双重染色法检测植物-真菌互作中的果胶

摘要

本方案描述了一种在咖啡-真菌互作中检测果胶的显微方法。

摘要

植物细胞利用不同的结构机制（组成型或诱导型）来抵御真菌侵染。其中，包裹作用是一种高效的诱导型机制，可将真菌吸器与植物细胞原生质体隔离。相反，在坏死性互作中，细胞壁的多聚组分之一——果胶，会成为多种果胶降解酶的作用靶标。本文介绍了一种通过光学显微镜检测果胶和真菌菌丝的实验方案。研究对象包括咖啡锈菌Hemileia vastatrix侵染后咖啡叶片细胞中富含果胶的包裹结构，以及由Cercospora coffeicola诱导的叶肉细胞壁的改变。将病害叶片样品用卡诺夫斯基（Karnovsky）固定液固定，脱水后包埋于乙二醇甲基丙烯酸酯中，包埋时间为2–4天。所有步骤均通过抽真空去除细胞间隙中的空气，以提高包埋效果。将包埋块切成5–7 µm厚的切片，置于载玻片的水滴上展平，随后在40 °C下加热30分钟。接着，使用乳酚棉蓝（5%棉蓝溶于乳酚）和水溶性钌红（0.05%）对切片进行双重染色，前者用于检测真菌，后者用于检测果胶（果胶中聚半乳糖醛酸的酸性基团）。结果显示，Hemileia vastatrix的真菌吸器被果胶物质所包裹。在咖啡尾孢菌病中，叶肉细胞出现细胞壁溶解现象，并观察到细胞间隙中的菌丝和分生孢子梗。本文所描述的方法可有效检测植物与真菌互作过程中与果胶相关的防御反应。

引言

植物细胞壁防御机制对于抑制真菌侵染至关重要。自20世纪90年代以来，已有研究报道了细胞壁厚度和组成在真菌侵染过程中的变化。^th 世纪^1,2这些变化可由真菌病原体诱导，从而刺激乳突状结构（papilla）的形成，以阻止真菌侵入细胞，或用于包裹菌丝，将宿主细胞原生质体与真菌吸器隔离。动态细胞壁屏障（即乳突和完全包裹的吸器）的形成对于促进植物抗性具有重要意义³组织病理学研究已探讨了与真菌相关疾病中的这些机制，并描述了细胞壁多聚物（如纤维素、半纤维素（阿拉伯木聚糖）和胼胝质）作为抵御真菌侵染的抗性机制。^4,5,6,7.

细胞壁是抵御微生物侵袭的第一道屏障，能够阻碍植物与真菌之间的相互作用。果胶类多糖构成细胞壁，在双子叶植物初生细胞的细胞壁成分中约占30%，其中同型半乳糖醛酸聚糖是最丰富的聚合物（约60%）⁸。高尔基体分泌复杂的果胶化合物，这些化合物包含半乳糖醛酸链，其可能被甲基化，也可能未被甲基化^8,9。自2012年以来，文献指出果胶甲基酯化程度对于决定微生物果胶酶在侵染过程中的相容性至关重要^10,11,12。因此，需要建立相关实验方案以检测果胶类化合物在植物-真菌病害系统中的存在及其分布情况。

已有多种技术用于检测乳头状结构或吸器的包裹情况。目前采用的参考方法包括固定组织的透射电子显微镜（TEM）以及活体和固定组织的光学显微镜观察。关于透射电镜，多项研究已证实细胞壁附加物在真菌抗性中的结构作用^13,14,15,16，且使用凝集素和抗体是定位碳水化合物聚合物的一种复杂方法¹⁶。然而，研究表明光学显微镜是一种重要的研究手段，组织化学和免疫组织化学工具能够帮助更深入地理解乳头状结构及吸器包裹物的组成^6,7。

致病性真菌主要有两种生活方式：活体营养型和死体营养型。活体营养型真菌依赖宿主活细胞获取营养，而死体营养型真菌则先杀死宿主细胞，再在死亡的组织中生长繁殖¹⁷在拉丁美洲，由真菌引起的咖啡叶锈病 Hemileia vastatrix是咖啡作物中的一种重要病害^18,19. Hemileia vastatrix 表现出专性寄生特性，在抗性咖啡物种或品种中观察到的结构变化包括超敏反应、细胞壁上胼胝质、纤维素和木质素的沉积，以及细胞肥大¹⁴ 已有相关报道。据作者所知，文献中尚未报道果胶在咖啡锈病抗性中的重要性。另一方面，引起尾孢菌病的坏死性真菌会以果胶为靶标 通过 一组与细胞壁降解相关的酶，如果胶酶和多聚半乳糖醛酸酶²⁰咖啡尾孢菌病，由真菌引起 Cercospora coffeicola 也是咖啡作物的主要威胁之一^21,22该真菌在叶片和果实上均引起坏死性病斑。侵入后， C. coffeicola 通过细胞内和细胞间途径定殖植物组织^23,24,25.

