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方法文章

来自 S. cerevisiae 细胞的双向驱动蛋白-5 Cin8 单分子及分子簇的运动特性

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DOI：

10.3791/63425

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2022年2月2日

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1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

本文内容

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摘要

双向有丝分裂驱动蛋白-5 Cin8 在运动过程中会聚集形成不断分裂和融合的簇状结构。聚集形成簇状结构还会改变 Cin8 的运动速度和方向性。本文介绍了一种利用纯化的 Cin8-GFP 进行运动性检测的实验方案，以及对 Cin8 单分子和簇状结构运动特性的分析方法。

摘要

有丝分裂双极驱动蛋白-5马达在纺锤体动力学中发挥着关键作用。这类马达蛋白具有同源四聚体结构，其活性复合物的两端各含有一对催化性马达结构域。这种独特的结构使驱动蛋白-5能够交联并推动反向平行的纺锤体微管（MTs）彼此滑动，从而产生将纺锤体两极向外推开的作用力。过去认为驱动蛋白-5仅朝微管正端移动，但近期研究表明，多种真菌来源的驱动蛋白-5在单分子水平上表现出朝微管负端移动的特性，并可在不同实验条件下发生运动方向的转换。 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 驱动蛋白-5 Cin8 就是一种具有双向运动特性的马达蛋白：在高离子强度条件下，Cin8 单分子沿微管（MTs）的负端方向运动。研究还表明，Cin8 会在微管的负端区域形成可运动的簇状结构，这种成簇现象使 Cin8 能够转换运动方向，实现缓慢的、朝向正端的运动。本文提供了使用 GFP 标记的驱动蛋白-5 Cin8 进行实验的完整操作流程，涵盖从蛋白在 S. cerevisiae 细胞及其纯化至 体外 单分子运动性分析。本文介绍了一种新开发的方法，可根据荧光强度区分Cin8单分子与Cin8聚集体。该方法可分别分析Cin8单分子和聚集体的运动性，从而实现对Cin8运动性与其聚集体大小之间依赖关系的表征。

引言

真核细胞内的大量运动过程由分子马达蛋白的功能介导。这些马达蛋白沿着细胞骨架纤维（包括肌动蛋白丝和微管（MTs））移动，并将ATP水解的化学能转化为细胞内生物运动所需的动能和机械力。S. cerevisiae 中基于微管的Cin8是一种双极性同源四聚体kinesin-5马达蛋白，能够交联纺锤体微管并使其相互滑动1。Cin8在有丝分裂过程中发挥着关键作用，参与纺锤体组装2,3,4以及后期（anaphase）的纺锤体延长过程5,6,7。先前研究表明，Cin8是一种双向运动的马达蛋白，可在不同实验条件下切换运动方向。例如，在高离子强度条件下，单个Cin8马达向微管的负端移动；而在多马达聚簇状态、多马达微管滑动实验以及反向平行微管之间，Cin8马达主要向微管的正端移动8,9,10,11,12。这些发现令人高度意外，原因有三：第一，Cin8的催化马达结构域位于氨基末端，而此类马达此前被认为仅朝向微管正端运动，但Cin8在单分子水平上却被证明可朝向微管负端运动；第二，kinesin马达此前被认为仅具有单向运动特性，即要么朝向正端，要么朝向负端，而Cin8则表现出依赖实验条件的双向运动特性；第三，由于有丝分裂纺锤体中微管的排列方向，kinesin-5马达在纺锤体组装和后期B阶段推动纺锤极分离的经典功能，只能通过其在所交联微管上朝向正端的运动来解释1,13。在首次报道Cin8的双向性之后，又有若干其他kinesin马达被证实具有双向运动能力14,15,16，表明kinesin马达的双向运动可能比早先认为的更为普遍。

