从小鼠垂体中开发类器官作为 体外 模型以探索垂体干细胞生物学

垂体是位于大脑底部的一个微小的内分泌腺体，在那里它与下丘脑相连。腺体整合外周和中枢（下丘脑）输入以产生调谐和协调的激素释放，从而调节下游目标内分泌器官（如肾上腺和性腺），以便在适当的时间产生适当的激素。垂体是内分泌系统的关键调节器，因此被正确地称为主腺^体1。

小鼠垂体由三个叶组成（图1），即前叶（AL），中间叶（IL）和后叶（PL）。主要的内分泌AL含有五种激素细胞类型，包括产生生长激素（GH）的生长激素;产生催乳素（PRL）的乳酸营养素;分泌促肾上腺皮质激素（ACTH）的促肾上腺皮质激素;促甲状腺激素负责促甲状腺激素（TSH）的产生;和促性腺激素，使黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）。PL由来自下丘脑的轴突组成，其中储存了催产素和血管加压素（抗利尿激素）激素。IL 位于 AL 和 PL 之间，含有产生黑素细胞刺激素 （MSH） 的黑色素营养体。在人垂体中，IL在发育过程中消退，黑色素营养体在AL¹内扩散。除了内分泌细胞外，垂体还含有一组干细胞，基本上由转录因子^{SOX2 2，3}，^4，5，6标记。这些SOX2 ⁺细胞位于边缘区（MZ），裂隙的上皮衬里（AL和IL之间的胚胎残余腔），或作为簇分布在AL的实质上，从而在腺体中提出两个干细胞位（图1）^{2，3，4，5，6}。

鉴于垂体不可或缺的性质，腺体功能障碍与严重的并发症有关。垂体功能亢进（以一种或多种激素分泌过多为特征）和垂体功能减退（一种或多种激素的产生缺陷或缺失）可由垂体神经内分泌肿瘤（PitNET;例如，产生 ACTH 的肿瘤导致库欣病）或遗传缺陷（例如，生长激素缺乏导致侏儒症）^引起7。此外，垂体手术（例如，切除肿瘤）、感染（例如，下丘脑-垂体结核，或细菌性脑膜炎或脑炎后感染）、希恩综合征（由于分娩时大量失血导致血流不足而坏死）、垂体卒中和创伤性脑损伤是垂体功能减退的其他重要原因⁸.已经表明，小鼠垂体具有再生能力，能够修复由内分泌细胞的转基因消融引起的局部损伤^9，10。SOX2⁺ 干细胞对所受损伤产生急性反应，表现出活化的表型，其特征是增殖增强（导致干细胞扩增）和干细胞相关因子和途径（例如WNT/NOTCH）表达增加。此外，干细胞开始表达消融的激素，最终导致在接下来的（5至6）个月^9，10中大量恢复耗尽的细胞群。此外，在腺体的新生儿成熟阶段（出生后的前3周），垂体干细胞在活化状态下茁壮成长^{6，11，12，13}，而生物体衰老与 原位 干细胞功能下降有关，这是由于衰老时炎症（微）环境增加（或"炎症"）^10，14.此外，腺体中的肿瘤发生也与干细胞活化^7，15有关。虽然在几种垂体重塑情况下已经检测到干细胞活化（在^7，16中综述），但潜在的机制尚不清楚。由于 体内 方法（例如转基因小鼠的谱系追踪）尚未提供垂体干细胞的清晰或全面图像，因此开发可靠的 体外 模型以探索正常和患病垂体中的干细胞生物学至关重要。原代垂体干细胞的标准 体外 培养仍然不足，因为生长能力非常有限，非生理（2D）条件可快速丧失表型（有关更详细的概述，请参见¹⁶）。3D球体培养物（垂体）已从垂体干细胞中建立，这些干细胞由侧群和SOX2 ⁺ 表型^2，3，4鉴定。皮体从干细胞克隆生长，表达干细胞标志物并显示出分化能力，进入内分泌细胞类型。然而，它们并没有显着扩展，而仅显示出有限的可传递性（2-3个段落）^3，4。在50%稀释的基质胶中培养1周时，也从未解离的垂体干细胞簇中获得球状结构，但未显示可膨胀性¹⁷。皮体球法主要用作干细胞数的读出工具，但进一步的应用受到膨胀能力较差的限制¹⁶。