本实验方案旨在检测细胞壁中真菌结构和果胶的存在。该方法可用于鉴定植物在与真菌形成活体营养相互作用时，由寄主诱导产生的与果胶相关的反应（使用钌红染料对果胶的多聚半乳糖醛酸中的酸性基团进行特异性染色）。同时，该方案也有助于验证死体营养型真菌对果胶质细胞壁的降解作用。本研究结果表明，双重染色法能够有效区分真菌的结构及其生殖阶段。

方案

1. 缓冲溶液和试剂的准备

1. 通过将4.28 g二甲胂酸钠加入100 mL蒸馏水中，再用0.2 N HCl调节pH至7.25，制备2 M二甲胂酸缓冲液。
2. 通过混合以下成分制备100 mL卡诺夫斯基固定液：10 mL 25%水溶液戊二醛、10 mL 10%水溶液甲醛、25 mL 2 M二甲胂酸缓冲液和0.5 mL 0.5 M CaCl₂²⁶，再用蒸馏水定容至100 mL。
   注意：该溶液可在冰箱中保存6个月。
   警告：二甲胂酸缓冲液具有毒性，因此应在通风橱或开放区域操作固定液；避免吸入其蒸气，操作时应佩戴手套。
3. 通过混合以下成分制备水相霍格兰营养液：3 mM Ca(NO₃)₂·4H₂O、2 mM NH₄H₂PO₄、5 mM KH₂PO₄、2 mM MgSO₄·7H₂O、9.07 mM MnSO₄、0.765 mM ZnSO₄·7H₂O、46.4 mM H₃BO₃、0.09 mM Na₂MoO₄·H₂O、0.01 mM CuSO₄，以及36 mM FeSO₄·7H₂O（以乙二胺四乙酸铁络合物形式）²⁷。

2. 植物样品与真菌接种

注意：对于受咖啡锈病影响的叶片实验，在巴西圣保罗州皮拉西卡巴市圣保罗大学核能农业研究中心（CENA）的温室中培育并保存了五株两个月大的阿拉比卡咖啡（Coffee arabica）卡图艾品种幼苗。

1. 在生长室中，将咖啡植株种植于装有约5.5 pH的Hoagland水培营养液的500 mL塑料盆中，培养4个月。生长室温度维持在27 ± 3 °C，采用LED灯提供光周期，光照时长为12小时，光子通量为250 µmol photons s^-1 m^-2。在4个月内每周更换一次Hoagland营养液。
2. 选取5株植株上各4片展开的叶片，将其远轴面按照文献²⁸所述方法接种1 × 10³ H. vastatrix夏孢子。接种后，用黑色塑料袋覆盖植株，置于黑暗环境中培养48小时。接种后30天采集病斑组织。
3. 从位于巴西圣保罗州坎皮纳斯市圣保罗州生物研究所（地理坐标：-22.906506126269942, -47.015075902025266）的阿拉比卡咖啡品种Obatã（Coffea arabica cv. Obatã）植株上采集由Cercospora coffeicola引起的典型病斑。在处理样品前，先在体视显微镜下观察病斑，确认是否存在咖啡C. coffeicola的分生孢子。随后制备部分载玻片以观察分生孢子，进一步验证病害病因²²。

3. 样品收获、固定与脱水

1. 使用解剖刀和镊子，从病斑中部区域（黄斑；图1）采集约 10 mm² 的叶片样品，并将其浸入 30 mL 卡诺夫斯基固定液中（图1 和 图2A）。固定步骤可在冰箱中进行 48 小时。
2. 使用油泵对叶片样品进行至少四次低真空处理（500–600 mBar），每次 15 分钟，以增强固定液在叶片组织中的渗透性。此步骤需同时旋转样品（图1）。
3. 固定完成后，将叶片样品用蒸馏水稀释的 0.5 M 卡考基缓冲液（pH 7.2）洗涤三次，每次 5 分钟，随后将其转移至梯度乙醇系列（30%、50%、70%、90%（2 次）、100%（2 次））中，每种乙醇浓度处理 15 分钟（图1 和 图2B）。

4. 硬树脂包埋步骤

1. 按照制造商的说明，分三步逐步将样品转移至甲基丙烯酸乙二醇酯（GMA）中。首先，在磁力搅拌下将GMA粉末（1 g）与100 mL基础树脂（组织树脂试剂盒；材料表）混合，配制溶液A，然后按以下步骤操作。
   1. 将样品浸入1:2的溶液A与100%乙醇的混合液中，持续3小时。
   2. 将样品浸入1:1的溶液A与100%乙醇的混合液中，持续3小时。
   3. 将样品浸入纯基础树脂中，持续2至4天。在此步骤中，每天至少四次将样品置于低真空条件下15分钟，随后进行旋转处理。