先前已有报道称，在细胞中，Cin8 也以双向方式移动8，这支持了某些驱动蛋白-5（kinesin-5）马达的双向运动性对其细胞内功能具有重要意义的观点。此外，由于目前已报道的三种具有双向运动性的驱动蛋白-5均来自真菌细胞，近期有研究提出，这种双向性在真菌细胞中可能具有特定功能10。根据该模型，在真菌细胞的闭合式有丝分裂过程中，核膜在有丝分裂期间不会解体，驱动蛋白-5马达可提供初始作用力，使纺锤体两极在纺锤体组装之前分离。为完成这一任务，在纺锤体两极分离之前，驱动蛋白-5马达通过在单个核微管（MTs）上向微管负端移动，定位于纺锤体两极附近。到达该位置后，驱动蛋白-5马达发生聚集，转换运动方向，捕获并交联来自相邻纺锤体极的微管。随后，驱动蛋白-5马达通过在其交联的微管上向微管正端移动，提供两极最初的分离动力。根据该模型，真菌驱动蛋白-5马达在纺锤体组装中发挥功能需要两个过程：一是在单个微管上向负端的运动，二是在交联微管上通过反向平行滑动实现向正端的运动1,13。

本方法的总体目标是获得高纯度的真菌GFP标记的驱动蛋白-5 Cin8，并进行单分子运动分析（图1），同时分别研究Cin8单分子及其聚集体的运动行为。区分单分子与聚集体至关重要，因为已有研究表明，Cin8在微管（MTs）上形成聚集体是影响其运动方向性的因素之一10,12。其他运动分析方法，如微管表面滑动和微管滑移实验，无法提供关于单个马达蛋白活性的信息17,18。本文所描述的稳健的单分子运动实验及分析方法已成功应用于表征驱动蛋白-5马达Cin8和Kip1的多个功能特性10,11,12,14,19,20。

本文详细介绍了Cin8蛋白的过表达与纯化、微管（MTs）的聚合以及单分子运动性实验的完整方案。此外，还描述了用于区分Cin8单分子与分子簇，并通过均位移（MD）和均方位移（MSD）分析来确定单个马达蛋白及分子簇运动速度的分析方法。本方案旨在帮助研究人员直观了解实验各步骤，并为该类实验的故障排查提供指导。

微管-马达蛋白相互作用示意图；Cin8 在盖玻片上罗丹明标记的微管上的运动。
图1：单分子运动性检测的示意图。 生物素化的荧光微管通过与表面固定的生物素化BSA结合的亲和素附着在玻璃表面。绿色箭头表示在高离子强度条件下单个Cin8分子的运动方向。+/- 表示微管的极性。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