为了解决和克服这些缺点，最近建立了一种新的3D模型，即类器官，从含有MZ和实质干细胞的小鼠的主要内分泌AL开始。已经证明，类器官确实来自垂体的干细胞，并忠实地概括了它们的表型¹⁸。此外，类器官是长期可膨胀的，同时有力地保持其干性。因此，它们为扩增原代垂体干细胞提供了一种可靠的方法，以进行深入的探索。这种探索是无法用从垂体中分离出的有限数量的干细胞来实现的，这些干细胞在2D条件下也是不可扩增的¹⁶。已经证明，类器官是发现新的垂体干细胞特征（可转化为 体内）的有价值和可靠的工具^14，18。重要的是，类器官模型忠实地反映了在局部组织损伤和新生儿成熟期间发生的垂体干细胞活化状态，显示出增强的形成效率和复制上调的分子途径^14，18。因此，垂体衍生的类器官模型是一种创新而强大的垂体干细胞生物学研究模型，也是一种干细胞活化读出工具。

该协议详细描述了小鼠垂体衍生类器官的建立。为此，将AL分离并解离成单个细胞，这些细胞嵌入在细胞外基质模拟基质基质（以下简称ECM）中。然后将细胞 - ECM组装在定义的培养基中培养，该培养基基本上含有干细胞生长因子和垂体胚胎调节剂（进一步称为"垂体类器官培养基"（PitOM）¹⁸; 表 1）。一旦类器官完全发育（10-14天后），它们可以通过序贯传代进一步扩大槽，并进行广泛的下游探索（例如，免疫荧光，RT-qPCR和本体或单细胞转录组学; 图 1）。从长远来看，预计垂体干细胞类器官将为组织修复方法和再生医学铺平道路。

本研究的动物实验已获得KU鲁汶动物实验伦理委员会（P153 / 2018）的批准。所有小鼠均在标准化条件下（恒温23±1.5°C，相对湿度40%-60%，昼/夜循环12小时）饲养在大学的动物设施中， 并随意获得水和食物。

