暴露的人群和动物群体中普遍存在，可在AAV载体体内
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方案
所有动物护理和实验操作均遵循弗洛里神经科学与心理健康研究所的指南以及《澳大利亚科研用途动物护理与使用规范》，参考文献25。本研究采用1.5至3岁的美利奴母羊。实验方案的示意图见图1。
图 1：中和抗体（NAb）检测方案的示意图。（A）NAb 检测的可视化流程图，展示了为期三天的实验方案中的主要步骤。简而言之，细胞在前夜接种并培养过夜；次日，将血清进行系列稀释，与 AAV 混合孵育后，再与细胞共孵育过夜；第三天，细胞经固定、洗涤、与底物孵育后再次孵育，随后进行成像与定量分析。（B）最低信号对照（AAV 完全抑制）、最高信号对照（无抑制）以及一份绵羊血清样本（约 50% 信....
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结果
用于确定最佳病毒剂量以实现孔板覆盖的转导实验
本实验选用 HT1080 细胞，这是一种广泛使用的纤维肉瘤细胞系。以每孔 1 × 104 个 HT1080 细胞的浓度接种，可在 96 孔板的每个孔中实现约 50% 的细胞汇合度。为确定实验所需的最佳病毒浓度，使用编码 hPLAP（人胎盘碱性磷酸酶）报告基因的重组腺相关病毒（AAV6-hPLAP）31，在每个孔中以不同病毒基因组颗粒数与细胞数之比（MOI：0、150、500、1500、5000、15000、50000 和 150000）进行三复孔处理（图 3A）。结果显示，MOI 为 15000（每孔 1.5 × 108 vg）时，孔板显色率达到 36%，被选定为最佳病毒剂量。在 MOI 0 至 15000 范围内，显色程度与病毒浓度之间呈现显著正相关（n = 6，r = 0.995，P<0.001）。该浓度可在中和抗体（NAbs）高浓度存在下（孔板显色较弱）.......
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讨论
本报告描述了一种比色法检测技术，通过评估与腺相关病毒（AAV）转导程度相对应的显色反应，来测定特定血清样本中AAV中和作用的程度。 体外 病毒转导。该实验方案的建立基于碱性磷酸酶与NBT/BCIP之间已知的显色反应，该反应已被广泛用作染色工具，以检测免疫组织化学等应用中的蛋白质靶标，或作为报告工具用于评估病毒转导。24,33,34,35其优势在于操作简便、成本低、耗时短、易于实施，同时仍表现出较高的实验效能。本实验所用的rAAV6（AAV-hPLAP）携带人胎盘碱性磷酸酶（hPLAP）报告基因，并由巨细胞病毒（CMV）启动子驱动表达。34 (补充图2NBT/BCIP 是一种hPLAP底物，最初被碱性磷酸酶去磷酸化，随后依次发生氧化反应形成二聚体，产生一种呈鲜明紫色的不溶性产物。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由澳大利亚国家健康与医学研究理事会项目资助（JRM 和 CJT，编号 1163732）以及维多利亚州政府运营基础设施支持计划部分资助。SB 获巴克心脏与糖尿病研究所与拉筹伯大学联合博士奖学金支持。KLW 获 Shine On 基金会及澳大利亚心脏基金会未来领袖奖学金（编号 102539）支持。JRM 获澳大利亚国家健康与医学研究理事会高级研究奖学金（编号 1078985）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶/EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 50 mL 锥形离心管 | Falcon | 14-432-22 | 或同等产品 |
| 75 cm2 方形培养瓶 | Falcon | 353136 | 或同等产品 |
| 96孔平底板 | Falcon | 353072 | |
| AAV6-CMV-hPLAP 载体 | 肌肉研究 & 治疗学实验室（澳大利亚墨尔本大学）可根据要求提供 AAV6-CMV-hPLAP。 | ||
| 铝箔 | |||
| 抗完整AAV6小鼠单克隆抗体（ADK6） | PROGEN | 610159 | 阳性对照单克隆抗体 |
| BCIP/NBT | SIGMAFAST | B5655 | |
| 细胞和组织培养安全柜 | |||
| 电子移液器 | 5 &和10 mL移液管吸头 | ||
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141 | |
| 血细胞计数板 | |||
| 高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM） | Gibco | 11965118 | |
| HT1080 细胞 | ATCC | ||
| ImageJ 软件 | 免费提供：https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| 培养箱 | 37 °C，5% CO2 | ||
| 带摄像头的光学显微镜 | 能够使用4倍物镜拍摄照片 | ||
| 烘箱 | 对于65 °C孵育 | ||
| 多聚甲醛 | MERCK | 30525-89-4 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 磷酸盐缓冲液 | |||
| 移液器和吸头 | 20 μL, 200 μL &和1 mL单通道移液器及吸头 &和 200 μ多通道移液器 | ||
| Stericup 快速释放滤器 | Millipore | S2GPU10RE | 用于混合培养基试剂 |
| 台盼蓝溶液 | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VACUETTE 真空采血管 8 ml CAT 血清分离促凝管 | Greiner BIO-ONE | 455071 | 用于血清采集 &和绵羊样品的处理 |
| 水浴锅 |
参考文献
- Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
- Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M.
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重印与许可