1. 缓冲液和试剂的准备

  1. 缓冲液
    1. -Leu 氨基酸缺陷型混合物：取腺嘌呤、尿嘧啶、色氨酸、组氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸各 2 g 混合，室温保存。
    2. 含棉子糖的酵母选择性培养基（1 L）：将 6.7 g 酵母氮源基础（含硫酸铵）、2 g -Leu 氨基酸缺陷型混合物和 20 g 棉子糖溶于双蒸水中，搅拌（无需加热）至完全溶解。使用 0.22 µm 滤器过滤溶液至无菌瓶中。
    3. 裂解缓冲液：在三蒸水中配制 25 mL 溶液，含 50 mM Tris、30 mM Pipes、500 mM KCl、10% 甘油、1.5 mM β-巯基乙醇、1 mM MgCl2、0.1 mM ATP 和 0.1% Triton X-100。用 6 M HCl 调节 pH 至 8。
    4. 洗脱缓冲液：在三蒸水中配制 10 mL 溶液，含 50 mM Tris、30 mM Pipes、500 mM KCl、350 mM 咪唑、10% 甘油、1.5 mM β-巯基乙醇、1 mM MgCl2、0.1 mM ATP 和 0.1% Triton X-100。用 6 M HCl 调节 pH 至 7.2。
    5. P12 缓冲液：在三蒸水中配制 10 mL 溶液，含 12 mM Pipes、1 mM EGTA 和 2 mM MgCl2。用 10 M NaOH 调节 pH 至 6.9。
    6. BRB80 缓冲液：在超纯水中配制 50 mL 溶液，含 80 mM Pipes、1 mM EGTA 和 2 mM MgCl2。用 10 M NaOH 调节 pH 至 6.9。
    7. 通用微管蛋白缓冲液（GTB）：在超纯水中配制 50 mL 溶液，含 80 mM Pipes、0.5 mM EGTA 和 2 mM MgCl2。用 10 M NaOH 调节 pH 至 6.9。
    8. Tris-Pipes 溶液：将 6.055 g Tris 和 9.07 g Pipes 溶于三蒸水中，配制成 40 mL 的 1 M Tris-0.6 M Pipes 溶液，用 6 M HCl 调节 pH 至 7.2，再用三蒸水定容至 50 mL。
      注：P12、BRB80 和 Tris-Pipes 缓冲液用于运动性测定中储备液的配制。这些缓冲液可大量配制，分装至 1.5 mL 离心管中，速冻后于 -20 °C 保存。
  2. 运动性测定用储备液
    1. 微管蛋白（10 mg mL-1）：将 1 mg 冻干微管蛋白溶于 100 µL 冷（4 °C）通用微管蛋白缓冲液（GTB）中。分装 1 µL 每份，速冻后于 -80 °C 保存。
    2. 生物素标记微管蛋白（1 mg mL-1）：将 20 µg 冻干微管蛋白溶于 20 µL 冷 GTB 中。分装 1 µL 每份，速冻后于 -80 °C 保存。
    3. 罗丹明标记微管蛋白（1 mg mL-1）：将 20 µg 冻干微管蛋白溶于 20 µL 冷 GTB 中。分装 0.5 µL 每份，速冻后于 -80 °C 保存。
    4. GMPCPP（10 µM）：GMPCPP 由供应商提供为 100 µL 水溶液，于 -80 °C 保存。将含 GMPCPP 的小瓶置于冰上解冻。分装 1 µL 每份，速冻后于 -80 °C 保存。
    5. ATP：在 0.5 M Tris 缓冲液（pH 8）中配制 500 µL 的 100 mM ATP 溶液。分装 2 µL 每份，速冻后于 -20 °C 保存。
    6. MgCl2：在 P12 缓冲液中配制 1 mL 的 200 mM MgCl2 溶液。分装 5 µL 每份，于 -20 °C 保存。
    7. 酪蛋白：在 BRB80 缓冲液中配制 1 mL 的 5 mg mL-1 酪蛋白溶液。分装 10 µL 每份，速冻后于 -20 °C 保存。
    8. D-葡萄糖：在 P12 缓冲液中配制 1 mL 的 1 M D-葡萄糖溶液。分装 10 µL 每份，于 -20 °C 保存。
    9. 葡萄糖氧化酶：在 P12 缓冲液中配制 1 mL 的 10 mg mL-1 葡萄糖氧化酶溶液。分装 2 µL 每份，速冻后于 -20 °C 保存。
    10. 过氧化氢酶：在 P12 缓冲液中配制 1 mL 的 0.8 mg mL-1 过氧化氢酶溶液。分装 2 µL 每份，速冻后于 -20 °C 保存。
    11. 二硫苏糖醇（DTT）：在通风橱中，用 P12 缓冲液配制 1 mL 的 1 M DTT 溶液。分装 10 µL 每份，速冻后于 -20 °C 保存。
    12. 磷酸肌酸：在 P12 缓冲液中配制 1 mL 的 1 M 磷酸肌酸溶液。分装 2 µL 每份，速冻后于 -20 °C 保存。
    13. 肌酸磷酸激酶：在 0.25 M 甘氨酰甘氨酸（pH 7.4）中配制 1 mL 的 5 mg mL-1 肌酸磷酸激酶溶液。分装 2 µL 每份，速冻后于 -20 °C 保存。
    14. EGTA：在超纯水中配制 100 mM EGTA 溶液，室温保存。
    15. KCl：在超纯水中配制 1 M KCl 溶液，室温保存。
  3. 运动缓冲液与反应体系
    1. 含 145 mM KCl 的运动缓冲液（MB），2× 储备液：取预配的 Tris-Pipes 溶液 100 µL、100 mM EGTA 20 µL、KCl 290 µL 和三蒸水 590 µL 混合，配制 1 mL 的 2× 运动缓冲液储备液。将缓冲液置于冰上保存。
    2. 运动反应体系：根据表 1配制运动反应体系，并置于冰上保存。
体积储存液浓度试剂名称
50 µL2XMB (来自步骤 1.3.1)
40 µL-TDW
1 µL100 mMATP
1 µL200 mMMgCl2
2 µL5 mg/mLCasein
1 µL1 MGlucose
1 µL1 MDTT
1 µL10 mg/mLGlucose oxidase
1 µL8 mg/mLCatalase
1 µL1 MPhosphocreatine
1 µL5 mg/mLCreatine phosphokinase
100 µL总计