1. 老鼠

1. 使用市售的小鼠品系，如C57BL / 6J小鼠，年轻人年龄（8-12周大）。通常，2-3只小鼠为方案提供足够数量的AL细胞。

2. 小鼠AL的分离和解离

注:介质A、B和C是提前准备的^19、20。组合物示于 表2中。

1. 小鼠AL的分离
   1. 通过CO₂ 窒息对小鼠实施安乐死，然后斩首（图2A）。用去离子水清洗小鼠头部以除去血液，并用70%的EtOH喷洒它们以产生无菌环境。
   2. 使用无菌手术工具，去除耳朵之间的头部皮肤（图2B）。
   3. 打开颅骨，切除大脑。
      1. 打破"鼻梁"（即额骨的前部; 图 2B）用无菌剪刀。
      2. 用剪刀进一步打开颅骨，从断裂的鼻梁开始，朝向两侧的耳朵（图2C）。
      3. 用无菌镊子去除颅骨和大脑，而不接触垂体（图2D）。
   4. 用钝镊子去除 膈肌 ，而不会损伤垂体。在立体显微镜下丢弃AL中的PL和IL。
      注意:PL 和 IL 是链接的，因此可以同时删除。与粉红色的AL相比，这些部分显示为白色组织（图2D）。
   5. 用钝镊子小心地分离AL，并将其收集在10 mL锥形瓶中，装满3 mL培养基A（见 表2）。将烧瓶放在冰上，直到进一步处理。
2. 小鼠AL的解离
   1. 从含有分离AL的锥形瓶中除去上清液（SN）培养基A.加入2mL预热（37°C）2.5%胰蛋白酶溶液，并在37°C下孵育15分钟。
   2. 在不去除胰蛋白酶溶液的情况下，加入2mL预热（37°C）DNase溶液（培养基A中2μg/ mL;通过0.22μm网进行无菌过滤），并将锥形瓶旋转10次。让垂体沉入底部（约1分钟）并去除SN。
   3. 加入2mL预热（37°C）胰蛋白酶抑制剂溶液（在培养基A中0.1mg / mL;通过0.22μm目无菌过滤），并在37°C下孵育10分钟。让垂体沉淀物到底部并去除SN。
   4. 加入2mL预热（37°C）培养基B（见 表2），并在37°C下孵育5分钟。在不去除SN的情况下，加入2mL预热（37°C）培养基C（见 表2），并在37°C下孵育15分钟。
   5. 让垂体沉入底部并去除SN。用预热（37°C）培养基冲洗垂体三次。
   6. 将垂体解离成单细胞。
      1. 加入2 mL预热（37°C）培养基C.抽吸并用无菌的火焰抛光巴斯德移液器多次排出垂体，直到碎片不再可见。
      2. 将悬浮液转移到15mL管中，该管具有4.5mL预热（37°C）DNase溶液（在培养基A中为2μg/ mL;通过0.22μm目络无菌过滤）。用2mL预热（37°C）培养基C冲洗锥形管三次，并将悬浮液转移到15mL管中。
   7. 混合收集的细胞悬浮液，并通过40μm细胞过滤器将其过滤到30mL管中。用2 mL培养基C冲洗15 mL管和细胞过滤器三次，并将悬浮液转移到30 mL管中。
   8. 将装有2mL 3%牛血清白蛋白（BSA）溶液（在培养基A中;通过0.22μm网眼无菌过滤）的玻璃巴斯德移液器的尖端置于管的底部，轻轻移液以形成可见的密度层。在4°C下以190× g 离心10分钟。
   9. 通过一次流畅的运动反转管子来去除SN，并用P1000尖端去除剩余的SN液滴。将细胞沉淀重悬于1mL冰冷的高级DMEM / F12（Adv DMEM / F12）中，并用细胞计数器定量细胞。

