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方法文章

通过嗅觉挖掘任务评估小鼠的判断偏差

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DOI：

10.3791/63426

⸱

2022年3月4日

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology, University of Guelph, 2Institute of Cell Biology and Neurosciences, National Scientific and Technical Research Council-University of Buenos Aires, 3Laboratory of Experimental Animals, Faculty of Veterinary Sciences, National University of La Plata, 4Department of Animal Biosciences, University of Guelph

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文详细描述了一种新型的小鼠判断偏倚实验方案。同时展示了该嗅觉挖掘任务对情绪状态敏感性的证据，并讨论了其在不同研究领域的应用价值。

摘要

判断偏差（JB）是指处于积极和消极情感状态的个体在解释模糊信息时所表现出的差异。这种现象在人类中早已被观察到：处于积极状态的个体对模糊情境会做出“乐观”的反应，而处于消极状态的个体则表现出“悲观”倾向。研究人员在评估动物情感状态时，利用了这种不同的反应模式，开发出用于检测判断偏差的任务，以作为情感状态的指标。这类任务在多种物种和研究领域中正变得越来越流行。然而，对于实验小鼠——科研中最常用的脊椎动物，也是用于模拟情感障碍研究高度依赖的物种——目前仅有一种JB任务被成功验证为对情感状态变化具有敏感性。本文详细描述了这一新型小鼠JB任务，并提供了其对小鼠情感状态敏感性的证据。尽管仍需进一步优化，但对小鼠判断偏差的评估为回答有关小鼠福利的实际问题，以及关于情感状态在转化研究中影响的基础科学问题开辟了新的途径。

引言

测量情感调节的判断偏差（下文简称JB）已被证明是研究动物情绪状态的一种有效工具。这一创新方法借鉴了人类心理学的研究，因为处于积极或消极情感状态（情绪以及长期的心境）中的人类在信息处理方式上会表现出可靠差异1,2,3。例如，焦虑或抑郁的人可能将中性面部表情解读为负面，或将中性语句理解为具有威胁性4,5。这些偏差可能具有适应性价值，因此在不同物种间得以保留6,7。研究人员在评估动物情感状态时巧妙地利用了这一现象，将“乐观”操作化为对中性或模糊线索表现出更高的获得奖励预期，而将“悲观”操作化为对惩罚或无奖励的更高预期8,9。因此，在实验环境中，对模糊刺激所表现出的乐观或悲观反应可分别被解释为积极或消极情感状态的指标10,11。

与其他动物情感指标相比，判断偏差（JB）任务具有成为特别有价值工具的潜力，因为它能够检测情感状态的效价和强度10,11。JB任务能够检测积极状态（例如，Rygula等12），这一点尤为有用，因为大多数动物情感指标仅限于检测消极状态13。在JB任务中，动物通常首先被训练对预示奖励的阳性辨别性线索（例如高频音调）和预示惩罚的阴性辨别性线索（例如 低频音调）作出不同的反应，随后给予其一个模糊线索（例如，中频音调）8。若动物在面对模糊线索时“乐观地”表现出对阳性线索的训练反应（仿佛预期会获得奖励），则表明其存在正向判断偏差。相反，若动物表现出回避惩罚的阴性训练反应，则提示其存在“悲观”倾向或负向判断偏差。

自哈丁（Harding）及其同事开发出首个成功的动物JB任务以来8已开发出多种用于不同研究领域中多种物种的JB任务7但尽管动物跳跃箱任务的使用日益广泛，这类实验往往耗时费力。此外，或许由于其方法学上与启发它们的人类任务存在差异，有时会得出阴性或违背直觉的结果14 且通常仅产生较小的治疗效应量15因此，JB任务的开发与实施可能具有较大挑战性。事实上，对于实验小鼠而言——这是研究中使用最广泛的脊椎动物16,17 一种被广泛用于模拟情感障碍的物种18只有一项JB任务被成功验证为对情感状态的变化具有敏感性19 尽管在过去十年中进行了多次尝试（参见 Resasco 等人的补充材料）19 （以获取概述）。本文描述了近期已验证的小鼠跳台（JB）任务，详细介绍了其具有生物学相关性的设计，并强调了这种人道的任务可用于检验与小鼠情感状态相关的重要假设。总体而言，该方案可用于研究任何感兴趣变量对小鼠跳台行为的情感效应。这包括本文所述的分类处理变量（如药物或疾病效应、环境条件、遗传背景等），以及与连续变量的关系（如生理变化、家笼行为等）。