5. 聚合反应

注意：聚合过程需要1.2 mL塑料模具、基础树脂和固化剂（详见材料表中商业试剂盒的详细信息）。

1. 在烧杯中将15 mL溶液A（步骤4.1）与1 mL固化剂混合，旋转搅拌2分钟，制备聚合溶液（溶液B）。
2. 取1.2 mL聚合溶液（溶液B）加入塑料模具中。使用木签将病变叶片样品从纯基础树脂转移至溶液B中（图2C）。避免使用镊子，以免造成组织压损。
3. 确保在溶液B于5分钟内迅速变粘稠前，快速将叶片样品垂直定向放置于塑料模具中。单个模具中可放置多个病变叶片样品。
   注意：在处理大量样品前，建议先多次练习上述步骤。当样品数量较多时，不同模具间的聚合时间可能存在差异，叶片样品的垂直定向可能难以实现。
4. 当叶片样品达到垂直定向后，静置30分钟，然后将塑料模具转移至含有硅胶的塑料或玻璃容器中，以防止潮湿。继续静置2–3小时完成聚合。
5. 经过2–3小时后，当树脂与叶片样品完全聚合，使用砂纸对聚合块底部进行打磨，将其从塑料模具中分离。随后将聚合块粘附于一块木片上（图2D）。

6. 切片

1. 使用配备8 cm钢制刀片的旋转式切片机（图2E），将包埋块切成5 µm厚的切片。将切片置于覆盖有蒸馏水的载玻片上。将载有漂浮切片的载玻片转移至40 °C的加热板上干燥，以促进切片与载玻片的黏附。
2. 干燥后（图2F），用包埋块编号和载玻片序号标记载玻片。

7. 双重染色过程

1. 用 2 mL 5% 乳酸酚棉蓝（由 40% 甘油、20% 苯酚和 20% 乳酸溶于水中制成）覆盖切片，并在 45 °C 的加热板上加热 5 分钟（图 3A）。
2. 将载玻片在盛有蒸馏水的烧杯中清洗三次，以去除多余的染料（图 3B-D）。
3. 用 2 mL 0.01% 水溶性钌红染色 1 分钟（图 3E）。
4. 将载玻片在盛有蒸馏水的烧杯中清洗三次，以去除多余的染料（图 3F,G）。
5. 在切片上滴加一滴蒸馏水，并用 24 mm × 60 mm 的盖玻片覆盖，用于进行光学显微镜分析。

结果

GMA 包埋切片上的棉蓝乳酚染色显示，在活体营养和死体营养真菌互作过程中，咖啡叶肉细胞之间和内部均存在多种真菌结构。

在活体营养型病害系统中，采用双重染色法染色后，Hemileia vastatrix 的菌丝具有细胞壁和致密的原生质体内容物，在海绵组织和栅栏组织中均呈现深蓝色（图4A、B）。吸器母细胞（Hmc）和吸器也表现出明显的深蓝色（图4C）。用钌红复染后，真菌在细胞间隙中的分布清晰可辨（图4D）。深蓝色的Hmc有助于识别侵染区域。在互作过程中，H. vastatrix 的Hmc突破寄主细胞壁，形成吸器颈，其周围可被果胶类物质包围（图4E、F）。然而，富含果胶的包裹结构（粉红色至红色）并不能阻止吸器的形成（

讨论

本研究介绍了一种替代性的双重染色组织化学检测方法，用于分析包裹活体营养型病原系统中吸器的细胞壁果胶组成。本方法的目的还在于证明其在检测死体营养型真菌及其诱导的细胞壁变化方面的有效性。在咖啡锈菌（Hemileia vastatrix）侵染咖啡薄壁组织的过程中，细胞壁中的果胶可包裹吸器及其颈部结构。Silva 等人也曾报道在咖啡与 H. vastatrix 的病害系统中，纤维素和胼胝质也参与了此类包裹作用^14,29。在与植物防御机制相关的细胞壁多糖中，果胶在植物-病原物互作系统中具有重要作用^10,11,12。因此，了解果胶的功能具有重要的组织病理学价值。

由Cercospora coffeicola引起的咖啡树尾孢菌病会破坏叶片组织...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Blades DB80 HS	Leica	14035838383	切片
二甲胂酸盐缓冲液	EMS	# 11652	固定
棉蓝乳酚	Metaquímica	70SOLSIG024629	染色
甲醛	EMS	#15712	固定
戊二醛	EMS	#16216	固定
组织树脂试剂盒	Technovit /EMS	#14653	包埋用组织树脂
加热板	Dubesser	SSCD25X30-110V	染色
显微镜	Zeiss	#490040-0030-000	图像采集
切片机（Leica RM 2540）	Leica	149BIO000C1 14050238005	切片
塑料包埋模具托盘	EMS	10176-30	染色
钌红	LABHouse	#006004	染色
显微图像分析软件 Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	图像采集
真空泵	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	固定