方法文章

从小鼠垂体开发类器官 体外 探索垂体干细胞生物学的模型

DOI：

10.3791/63431

⸱

2022年2月25日

 ,  , 
1Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

垂体是机体内分泌系统的关键调节器官。本文介绍了一种从小鼠垂体发育而来类器官的新颖三维体外模型，用于研究垂体干细胞群体，而该群体的生物学特性与功能目前仍知之甚少。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

垂体是调节多种关键生理过程的主控内分泌腺体，包括身体生长、代谢、性成熟、繁殖以及应激反应。十多年前，垂体中被发现存在干细胞。然而，尽管已应用转基因技术 体内 方法、表型、生物学特性及其作用仍不明确。为解决这一难题，一种新颖且创新的类器官 体外 模型被用于深入揭示垂体干细胞生物学。类器官是指在特定培养条件下，由组织（上皮）干细胞自我发育形成的三维细胞结构，能够重现这些干细胞及其来源组织的多种特征。本文表明，小鼠垂体来源的类器官由腺体中的干细胞发育而来，并忠实地重现了其干细胞特性 体内 表型和功能特征。其中，它们能够重现干细胞的活化状态 体内 在响应转基因诱导的局部损伤时发生。这些类器官具有长期扩增能力，同时能强有力地维持其干性表型。这一新的研究模型对于解析干细胞在垂体重塑关键条件下的表型与行为具有重要价值，涵盖从新生期成熟到衰老相关功能衰退，以及从健康到病变腺体的多种状态。本文提供了一套详细的实验方案，用于建立小鼠垂体来源的类器官，为深入探索垂体干细胞这一尚不明确的领域提供了有力工具。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

垂体是一个微小的内分泌腺体，位于大脑底部，并与下丘脑相连。该腺体整合外周和中枢（下丘脑）输入信号，从而产生精确调节且协调的激素释放，进而调控下游靶向内分泌器官（如肾上腺和性腺），使其在适当的时间生成相应的激素。垂体是内分泌系统的关键调节器，因此恰当地被称为“主腺体”1。

小鼠垂体由三个叶组成（图1），即前叶（AL）、中间叶（IL）和后叶（PL）。主要的内分泌性前叶包含五种激素分泌细胞类型，包括分泌生长激素（GH）的生长激素细胞；分泌催乳素（PRL）的催乳激素细胞；分泌促肾上腺皮质激素（ACTH）的促肾上腺皮质激素细胞；负责促甲状腺激素（TSH）生成的促甲状腺激素细胞；以及产生黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的促性腺激素细胞。后叶由下丘脑的轴突投射构成，其中储存有催产素和血管加压素（抗利尿激素）。中间叶位于前叶与后叶之间，含有分泌黑素细胞刺激素（MSH）的黑素细胞。在人类垂体中，中间叶在发育过程中退化，黑素细胞则散布于前叶内1。除了内分泌细胞外，垂体还含有一群干细胞，这些细胞主要由转录因子SOX2标记2,3,

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究的动物实验已获得鲁汶大学动物实验伦理委员会批准（P153/2018）。所有小鼠均饲养于该校动物实验中心的标准条件下（温度恒定为23 ± 1.5 °C，相对湿度40%–60%，昼夜节律12小时交替），并可自由获取水和食物 随意摄取.

1. 小鼠

  1. 使用市售的小鼠品系，例如8至12周龄的年轻成年C57BL/6J小鼠。通常情况下，2至3只小鼠即可为本方案提供足够数量的腹膜腔淋巴细胞（AL细胞）。

2. 小鼠附睾脂肪组织的分离与解离

注意：培养基 A、B 和 C 需预先配制19,20。成分见表 2。

  1. 小鼠AL的分离
    1. 采用CO2窒息法处死小鼠，随后进行断头（图2A）。用去离子水清洗小鼠头部以去除血液，并喷洒70%乙醇以建立无菌环境。
    2. 使用无菌外科器械，去除两耳之间头部的皮肤（图2B）。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

分离并解离AL后，将获得的单细胞接种于ECM中，并在PitOM中培养（图1，表1）。图3A展示了接种时（第0天）的细胞培养状态及细胞密度。此时可能可见少量细小碎片（图3A，白色箭头），但在传代过程中会消失。接种14天后，AL来源的类器官已完全发育（图3A）。这些类器官呈现囊状形态，由一层上皮细胞包裹形成管腔。在此阶段，类器官直径可达500 µm，需进行传代。图3B显示了传代后AL来源类器官培养物在重新接种解离的类器官片段后指定时间点的生长情况。

有时，在类器官培养物中可能会出现一个或多个致密结构（图3A，不良情况）。在传代过程中，致密类器官容易占据主导地位，经过几次传代后，培养物中可能仅剩致密结.......