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方案

实验经圭尔夫大学动物护理委员会（AUP #3700）批准，遵循加拿大动物护理委员会指南进行，并按照ARRIVE（动物研究：In Vivo 实验报告）20 要求进行报告。

1. 实验准备

  1. 实验设计（见表1）。
    注意：本行为测试是一种基于气味的“Go/Go”挖掘任务，小鼠需挖掘以获取高价值或低价值奖励。该实验使用一个矩形区域（图1），包含两个臂，其中一个臂带有气味，另一个无气味。如下所述，小鼠首先被训练以区分阳性与阴性气味线索，随后接受一种模糊气味混合物的测试。
    1. 将笼子伪随机分配至薄荷或香草阳性辨别刺激（DS+）组，方法如下。
      注意：本方案仅在分配至香草DS+气味混合物的小鼠中得到验证（详见代表性结果及Resasco等19）。然而，强烈建议进行预实验，以确认DS+、DS-和模糊混合物符合有效判断偏向（JB）评估的要求（步骤4.7.3和5.3）。因此，此处所述方法包括对香草DS+和薄荷DS+两组的测试，以提供一个成功满足JB评估要求的示例组（香草DS+小鼠）和一个未能满足要求的示例组（薄荷DS+小鼠）。先前的预实验可提前识别此类问题。
    2. 薄荷DS+小鼠：对于这些小鼠，在训练阶段的区域设置过程中（见下文步骤1.4），使用薄荷气味线索标记气味分配器和含有高价值奖励的容器，使用香草气味线索标记不含奖励的容器。
    3. 香草DS+小鼠：对于这些小鼠，在训练阶段的区域设置过程中（见下文步骤1.4），使用香草气味线索标记气味分配器和含有高价值奖励的容器，使用薄荷气味线索标记不含奖励的容器。
      注意：该任务包括强化训练试验和非强化测试试验。在非强化测试试验期间，小鼠无法获得任何奖励（见下文步骤1.4.3），且薄荷和香草DS+小鼠所面对的模糊气味线索均为相同的1:1薄荷/香草混合物。
    4. 将笼子伪随机分配至左侧或右侧有气味臂组（在DS+气味组之间进行平衡），方法如下。
    5. 左侧：对于这些小鼠，在训练和测试阶段的区域设置过程中（见下文步骤1.4），使用适当的DS+或DS-气味线索标记左侧臂，并确保右侧臂始终无气味（仅用蒸馏水标记）。
    6. 右侧：对于这些小鼠，在训练和测试阶段的区域设置过程中（见下文步骤1.4），使用适当的DS+或DS-气味线索标记右侧臂，并确保左侧臂始终无气味（仅用蒸馏水标记）。
    7. 为每只动物随机分配一个“盲代码”，方法如下。
      注意：盲法可使操作小鼠并评分其行为的研究人员不知道动物编号或处理方式，从而避免不必要的主观偏差。这是遵守ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南及其他参考文件20的强制性步骤。
    8. 在包含每只动物编号及其对应处理方式的电子表格中添加一列用于盲代码。
    9. 为每只动物随机分配一个唯一的代码（例如字母与数字组合“A2”），该代码与笼号或处理方式无关。
      注意：所有随机化应使用随机数生成器（如Random.org）进行。在此随机化步骤中，应在适用的情况下对处理方式、品系等进行平衡。此操作应由在整个实验过程中保持“非盲”状态的研究助理完成。该人员不得参与测试期间的数据收集，以避免产生偏倚评估。
    10. 在所有数据收集中，仅向实时和视频评分挖掘潜伏期与挖掘持续时间的“盲法”研究人员提供动物的盲代码，以保持研究人员对处理方式的盲态。
      注意：数据收集期间使用的电子表格仅包含动物的盲代码以及每次试验对应的挖掘潜伏期和挖掘持续时间。实验结束后，可将对应的动物编号和处理信息添加至电子表格中，从而在数据分析阶段“揭盲”研究人员。
  2. 材料准备。
    1. 高价值食物奖励：用手将干燥的甜味香蕉片掰成约0.5 cm × 0.5 cm大小的碎片。
    2. 低价值食物奖励：使用砧板和刀具将啮齿类动物饲料（来自动物日常饮食）切成约0.125 cm3大小的碎片。
      注意：应在开始任务前进行预实验，以确定高价值和低价值奖励。
    3. 薄荷和香草香精：使用1 mL注射器或移液器，将薄荷和香草提取物加入已标记的离心管中。用蒸馏水按1:4比例稀释提取物，并通过反复倒置混合。每日新鲜配制，并在使用前反复倒置，以确保混合物新鲜且一致。