3. AL衍生类器官的建立和培养

注意:提前在冰上解冻ECM（2-3小时，持续1毫升），并在方案期间将其保持在冰上。

1. 类器官播种和培养
   1. 在4°C下以190× g 离心AL细胞悬浮液10分钟并除去SN。使用计算的比体积将细胞沉淀重悬于Adv DMEM / F12中，以达到1.1 x 10⁶ 个细胞/ mL的细胞密度。
      注意:例如，如果细胞悬浮液含有500，000个细胞/ mL，则必须将细胞沉淀重悬于454.54μL Adv DMEM / F12中以达到所需的密度1.1 x 10⁶ 个细胞/ mL。
   2. 取出接种所需的细胞悬浮液体积（根据所需的细胞悬浮液数量，用于类器官发育的晶种数量），并以30:70的比例（30%细胞悬浮液（Adv DMEM / F12）和70%ECM）添加ECM。通过上下移液充分混合。
      注意:例如，对于一滴30μL（参见步骤3.1.3），应（轻轻地）将9μL细胞悬浮液（从1.1 x 10⁶ 细胞/ mL悬浮液中取出时含有约10，000个细胞）与21μLECM混合。
   3. 每孔，将30μL滴细胞悬浮液/ ECM混合物（参见步骤3.1.2）沉积在预热（37°C）48孔板上。将板倒置，让ECM在37°C下固化20分钟。
      注意:在37°C下预热培养板至少24小时。
   4. 将板返回到其正确的方向，并小心地加入250μL预热（37°C）PitOM（见 表1），并补充10μM岩石抑制剂（Y-27632）。
   5. 通过每2-3天更换培养基（没有Y-27632）继续培养类器官，直到类器官完全生长，这需要10-14天（图3A）。然后，通过类器官。
      注意:吸气介质时，请确保不要损坏 ECM 半球罩。稍微倾斜培养板，并从孔的底部边缘取出培养基。新鲜（在37°C下预热）培养基应轻轻地添加到孔的侧面。如果凝胶液滴脱附，收集类器官并重悬并在新的ECM液滴中再次培养它们。
2. 类器官传代
   1. 轻轻吸出培养基并加入400μL冰冷的Adv DMEM / F12以分解ECM并将类器官收集在微量离心管中。用400μL冰冷的Adv DMEM / F12 EM洗涤一次。在4°C下以200× g 离心5分钟。
   2. 小心地除去SN，并加入400μL预热（37°C）TrypLE表达酶（1X）。通过倒置管几次混合，并在37°C下孵育5分钟。
   3. 加入400μL冰冷的Adv DMEM / F12，并在4°C下以200× g 离心5分钟。 删除 SN。
   4. 用100μL冰冷的Adv DMEM / F12重悬沉淀，然后通过用狭窄的P200尖端（即，将空尖端向下推至微量离心管底部，以减小其开口直径）上下剧烈移液来破碎类器官，直到获得类器官碎片（直径约为50μm）（图3B）。
      注意:解离混合物应主要包含类器官片段，仅包含少数单个细胞。类器官严重解离成单细胞会对类器官的再生长产生负面影响。
   5. 加入800μLAdv DMEM / F12，并在4°C下以190× g 离心10分钟。 删除 SN。
   6. 以1:2至1:4的比例通过类器官。根据需要将沉淀重悬于足够体积的Adv DMEM / F12中，以30:70的比例（30%细胞悬浮液和70%ECM）添加ECM。通过上下移液充分混合。
   7. 如上所述步骤3.1.3-3.1.5所述的类器官的种子和培养物。
      注意:平均而言，每孔从接种的10，000个全AL细胞（0.2%）中产生20个类器官。这些通道0类器官可以以1:2的比例分裂，导致每孔发育>50类器官（通道1）。然后，在随后的传代中，类器官可以以1:2至1:4的比例分裂。类器官的再生在~10次传代（相当于3个月的培养）后减慢，在逐渐减少和较小的类器官中具体化。

4. AL衍生类器官的冷冻保存和解冻

1. 类器官的冷冻保存
   1. 遵循从步骤 3.2.1 到步骤 3.2.5 的传递协议。
   2. 用1mL冷冻保存培养基重悬类器官沉淀（含有片段和细胞）（表3）。将悬浮液转移到冷冻室中并将其放在冰上。
      注意:来自48孔板的最多四个孔的类器官（即产生的片段和细胞）可以组合在一个冷冻管中。
   3. 将冷冻管置于冷冻容器中并将其转移到-80°C。
   4. 24小时后，将样品转移到冷冻箱中并将其储存在液氮（-196°C）中以长期储存。
2. 冷冻保存的类器官解冻
   1. 从液氮罐中取出冷冻管并将其放在冰上。立即进行解冻方案。
   2. 用冷冻保存的类器官碎片和单个细胞在37°C（水浴）下解冻溶液。
      注意:不要将溶液在37°C下保存超过2分钟，以避免DMSO的细胞毒性。
   3. 将内容物转移到含有10 mL冰冷Adv DMEM / F12和30%胎牛血清（FBS）的15 mL管中。用1毫升Adv DMEM / F12和30%FBS冲洗冷冻管。
   4. 在4°C下以190× g 离心10分钟。 用1mL冰冷的Adv DMEM / F12重悬沉淀，并将悬浮液转移到微量离心管中。
   5. 在4°C下以190× g 离心10分钟。 根据需要将沉淀重悬于足够体积的Adv DMEM / F12中，以30:70的比例添加ECM。通过上下移液充分混合。
   6. 如上所述步骤3.1.3-3.1.5所述的类器官的种子和培养物。