表1.

2. Cin8 过表达及纯化 S. cerevisiae 细胞

  1. 培养 S. cerevisiae 含有用于过表达 Cin8-GFP-6His 质粒的细胞培养至对数生长阶段（OD600 在1 L添加了2%棉子糖（见步骤1.1.2）的酵母选择性培养基中，至OD600 = 0.6–0.8 28 °C12.
  2. 通过加入2%半乳糖诱导Cin8-GFP-6His过表达。通过测定600 nm处的吸光度监测酵母培养物的生长。
  3. 半乳糖添加后5小时，于4,000 x g离心收集细胞 g 15 分钟 4 °C，将细胞悬浮于裂解缓冲液中，并在液氮中冷冻2.
    注意：冻存的细胞可在 -80 °C 用于后续实验或立即在液氮中研磨2.
  4. 在液氮中研磨冷冻的细胞2 使用预冷的研钵和研杵。加入液氮2 研磨过程中需保持提取物处于冷冻状态。通常需要添加4-5次液氮2.
  5. 通过相差或微分干涉相差（DIC）显微镜观察监测细胞裂解。
  6. 解冻细胞沉淀，于21,000 x g离心 g 30 分钟 4 °C将上清液上样至装有2 mL Ni-NTA并用裂解缓冲液预平衡的重力流柱中，使上清液流经层析柱。
  7. 用五个柱体积的裂解缓冲液洗涤柱子，然后用五个柱体积的含有25 mM咪唑的裂解缓冲液洗涤。
  8. 用洗脱缓冲液洗脱Cin8-GFP-6His（见步骤1.1.4）。
  9. 通过SDS-PAGE分离洗脱样品，随后进行考马斯亮蓝染色，并使用α-GFP抗体进行蛋白质印迹分析19.
  10. 合并含有Cin8-GFP-6His的组分（步骤2.8和2.9）。进一步通过尺寸排阻色谱法（SEC）进行纯化，流速为0.5 mL/min。-1 以及1.5 MPa的柱压限制，同时监测280 nm处的吸光度和在488 nm激发下的GFP荧光发射图2A).
  11. 收集对应于Cin8-GFP四聚体的组分，并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹（参见步骤2.9）进行分析（图2B).
  12. 使用分光光度法或 Bradford 法、BCA 法等生化测定方法估算蛋白质浓度。
  13. 分装选定的组分，液氮速冻2, 并保存于 -80 °C这些纯化的蛋白质样品可保存使用6个月。
    注意：Cin8-GFP 在蛋白酶缺陷型菌株中过量表达并纯化 S. cerevisiae 含有以下成分的菌株 2 µm 用于在半乳糖诱导型启动子下过表达Cin8-GFP-6His的质粒，LGY 4093： MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1，pOS7（2µ, LEU2, PGAL1-CIN8-GFP-6HIS）。酵母菌株和质粒可应要求提供。