    4. 模糊气味混合物：在薄荷和香草香精稀释后，将等体积的两种稀释液加入同一离心管中（形成稀释香精的1:1混合物）。在测试模糊气味混合物反应当天配制，并在使用前反复倒置，以确保混合物新鲜且一致。
      注意：强烈建议进行预实验以确定合适的稀释度和中间气味混合物，以确保模糊探针的有效性，因为不同厂家、批次之间的气味强度可能存在差异。若提供多个模糊线索，应随机分配小鼠接受接近阳性、中点或接近阴性的测试线索。详见讨论部分。
    5. 棉垫：将每个圆形棉垫切成六个相等的部分（以便其能适配用作气味分配器的组织盒）。
      注意：高价值和低价值食物奖励、棉垫及气味混合物体积的数量取决于被测试受试动物的数量。请参见表1了解各阶段每只受试动物的试验次数，以及表2了解各类试验所需的材料。
    6. 确定实验区域：在饲养室或其他地点的工作台上进行训练和测试。所有试验均应在黑暗期红光下进行，此时小鼠处于活跃状态。
  3. 预训练（实验开始前1周）：在家庭笼中进行挖掘训练。
    1. 对于每组待测笼子，将少量玉米芯垫料倒入两个挖掘容器中（刚好覆盖容器底部即可），以帮助零食在掩埋时保持在容器中央。
    2. 在一个容器中，将高价值奖励碎片放在玉米芯层上方，使笼中每只小鼠都能获得一块（例如，三只小鼠的笼子放入三块香蕉片）。在另一个容器中，将低价值奖励碎片放在玉米芯层上方，使每只小鼠都能获得一块（例如，三只小鼠的笼子放入三块饲料）。
    3. 缓慢将玉米芯垫料倒入每个容器中的零食上方，覆盖零食并将容器填充至3 cm高度。
    4. 同时将一个高价值和一个低价值容器放入每个笼子中，持续10分钟。10分钟后，从所有笼子中移除容器。
    5. 丢弃容器中剩余的玉米芯和零食。用70%乙醇彻底擦拭所有容器，以防止动物和笼子气味影响后续试验。
    6. 连续5天每天重复步骤1.3.1–1.3.5。
      注意：本阶段的目标是让所有同笼小鼠在正式训练开始前有机会挖掘并食用零食。这也有助于小鼠对食物奖励的适应。
  4. 训练和测试区域的设置。
    1. 在红光下的工作台上放置实验区域。用70%乙醇彻底擦拭区域的所有组件、挖掘容器和气味分配器，以去除灰尘和先前试验留下的任何气味。
    2. 按如下方式准备挖掘容器。
    3. 将适当的食物奖励放入“不可进入隔室”（见图1）。
      注意：该隔室中包含的奖励取决于特定试验中掩埋的零食类型（如有）（见表2）。因此，每个容器在两个隔室中始终包含一块香蕉片和一块饲料。
      1. DS+气味容器：在强化试验中，将一块饲料放入不可进入隔室，并将一块香蕉片掩埋在容器的可进入区域。
      2. DS-气味容器：在强化试验中，将一块饲料和一块香蕉片均放入不可进入隔室。可进入区域中不提供任何食物奖励。
      3. 无气味容器：在强化试验中，将一块香蕉片放入不可进入隔室，并将一块饲料掩埋在容器的可进入区域。
      4. 在所有非强化测试试验（阳性、阴性和模糊）中，将一块饲料和一块香蕉片均放入不可进入隔室。可进入区域中不提供任何食物奖励。
        注意：此步骤旨在防止掩埋零食的气味泄露哪个容器含有奖励。因此，两个隔室之间的屏障设有小孔，以促进气味传递。
    4. 向每个容器中倒入少量玉米芯垫料，以在掩埋时保持食物奖励居中。将适当的食物奖励（见表2）的一块放在玉米芯层上方，然后缓慢倒入玉米芯垫料覆盖零食，并将容器填充至3 cm高度。
    5. 使用1 mL注射器或移液器吸取0.1 mL适当的气味混合物（即薄荷、香草或模糊混合物）或蒸馏水（见表2），并以环形方式直接注入玉米芯顶部。
    6. 准备气味分配器。
      1. 将一块棉垫放入组织盒底部。使用1 mL注射器或移液器吸取0.1 mL适当的气味混合物（即薄荷、香草或模糊混合物）或蒸馏水（见表2），并将其注入棉垫上。盖上组织盒盖子，封闭带气味的棉垫，形成气味分配器。
    7. 将挖掘容器放置在臂的末端，气味分配器放置在每个臂的起始处。在组织盒插槽前立即插入可拆卸的“门”，以阻断进入区域臂的通道，并形成起始隔室（见图1）。
      ​注意：挖掘容器、气味分配器和注射器必须清晰标记，并在整个实验过程中仅用于一种气味，以避免气味线索的意外混合（即在整个实验中为薄荷、香草、无气味和模糊混合物分别使用不同的材料组）。