5. AL衍生类器官的验证

1. 用于RNA分离的类器官的收集和裂解
   1. 如上所述收集并离心类器官（步骤3.2.1）。
   2. 除去SN，加入350μL裂解缓冲液与1%2-巯基乙醇。涡旋30秒并储存在-80°C或立即进行RNA分离。
      注意:请注意，2-巯基乙醇是一种有毒化合物。所有工作必须在化学通风橱中完成，同时戴上丁腈手套，防尘口罩和安全眼镜。2-巯基乙醇可对眼睛和皮肤造成不可逆转的损害。
2. 用于免疫组织化学/荧光染色的类器官的固定和包埋
   1. 如上所述收集并离心类器官（步骤3.2.1）。
   2. 除去SN，加入1mL 4%多聚甲醛（PFA），并在室温（RT）下在轨道振荡器（100rpm）上孵育30分钟。
      注意:PFA是一种已知的人类致癌物质，可对角膜造成不可逆转的损害。所有工作都必须在化学通风橱中完成。必须始终佩戴丁腈手套和安全眼镜。
   3. 以200× g 离心5分钟，除去SN。加入1mLPBS，在轨道振荡器（100rpm）上在室温下孵育10分钟，并在4°C下以90× g 离心3分钟。 重复洗涤步骤两次。储存在4°C的PBS中。
   4. 对于组织处理和脱水，除去SN并使用预热加宽的p200尖端（通过切割一小块尖端制成）向类器官沉淀物中加入150μL2%琼脂糖凝胶（在PBS中）。立即将整个体积向上移液，然后弹出到微量离心管的盖子中。
      注意:迅速工作很重要，因为含有类器官的凝胶会迅速凝固。
   5. 让凝胶牢固固化30分钟，并将凝胶盘移动到组织学盒中。浸入并储存在50%EtOH中，直到在组织处理器中脱水。
   6. 对于石蜡包埋，将凝胶盘（使用镊子）放入包埋模具中，并用温石蜡（60°C）填充。将模具置于4°C，直到石蜡变固（约45分钟）。这些样品可以储存在4°C或可以立即切片。
   7. 对含有5μm厚度的类器官的石蜡块进行切片机，并将样品收集在载玻片上。在每个切片下方加入一滴去离子水，以允许适当的拉伸切片，并将载玻片放在37°C的平板上过夜。将切片储存在4°C或直接进行免疫组织化学或免疫荧光染色的载玻片。

在AL分离和解离后，将获得的单细胞接种在ECM中并在PitOM中生长（图1，表1）。 图3A 显示了接种时的细胞培养和密度（第0天）。可能存在一些小碎片（图3A，白色箭头），但在传代时会消失。播种后十四天，AL衍生的类器官完全发育（图3A）。类器官表现出囊性形态，具有包围管腔的上皮层。在这个阶段，类器官的直径达到500μm，必须通过。 图3B 显示了解离的类器官片段重新接种后在指示时间传代后的AL衍生类器官培养物。

偶尔，类器官培养物中可能出现一个或多个致密结构（图3A，不利）。当传代时，致密的类器官往往会接管，最终在几次传代后进入只有致密结构的培养物中（图3B，不利）。因此，建议不要继续使用含有致密类器官的孔（通道0）。或者，致密的类器官可以通过沉降丢弃，这使得囊性类器官继续存在。这些致密类器官的起源目前尚不清楚，但它们显示出不太明显的垂体性质18。如果类器官在传代后不能或再生效率较低，则需要优化解离程序。特别是，必须注意不要过于苛刻地分离;类器官必须分裂成碎片，而不是单个细胞（图3B，第0天，插图）。