凝胶过滤层析结果显示蛋白质纯化；带有峰的图表及SDS-PAGE分析。
图2：Cin8-GFP的纯化。（A）经Ni-NTA纯化的Cin8-GFP的尺寸排阻层析图谱，通过488 nm激发并在约510 nm处检测GFP荧光信号。Cin8-GFP四聚体在约10 mL处从SEC柱中洗脱（以箭头标示）。（B）SEC洗脱组分的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶（上图）和抗GFP的Western印迹（下图）。泳道中的样品如下：M — 分子量标记物，Ni2+ — 加载至SEC柱的Ni-NTA纯化的Cin8-GFP样品，GF组分：对应于图A中标示的Cin8-GFP SEC洗脱峰的组分。右侧箭头标示了Cin8-GFP单体的大小（在SDS-PAGE上的预期大小）。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 使用纯化的 Cin8 进行单分子运动性分析

  1. 使用GMPCPP稳定的生物素和罗丹明标记的微管（MTs）的聚合。
    1. 在1.5 mL离心管中混合以下组分以启动微管聚合：1 µL 10 mg/mL微管蛋白、1 µL 1 mg/mL生物素化微管蛋白、0.5 µL 1 mg/mL罗丹明标记微管蛋白、1 µL 10 mM GMPCPP，以及6.5 µL通用微管缓冲液（GTB）。在37 °C下孵育1小时。
    2. 微管聚合完成后，加入80 µL预热至37 °C的GTB，轻轻混匀，并在16,500 × g下离心20分钟。
    3. 弃去上清液，用50 µL预热的GTB通过移液器反复吹打，小心重悬沉淀。将悬浮液储存在28 °C。
    4. 使用647 nm罗丹明通道在荧光显微镜下观察微管（图3A）。
      注意：为获得带有荧光标记的生物素化微管，聚合反应中需包含未标记微管蛋白、生物素化微管蛋白以及荧光标记微管蛋白。本方案中使用罗丹明标记微管蛋白，但也可使用其他荧光偶联物。
  2. 流动室组装
    1. 在高粘性玻璃载片上平行于长边放置四条双面胶带（约4 cm × 约3 mm），胶带之间相距约3–4 mm，形成三个“通道”。撕去胶带保护纸，将硅烷化盖玻片10置于胶带上，形成三个体积约为10 µL的流动室。
  3. 微管固定于亲和素包被的表面（图1）
    1. 使用微量移液器将15 µL 1 mg/mL生物素化牛血清白蛋白（b-BSA，溶于GTB）注入流动室，对硅烷化盖玻片表面进行包被。5分钟后，用80 µL GTB洗涤流动室。
    2. 随后，参照步骤3.3.1，将15 µL 1 mg/mL亲和素（溶于GTB）注入流动室，使其与b-BSA结合。5分钟后，用80 µL GTB洗涤流动室。
    3. 使用20 µL 1%泊洛沙姆对硅烷化盖玻片表面进行封闭。3分钟后，用80 µL GTB洗涤。
    4. 将生物素化微管（步骤3.1）通常以1:20比例稀释于GTB中，取20 µL注入流动室，使其结合至b-BSA-亲和素包被的盖玻片表面。将载片倒置（即盖玻片朝下）放入避光湿盒（例如含有湿润滤纸的培养皿）中，在室温下孵育5分钟。随后用200 µL GTB洗涤。
    5. 向流动室中加入30 µL运动反应混合液（见步骤1.3.2）。
    6. 将Cin8-GFP马达蛋白（步骤2.13）用20 µL运动反应混合液稀释（见表1），通常终浓度为5–10 µM。将其加入流动室后立即成像，观察马达蛋白沿微管的运动。
  4. 马达蛋白运动成像
    注意：微管结合及马达蛋白运动通过倒置落射荧光显微镜进行监测，显微镜配备汞弧灯、100x/1.4数值孔径物镜，以及两组荧光带通滤光片，一组波长为647 nm（用于罗丹明），另一组为488 nm（用于GFP）。
    1. 在显微镜物镜上滴加一滴浸油。将流动室放置于荧光显微镜载物台上，盖玻片朝下对准物镜。
    2. 开启罗丹明通道，聚焦于附着在盖玻片表面的微管，并使用Micro-Manager ImageJ-Fiji软件21以20 ms曝光时间采集图像。
    3. 开启GFP通道，以1秒间隔、800 ms曝光时间采集90帧延时图像，用于分析Cin8-GFP的运动行为。