2. 挖掘训练：5天，每天两次正向试验（表2）

  1. 训练前1小时，在小鼠的饲养笼中撤除食槽中的食物，使其禁食。
  2. 按照上述实验区域设置说明（步骤1.4），准备强化正向试验的实验区域。
  3. 在挖掘训练第1天，将食物奖励放置在3 cm厚的玉米芯垫料表面，而非埋入其中。
  4. 在接下来的4天内逐步加深食物奖励在玉米芯垫料下的埋藏深度，至第5天时将其埋至3 cm垫料的底部（即：第1天：置于玉米芯表面；第2天：用极薄一层玉米芯覆盖；第3天：埋至花盆底部一半深度；第4天：埋至花盆底部四分之三深度；第5天：埋至花盆底部）。
  5. 将小鼠从饲养笼转移至一个空的转运笼中。在转运笼顶部放置一张写有动物盲法编码的提示卡片，确保进行实验的研究人员对动物编号及处理分组保持盲态。将小鼠运送至实验区域。
    注意：步骤2.1和2.5应由熟悉小鼠的研究助理完成。后续试验中的操作应由对动物编号（及处理分组，如适用）保持盲态的研究人员执行。始终采用杯式抓取（开放手掌）或隧道式抓取（使用纸杯或塑料隧道）来操作小鼠，以避免传统抓尾操作带来的应激反应21。
  6. 将小鼠从转运笼转移至实验区域的起始隔间。移除起始“门”，立即盖上有机玻璃盖，并启动5分钟试验计时器。
    注意：若同笼多只小鼠需接受测试，应同时进行。但同时测试的动物数量取决于可用的盲法观察人员数量；理想情况下，一名研究人员应一次观察并操作一只动物，但在必要时可同时观察和操作两只动物。
  7. 实时记录小鼠在两个臂中的挖掘潜伏期和进食潜伏期。
    1. 挖掘潜伏期定义为首次观察到挖掘行为的时间点。挖掘行为指小鼠使用前爪和/或吻部主动推动或拨动玉米芯垫料。
    2. 进食潜伏期定义为首次观察到进食行为的时间点。进食行为指小鼠用前爪抓握食物并坐在后肢上进行摄食。
  8. 试验结束后，抬起有机玻璃盖，将小鼠移回转运笼中。
  9. 丢弃花盆中所有残留的玉米芯垫料和食物奖励。打开组织包埋盒，取出并丢弃棉片。使用70%乙醇彻底擦拭实验区域的所有组件、挖掘花盆，并对气味分配器进行充分喷洒消毒。
  10. 再次按照步骤1.4设置实验区域，进行第二次强化正向试验。重复步骤2.6–2.9。
  11. 将转运笼归还给研究助理，以便将小鼠放回其饲养笼中。
  12. 连续5天重复执行步骤2.1–2.11。

3. 辨别训练：10 天，每天四次试验

  1. 根据步骤 1.4 中的说明，设置正向或负向试验的实验区域（见表 2）。
  2. 每天进行两次正向试验和两次负向试验，试验顺序遵循表 2中的安排（即第 1-5 天交替进行正向和负向试验，第 6-10 天采用伪随机顺序）。
  3. 在每次训练日开始时按照步骤 2.1 的说明操作，然后执行步骤 2.5–2.10。重复该过程，直至小鼠总共完成四次试验。
  4. 将运输笼交还给研究助理，以便将小鼠放回其原饲养笼中。
  5. 每天重复步骤 3.1–3.4，共持续 10 天（即连续两个 5 天工作周，中间间隔 2 天周末）。