免疫荧光染色分析证实了AL衍生类器官的上皮特征，因为它们表达上皮标志物E-钙粘蛋白（E-Cad）和细胞角蛋白8/18（CK8/18; 图3C），此外，其已被描述为垂体中的干细胞标志物18。SOX2和TROP2表达还证明了类器官的干细胞性质，两者也被鉴定为垂体干细胞标志物（图3C）14，18。LHX3是一种在（早期发育中）垂体中特异性表达的转录因子，可验证类器官的垂体表型（图3C）。一些构成类器官的细胞处于增殖状态，表达增殖标记物Ki67（图3C）。

使用逆转录定量PCR（RT-qPCR）进一步探索和验证AL衍生类器官的垂体（干性）表型。干性标记 Sox2，Cdh1 （编码E-Cad）， Krt8，Krt18 和 Trop2 的高表达存在于类器官中，明显高于原代AL，表明类器官富集干细胞，因此代表AL干细胞区室，如前所述（图3D）18。值得注意的是，发育转录因子 Pitx1 和 Pitx2 在AL中的几种激素细胞类型中发育后仍然表达，因此它们在AL中的表达也很高。培养物稳健地保留了其茎性表型，正如这些标记物在多次传代后的持续（高）表达所证明的那样（图3D）。

图1:健康和患病垂体类器官的建立，维持，表征和应用潜力的概述。 AL，前叶;IL，中间叶;PL，后叶;MZ，边际区;PitOM，垂体类器官培养基（用 BioRender.com 制成）。AL中的干细胞位以紫色表示。 请点击此处查看此图的大图。

图2:从成年安乐死小鼠中分离垂体。 在（A）斩首，（B）去除头皮（鼻梁被包围），（C）颅骨开口和（D）去除大脑，暴露垂体（包围）之后连续拍摄的代表性图像。箭头指向 PL，PL 被丢弃（与相关的 IL 一起），使 AL 进行隔离和解离。 请点击此处查看此图的大图。

图3:AL衍生类器官的建立和验证（A）在指定天数（传代0）PitOM中的AL细胞接种和类器官发育。顶行显示有利的类器官生长，仅发育囊性结构。底部行显示不利的增长，并出现一个大的密集结构（盒装）。白色箭头表示碎片，黑色箭头表示单个细胞（在插图中放大）。（B）在传代（第0天）播种的类器官碎片（在插入中放大）和7天后观察到的类器官再生。顶行显示有利的类器官再生，只有囊性结构生长。最下面的一行显示不利的再生，密集的类器官接管了培养物。（C）AL衍生类器官中E-Cad，SOX2，TROP2（全红色），CK8/18，LHX3和Ki67（全绿色）的免疫荧光染色。细胞核用Hoechst33342（蓝色）标记。箭头表示 Ki67+ 单元格。指示比例尺。（D）通过RT-qPCR（平均±SEM）测定原代AL和AL衍生类器官中茎性标记物（Sox2，Cdh1，Krt8，Krt18，Trop2）和发育转录因子（Pitx1，Pitx2）的基因表达分析（第0代表示细胞接种后14天）。 数据点代表生物重复。显示Δ周期阈值（dCT）值，使用公式计算:CT（目的基因）- CT（管家基因Actb）。dCT值越积极（在零X轴下方的Y轴上显示），目的基因的表达水平越低。dCT值越低（或更负），表达水平14，18，21，22越高。请点击此处查看此图的大图。

表 1.PitOM的组成。 PitOM通过0.22μm网状过滤器过滤，并在4°C下储存最多2周。

表 2.介质 A、B 和 C 的组成。 所有培养基均通过0.22μm网状过滤器过滤，并在4°C下储存最多4个月。培养基A和C的pH值必须调节到7.3。

表 3.冷冻保存培养基的组成。

作者声明没有相互竞争的经济利益。