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此处所述的AL来源类器官是研究垂体干细胞的有力研究模型 体外 目前，这种类器官方法是可靠且稳健地培养和扩增垂体原代干细胞的唯一可用工具。已有研究报道，由胚胎干细胞（ESC）或诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的垂体类器官模型，能够高度模拟垂体胚胎发育过程。23；然而，尽管其在研究垂体发育或构建垂体疾病模型方面具有重要价值23,24,25与本文所述方法相比，从ESC/iPSC开始的已报道方案耗时较长，且所产生的类器官无法扩增。

垂体干细胞类器官的成功培养依赖于实验方案中的若干关键步骤。在初始细胞接种时，接种适量的细胞数量至关重要。细胞数量过多会导致培养物过度拥挤，从而降低类器官的存活率并阻碍其充分扩张；而细胞数量过少则会导致类器官形成受限。此外，在培养过程中必须避免破坏细胞外基质（ECM）凝胶滴的完整性。添加或更换培养基时应极为小心，避.......

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作获得了鲁汶大学研究基金和弗兰德斯科学研究基金（FWO）的资助。E.L.（11A3320N）和 C.N.（1S14218N）获得了FWO/FWO-SB博士奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM6250
48孔板，TC处理，独立包装Costar734-1607
A83-01Sigma-AldrichSML0788
高级DMEM/F12培养基Gibco12634010
牛血清白蛋白（细胞培养级）Serva47330
B-27添加剂（50倍浓缩），不含维生素AGibco12587010
包埋模具VWR720-1918
RLT缓冲液Qiagen79216
Q Path Microtwin包埋盒VWR720-2191
细胞滤筛，40 µm孔径，一次性使用Falcon352340
霍乱毒素（来源于Vibrio cholerae）Sigma-AldrichC8052
牛胰脱氧核糖核酸酶ISigma-AldrichD5025
D-葡萄糖Merck108342
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD2650
DMEM培养基粉末，高糖型Gibco52100039
Eppendorf Safe-Lock离心管，1.5 mLEppendorf30120086
Epredia SuperFrost Plus防脱载玻片Thermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Epredia HistoStar组织包埋工作站，220至240VacThermo Fisher Scientific12587976
无水乙醇，99.8%以上Thermo Fisher Scientific10342652
胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichF7524
GlutaMAX添加剂Gibco35050061
HEPESSigma-AldrichH4034
HEPES缓冲液Gibco15630056
InSolution Y-27632Sigma-Aldrich688001
L-谷氨酰胺（200 mM）Gibco25030081
Matrigel生长因子减少型（GFR）基底膜基质，无LDEVCorning15505739
Mr. Frosty冷冻容器Thermo Fisher Scientific5100-0001
N-2添加剂（100倍浓缩）Thermo Fisher Scientific17502048
N-乙酰-L-半胱氨酸Sigma-AldrichA7250
Nunc生物样本库与细胞培养用冻存管Thermo Fisher Scientific375353
用于合成的多聚甲醛（PFA）Merck818715
PBS，pH 7.4Gibco10010023
青霉素G钠盐Sigma-AldrichP3032
青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）Gibco15140122
酚红Merck107241
氯化钾（KCl）Merck104936
重组人EGF蛋白，CF级R&D systems236-EG
重组人碱性成纤维细胞生长因子/FGF2/bFGF（157个氨基酸）蛋白R&D systems234-FSE
重组人FGF-10Peprotech100-26
重组人IGF-1Peprotech100-11
重组人IL-6Peprotech200-06
重组人NogginPeprotech120-10C
重组人R-Spondin-1Peprotech120-38
重组人/鼠FGF-8bPeprotech100-25
重组小鼠Sonic Hedgehog/Shh（C25II）N端片段R&D systems464-SH
RNeasy微量试剂盒Qiagen74004
SB202190Sigma-AldrichS7067
SeaKem LE琼脂糖Lonza50004
氯化钠（NaCl）BDH102415K
一水合磷酸二氢钠PanReac-AppliChemA1047
碳酸氢钠（NaHCO3）Merck106329
丙酮酸钠（C3H3NaO3）Sigma-AldrichP5280
Stericup-GP滤器，0.22 µmMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP无菌离心管顶部滤器，0.22 μmMilliporeSCGP00525
无菌水FreseniusB230531
硫酸链霉素Sigma-AldrichS6501
Thermo Scientific Excelsior ES组织处理仪Thermo Scientific12505356
Titriplex IIIMerck108418
TrypL Express酶（1倍浓度），含酚红Thermo Fisher Scientific12605028
大豆（Glycine max）胰蛋白酶抑制剂Sigma-AldrichT9003
胰蛋白酶溶液 2.5%Thermo Fisher Scientific15090046

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1(2011).
  2. Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
  3. Chen,....

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