4. 测试

注意：测试持续时间为3-5天（根据每只小鼠达到学习标准所需时间而定），在进行阳性与阴性测试试验的阶段，每天进行五次试验；在进行模糊测试时，每天进行三次试验。

  1. 在训练/测试前1小时，通过从食槽中移除食物，在小鼠的饲养笼中对其进行禁食处理。
  2. 按照步骤1.4中的实验区域设置说明，以及步骤2.5–2.10中的强化试验说明，以随机顺序进行一次阳性试验和一次阴性试验（见表1）。
  3. 进行一次录像记录的非强化测试试验。
    注意：非强化试验与强化试验完全相同，仅奖励放置的位置不同。因此，在非强化试验中，高价值和低价值奖励各一块均放置于无法进入的隔间内，且适用于有气味和无气味的挖掘罐。
    1. 每天为每只小鼠进行一次阳性或阴性测试试验，直至达到学习标准（最多4天；学习标准见步骤4.7.3）。确保阳性和阴性测试试验在不同天交替进行（例如，第1天：阳性测试，第2天：阴性测试，第3天：阳性测试，依此类推）。
    2. 遵循步骤1.4中的实验区域设置说明。
    3. 将小鼠从转运笼转移至实验区域的起始隔间。将摄像机架设在三脚架上，确保两个臂末端的挖掘罐均在视野范围内，并开始录像。确保视频中录下写有动物盲编码及试验类型（阳性测试或阴性测试）的提示卡（以便后续视频评分时参考）。
    4. 移除起始“门”，立即放下有机玻璃盖板覆盖实验区域，并启动2分钟试验计时器。
    5. 试验结束后，停止录像，将摄像机移至一侧，抬起有机玻璃盖板，将小鼠移回其转运笼。
    6. 丢弃所有留在挖掘罐中的玉米芯垫料和食物。打开组织包埋盒，丢弃棉片。使用70%乙醇彻底擦拭实验区域的所有组件、挖掘罐和气味释放装置。
  4. 按照步骤1.4中的实验区域设置说明，以及步骤2.5–2.10中的强化试验说明，以随机顺序进行一次阳性试验和一次阴性试验（见表1）。
  5. 将转运笼交还给研究助理，以便将小鼠放回其饲养笼。
  6. 当所有小鼠完成每日五次试验后，将摄像机存储卡中的视频转移至计算机，用于视频评分。
  7. 在测试当天对阳性和阴性测试试验的视频进行评分，以评估小鼠是否达到学习标准。必须在同一天完成视频评分，因为达到学习标准的动物将在次日接受模糊性测试。
    1. 使用事件记录软件或秒表，由对处理分组不知情的研究人员记录每只小鼠在阳性（DS+）和阴性（DS−）测试试验中，第一分钟内对每个挖掘罐的首次挖掘潜伏期及挖掘持续时间。
    2. 将首次挖掘潜伏期定义为首次观察到挖掘行为的时间点。挖掘行为指小鼠使用前爪和/或吻部主动推动或操作玉米芯垫料。挖掘持续时间记录为小鼠进行挖掘行为的总时间。
    3. 比较每只小鼠在阳性（DS+）和阴性（DS−）试验中对有气味臂挖掘罐的挖掘持续时间，以判断动物是否能够区分任务。若在测试第一分钟内，DS+有气味臂的挖掘持续时间至少为DS−有气味臂的两倍（且DS+挖掘持续时间至少为3秒），则视为达到学习标准。
  8. 重复步骤4.1–4.7，直至小鼠达到学习标准。
    1. 对于在第4天仍未达到标准的个体，应将其排除在模糊性试验（以及由此进行的判断偏倚评估）之外。
  9. 对于已达到学习标准的小鼠，测试其对模糊气味混合物的反应。
    1. 在训练/测试前1小时，通过从食槽中移除食物，在小鼠的饲养笼中对其进行禁食处理。
    2. 按照步骤1.4中的实验区域设置说明，以及步骤2.5–2.10中的强化试验说明，以随机顺序进行一次阳性强化试验和一次阴性强化试验。
    3. 按照步骤4.3所述方法，使用模糊气味混合物进行一次录像记录的非强化测试试验（见表2）。
  10. 对模糊性试验视频进行评分，以评估判断偏倚。
    1. 使用事件记录软件或秒表，由对动物编号和处理分组不知情的研究人员记录每只小鼠在测试试验前1分钟和前2分钟内对每个挖掘罐的首次挖掘潜伏期（见步骤4.7.2）。