荧光显微镜，微管组装，观察到的微管动力学，实验可视化。
图 3：微管及结合微管的 Cin8-GFP。（A）根据步骤 3.1 所述方案聚合微管后，按照步骤 3.4 所述使用 100 倍物镜成像的两个视野（左和右）图像。（B）Cin8-GFP（下层面板，箭头所示）结合于上层面板所示微管的两个视野图像。比例尺：4 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 运动性分析

注意：使用 ImageJ-Fiji 软件完成所有图像分析并生成明场图像轨迹图。

  1. 生成明场图像
    1. 打开延时录像和对应的微管场图像。通过选择以下选项来同步这两个窗口：分析 > 工具 > 同步窗口。
    2. 使用 分段线 选项标出一条微管，并使用 分析 > 多重明场图 选项卡生成明场图像。
  2. 确定 Cin8-GFP 的簇大小（即簇中 Cin8 分子的数量）
    1. 使用 处理 > 减去背景 选项进行背景扣除，并校正光照不均。将 滚动球半径 设置为 100 像素，并勾选 滑动抛物面 选项。
    2. 使用 ImageJ-Fiji 软件中的 TrackMate 插件，选择以下选项：插件 > 跟踪 > TrackMate > LoG 检测器 > 简单拉普拉斯跟踪器，在半径为 4 像素的圆形区域内，跟踪特定非运动性 Cin8-GFP 马达的平均荧光强度随时间的变化（图 3B）。
    3. 对不同的 Cin8-GFP 马达重复步骤 4.2.2。绘制不同 Cin8-GFP 马达的荧光强度随时间变化的曲线。
      注：一种用于测量簇大小（即簇中 Cin8 分子数量）的实验策略，为分析与 Cin8 簇集相关的运动性提供了基础。通过利用附着在 Cin8 上的 GFP 的光漂白，可确定单个 GFP 分子对 Cin8 簇总强度的贡献。例如，荧光强度以约 50 个任意单位（a.u.）为步长逐步下降，每一步可能代表一个 GFP 分子的光漂白（图 4A）。由于 Cin8 是一种同源四聚体马达蛋白，因此含有四个 GFP 分子。因此，所有荧光强度 ≤ 200 a.u. 的 Cin8 马达很可能是单个四聚体 Cin8 分子。根据此方法，将 Cin8 马达荧光强度的范围分别划分为 <200、200–400 和 >400，对应单个 Cin8 分子、Cin8 分子对（Cin8 四聚体的二聚体）和 Cin8 寡聚体12。
  3. 对 Cin8-GFP 马达进行强度分布分析
    1. 使用 ImageJ-Fiji 中的 TrackMate 插件，按照步骤 4.2.2 所述方法，测量延时序列第一帧中所有荧光 Cin8-GFP 马达的平均荧光强度。
    2. 以 20 a.u. 为区间大小，绘制 Cin8-GFP 平均强度的直方图，并将直方图的主要峰拟合为高斯曲线（图 4B）。
      注：强度分布分析可补充通过光漂白实验获得的 Cin8-GFP 马达簇大小的测定结果。对 Cin8-GFP 群体的强度分布直方图拟合的高斯曲线峰值出现在约 125 a.u.，这与含有一个、两个、三个或四个荧光（未漂白）GFP 分子的单个四聚体 Cin8 分子的平均强度一致，每个荧光 GFP 分子贡献约 50 a.u.。因此，使用该强度分布方法也可计算单个 GFP 分子的贡献值，进而用于确定 Cin8-GFP 分子的簇大小。