5. 数据分析

注意：所需的具体分析将取决于实验设计的细节。此处概述了一般性流程，但强烈建议研究人员参考 Gygax22 在规划动物JB实验的分析时，以及对Gaskill和Garner的致谢23 在选择样本量时（由于所需分析通常过于复杂，难以用于 先验的 功效分析。

  1. 通过为每个盲代码添加相应的动物编号和处理信息（例如，丰富化或常规饲养环境；药物或安慰剂等），向研究人员“揭盲”。确保最终的电子表格中，每只符合学习标准的动物均有三行数据（即阳性、阴性和模糊测试试验），并标明在有气味臂中挖掘的潜伏期。
  2. 使用常用的统计软件进行重复测量广义线性混合模型分析。其中，因变量为挖掘潜伏期。确保模型将处理方式（或感兴趣的连续变量）、试验类型以及处理方式与试验类型的交互作用作为固定效应；将小鼠编号（嵌套于处理方式内）作为随机效应。模型中包含的其他项取决于具体的实验设计。
    ​注意：若小鼠为群养（对此类社会性物种而言是适宜的24），且同笼小鼠均被测试，则必须将笼子（嵌套于处理方式内，如存在）作为随机效应纳入模型（随后小鼠编号需嵌套于笼子内）。
  3. 绘制每种试验类型中潜伏期的最小二乘均值图，以确认所呈现的模糊线索被解释为介于中间状态（即模糊试验的潜伏期最小二乘均值估计值应位于阳性与阴性潜伏期之间的中点）。只有满足此条件时，才可评估小鼠的判断偏差（JB）。
  4. 通过分析处理方式与试验类型的交互作用，评估处理方式（或感兴趣的连续变量）对模糊试验中挖掘潜伏期的简单效应，以判断小鼠是否表现出情绪调节性的判断偏差（JB）。

小鼠迷宫选择测试示意图，显示用于行为分析的带气味与无气味的挖掘罐。
图1：实验装置示意图。JB装置包括一个矩形区域和两个臂。每个臂的起始位置设有气味释放器，末端放置一个挖掘罐。经Elsevier许可，转载自Resasco等19。 请点击此处查看此图的放大版本。

阶段：实验设计
全部高价值奖励Banana chip
低价值奖励Rodent chow
DS+Mint or Vanilla (counterbalanced)
DS-Mint or Vanilla (counterbalanced)
挖掘训练挖掘训练时间表5 天：每天 2 次正向试验
挖掘试验持续时间5 min
辨别训练辨别训练时间表10 天：每天 4 次试验
挖掘试验顺序第 1–5 天：每天 4 次试验
 试验 1：正向
 试验 2：负向
试验 3：正向
 试验 4：负向
第 6–10 天：每天 4 次试验*
辨别试验持续时间5 min
测试测试时间表3–5 天（取决于达到学习标准所需时间）
 每天 5 次试验
测试阶段顺序试验 1 和 2：正向或负向**
试验 3：测试试验
试验 4 和 5：正向或负向**
测试试验持续时间2 min
* 试验采用伪随机化，确保小鼠每天始终进行两次正向和两次负向试验
** 试验采用伪随机化，确保测试试验前后各有一次正向和一次负向试验

表1：训练与测试的实验设计及时间安排概要。 挖掘训练、辨别训练和测试阶段每天的试验次数与顺序，以及实验设计的详细信息。经Elsevier许可，引自Resasco等19。

试验详情
阶段试验类型有气味组无气味组
气味线索埋藏奖励不可触及奖励气味线索埋藏奖励不可触及奖励
挖掘与辨别训练阳性训练DS+香蕉饲料水饲料香蕉
阴性训练DS-无奖励香蕉 + 饲料水饲料香蕉
测试阳性测试DS+无奖励香蕉 + 饲料水无奖励香蕉 + 饲料
阴性测试DS-无奖励香蕉 + 饲料水无奖励香蕉 + 饲料
模糊测试薄荷/
香草混合物		无奖励香蕉 + 饲料水无奖励香蕉 + 饲料
学习标准小鼠在DS+容器（阳性测试）中的挖掘时间必须是DS-容器（阴性测试）的两倍以上，且每次挖掘时间至少为3秒