荧光强度时间图与直方图及显微镜图像；光谱学中的数据分析。
图 4：Cin8-GFP 漂白曲线及强度分布。（A）四种不同 Cin8-GFP 分子马达的 GFP 光漂白过程。单个光漂白步阶（每个可能代表一个 GFP 的漂白）导致荧光强度下降约 50 a.u。（B）延时序列首帧中 Cin8-GFP 分子马达的强度分布（插图）。以约 125 a.u 为中心的高斯峰（蓝色）代表单个 Cin8-GFP 分子。该峰反映了含有一个、两个、三个或四个荧光 GFP 分子的单个 Cin8 四聚体的平均强度，每个 GFP 分子对总强度贡献约 50 a.u（即 (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 追踪 Cin8-GFP 分子沿微管轨道的运动
    1. 使用矩形工具高亮标记待分析的微管区域，然后选择图像 > 裁剪，对录制的时序图像序列中需分析的微管进行裁剪。
    2. 选择一个荧光 Cin8-GFP 颗粒进行分析。使用点工具和测量功能，记录该颗粒在时序图像序列每一帧（时间点）中的坐标。对时序图像中其他荧光颗粒重复进行类似的坐标记录。
    3. 根据步骤 4.2 的描述，为所有被检测的 Cin8-GFP 颗粒在其首次出现的第一帧中分配簇大小。
  2. 平均位移（MD）与均方位移（MSD）分析
    1. 根据步骤 4.4 中确定的 Cin8-GFP 运动坐标，利用两点间距离计算公式，计算每个时间点相对于初始坐标的位移：
      距离公式 \(d_t = \sqrt{(x_t-x_0)^2 + (y_t-y_0)^2}\)；数学方程。
      其中，dt 表示时间 t 时 Cin8-GFP 的位移，xt 和 yt 为时间 t 时的相应坐标，x0 和 y0 为 t = 0 时 Cin8-GFP 的相应坐标。
    2. 基于上述位移值，计算特定 Cin8-GFP 颗粒在所有可能时间间隔内的位移。对所有被检测的 Cin8-GFP 颗粒重复该过程。
    3. 绘制所有被检测 Cin8-GFP 颗粒的平均位移（MD）随时间间隔的变化曲线，并进行线性拟合：MD = v × t + c。该拟合的斜率（v）代表运动性 Cin8-GFP 颗粒的平均速度。
      注：通过此方法，可分别计算属于每种簇大小的所有 Cin8-GFP 分子的平均速度，从而表征不同簇大小的运动特性。除 MD 分析外，还可通过将步骤 4.5.1 和 4.5.2 中计算的位移值平方，进行均方位移（MSD）分析。将 MSD 值对时间间隔作图，并拟合至多项式曲线 MSD = v2 × t2 + 2D × t + c，可获得额外参数 D，即 Cin8-GFP 运动的扩散系数。MD 分析应在具有极性标记的微管上进行8,10，而 MSD 分析则无需知晓微管极性。

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结果

本实验旨在研究不同簇大小的双向运动蛋白Cin8在单根微管（MT）上的运动特性。从图5A中的时空图也可明显看出Cin8-GFP的代表性运动行为，其中显示了马达蛋白随时间变化的空间位置。

为分析Cin8-GFP的运动特性，首先为每个与微管结合的运动性Cin8-GFP颗粒分配簇大小（步骤4.3），然后追踪所检测的Cin8颗粒位置随时间的变化（步骤4.4）。针对每个簇大小类别， >从记录中提取了40条单独的Cin8-GFP运动轨迹（图5B）。根据追踪分析获得的坐标，对每个簇大小群体分别进行MD和MSD分析。速度值通过MD的线性拟合获得，如文中所示 图5C. 研究发现，单个Cin8-GFP分子以高速度向微管负端进行单向运动，而Cin8聚集体则表现出明显较低的运动速度，并更倾向于双向运动（图5B, C).

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讨论

本研究介绍了利用双向驱动蛋白-5 Cin8 进行单分子运动实验的方案及运动分析方法。全长 Cin818（包含C端天然核定位信号（NLS））已从天然宿主 S. cerevisiae 中纯化获得。由于 Cin8 是一种核内马达蛋白，研磨液氮中的 S. cerevisiae 细胞被发现是最有效的细胞裂解方法。裂解后，通过结合金属亲和层析和尺寸排阻层析，可获得高纯度的 Cin8，这对于单分子运动实验至关重要。先前已有报道指出，Cin8 在粗提物与纯化样品中的运动特性存在差异8。此外，也有研究报道，微管上马达蛋白和非马达蛋白的拥挤效应会影响双向驱动蛋白-5 Cut7 的运动方向性22。因此，为获得可靠的运动分析结果并得出有关野生型与突变型马达蛋白行为的准确结论，必须使用高纯度的马达蛋白。本文所述技术可经适当的缓冲液调整后，便捷地应用于从酵母中纯化其他核蛋白。

本文介绍了一种利用GFP标记的Cin8进行的高稳健性和高...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究部分得到了以色列科学基金会资助（ISF-386/18）和以色列二国科学基金会资助（BSF-2019008）的支持，上述资助授予 L.G.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
腺嘌呤用于培养基DOC0230
ATPSigmaA7699
生物素标记的BSASigmaA8549
酪蛋白SigmaC7078
过氧化氢酶（C40）SigmaC40
肌酸激酶SigmaC3755
二硫苏糖醇（DTT）SigmaD0632
EDTASigmaE5134
EGTASigmaE4378
GFP荧光滤光片组色度49002：ET-EGFP（FITC/Cy2）
罗丹明荧光滤光片组色度49004：ET-CY3/TRITC
荧光倒置显微镜ZeissAxiovert 200M
半乳糖Tivan BiotechGAL02
葡萄糖SigmaG8270
葡萄糖氧化酶SigmaG7141
甘油SigmaG5516
甘氨酰甘氨酸默克G0674
GMPCPPJana BioscienceNu-405L
GTB细胞骨架BST01-010
GTPSigmaG8877
组氨酸Duchefa BiochemieH0710.0100
ImageJ-FIJI 软件https://imagej.net/plugins/trackmate/版本 2.1.0/1.53c；适用于 Windows 10 的 Java 1.8.0_172 [64 位]
咪唑SigmaI0125
InstantBlue 考马斯亮蓝蛋白质染色液Abcamab119211
透镜Zeiss100x/1.4 油镜 DIC 物镜
赖氨酸用于培养基DOC0161
氯化镁SigmaM8266
甲硫氨酸Duchefa BiochemieM0715.0100
NeoAndor TechnologiessCMOS相机
NeutraAvidin生命A2666
Ni-NTA 琼脂糖InvitrogenR901-15
磷酸肌酸SigmaP1937
管道SigmaP1851
泊洛沙姆 F-127（Pluronic acid F-127）SigmaP2443
氯化钾SigmaP9541
棉子糖Tivan BiotechRAF01
尺寸排阻色谱仪器GE HealthcareAKTA Pure
分光光度计ThermoFisher ScientificNanoDrop
Superose-6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
TrisRoshe10708976001
Triton X-100SigmaT8787
色氨酸Duchefa BiochemieT0720.0100
微管蛋白细胞骨架T240
微管蛋白，生物素化细胞骨架T333P
微管蛋白，TRITC罗丹明细胞骨架TL530M
尿嘧啶SigmaU0750-100G
酵母氮源基础培养基CYN0401S
α-GFP 抗体Santa Cruz BiotechnologySC8036
β-巯基乙醇SigmaM3148

参考文献

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036(2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687(2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420(2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999(2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131(2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597(2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772(2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288(2019).

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勘误


Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 6/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

标签

5 Cin8 GFP
来自 S. cerevisiae 细胞的双向驱动蛋白-5 Cin8 单分子及分子簇的运动特性
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