表2. 试验细节汇总。 在挖掘训练、辨别训练和测试阶段中，每种试验类型所呈现的气味线索和奖励。DS(+)：阳性辨别性刺激，DS(-)：阴性辨别性刺激，Pos：阳性，Neg：阴性。经Elsevier许可，转载自Resasco等19。完整表格请参见原文中的补充表S2。

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结果

此处展示的结果反映了 Resasco 等人实验1中的相关发现。19本实验的受试对象为18只雌性C57BL/6NCrl（“C57”）和18只Balb/cAnNCrl（“Balb”）小鼠。动物在3至4周龄时抵达实验设施，并以混合品系四只一组的方式随机分配至环境丰富化饲养或常规饲养处理组（分别记为EH或CH）。25每个笼子中包含一只C57和一只Balb，此外还有两只DBA/2NCrl小鼠用于另一项实验。在此，使用雌性小鼠可实现这种社会性物种的群养并提供环境丰富化，同时避免雄性小鼠可能出现的攻击性升高和资源守护行为。26 （尽管需要注意的是，该任务也已应用于未富集的雄性裸鼠）19）。CH小鼠饲养在开放式透明聚乙烯笼（27 L × 16 W × 12 H cm；n = 9）中，垫料为玉米芯，提供两种筑巢材料（皱纸条和棉质巢垫）； 图2A），以及一个纸杯制成的“庇护所”。EH 笼为不透明塑料材质，尺寸...

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讨论

本文所述基于气味的挖掘实验方案及结果，展示了这一新型判断偏差（JB）任务检测小鼠情感状态变化的能力。因此，该任务为多个研究领域提供了一种有价值的工具。与任何其他判断偏差任务类似，要评估动物的情感状态，关键在于动物必须首先学会区分不同线索（步骤 4.7.3），并且能够将模糊刺激解释为介于两者之间的中间状态（步骤 5.3）。尽管这些要求看似简单，但在实际操作中实现起来却具有挑战性，尤其是在实验室小鼠中，此前已有超过15次尝试开发和实施小鼠判断偏差任务均告失败19。在本研究中，多个组成部分在满足这些技术标准方面发挥了关键作用，从而促成了该任务的成功及其应用价值。

首先，该任务的动物行为学设计促进了有效的辨别学习，因为辨别线索和所需反应均具有生物学相关性：小鼠具有出色的嗅觉能力，当呈现气味刺激时，能够快速学习并拥有较长的记忆保持时间33；同时，小鼠天生具有挖掘行为，用于一般性探索、觅食以及洞穴构筑24,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢Miguel Ayala、Lindsey Kitchenham、Michelle Edwards博士、Sylvia Lam和Stephanie Dejardin为本方案所依据的Reseasco等人19的验证工作所做出的贡献。我们还要感谢实验小鼠以及我们出色的动物饲养技术人员Michaela Randall和Michelle Cieplak。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无水乙醇市售酒精P016EAAN用蒸馏水稀释至70%，用于清洁
离心管Fischer55395用于此处稀释香精的15 mL离心管。但可根据样品总体积需求选择合适规格
Cheerios（原味）CheeriosN/A市售产品，用作训练动物进入附属笼进行操作的奖励物
玉米芯垫料Envigo7092Teklad 1/8英寸玉米芯垫料，用于挖掘罐和动物笼具
棉垫EquateN/A市售产品，在实验室中经改造以适配组织包埋盒用于气味释放
挖掘罐RubbermaidN/A市售容器，在实验室中经改造以适配实验装置
干燥甜味香蕉片Stock and BarrelN/A市售产品，作为JB任务中的高价值奖励物
JB装置N/A该装置由实验室自制
JWatcher事件记录软件麦考瑞大学动物行为实验室版本 1.0可免费在线下载，用于对JB任务中的挖掘行为进行评分
薄荷提取物FleiborN/A市售 "Menta (Solución)"，作为辨别性刺激气味
啮齿类动物饲料Envigo2914Teklad 全球14%蛋白啮齿类维持饲料，作为JB任务中的低价值奖励物及饲养笼中的常规饲料
SAS统计分析软件SAS版本 9.4其他功能相当的软件（如R）也可使用
香草提取物Fleibor市售 "Vainilla (Solución)"，作为辨别性刺激气味
摄像机SonyDCR-SX22Sony手持式摄像机

参考文献

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