该研究详细介绍了FRET定位的方法学，包括标记位点的选择、染料的选用、数据采集以及数据分析。该方法在确定蛋白质体系中的结合位点、构象变化和动态运动方面具有显著效果，若与现有的三维结构信息结合使用，则效果更佳。
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本文内容
摘要
摘要
荧光共振能量转移（FRET）是一种成熟的基于荧光的方法，已成功用于测量生物大分子内部及分子间的距离 体外 以及细胞内分子间的距离。在FRET中，能量转移效率通过荧光强度或荧光寿命的变化来测量，其大小与两个荧光分子或标记基团之间的距离相关。通过距离信息推断分子动力学和构象变化，仅是该方法在生物系统中应用的若干实例之一。在特定条件下，该方法可通过提供有关动力学、柔性以及与结合表面相互作用适应性的信息，补充并增强已有的X射线晶体结构数据。本文描述了如何利用FRET及相关的距离测定技术，通过识别结合位点或确定二聚体亚基的取向，来阐明分子的结构特性。通过合理选择标记位点，并常结合多种标记策略，我们已成功将这些定位作图方法应用于蛋白-DNA复合物以及SecA-SecYEG蛋白转运系统中全局结构特性的测定。在SecA-SecYEG系统中，我们采用FRET定位作图方法鉴定了前体蛋白的结合位点，并确定了结合态信号序列区域的局部构象。本研究概述了开展FRET定位作图研究的步骤，包括合适标记位点的筛选、可选标记物（含非天然氨基酸残基）的讨论、标记实验流程、测量操作方法以及数据解析。
引言
对于蛋白质而言，结合其三维（3-D）结构信息解析其动态变化，有助于更深入地理解生物分子系统的结构与功能关系。X射线晶体学和冷冻电子显微镜等结构生物学方法通常只能捕捉静态结构，且常常需要测定多个结构才能揭示生物分子结合及动态行为的某些方面1。本文介绍一种基于溶液的方法，用于绘制可能具有短暂性、难以通过静态方法捕获的全局结构特征，例如结合位点或结合相互作用。该方法的理想研究体系是那些已通过X射线晶体学、核磁共振（NMR）波谱法或其他结构生物学方法确定了三维结构的系统。在此案例中，我们利用SecA-SecYEG复合物的X射线晶体结构——该复合物是蛋白质通用分泌途径中的关键组分——在前体蛋白跨膜转运之前，通过荧光共振能量转移（Förster resonance energy transfer, FRET）技术定位信号肽结合位点2。通过基因改造手段对生物系统进行操控，并结合已知的三维结构信息，我们得以确定信号序列及成熟区早期区域在插入转运通道前的构象3。
FRET 涉及能量从一个分子（供体）以依赖于距离的方式通过空间无辐射地转移到另一个分子（受体）4,5。该能量转移的效率可通过供体荧光强度的降低或受体荧光强度的增强来监测。能量转....
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方案
1. 标记位点的选择
- 在现有蛋白质结构上确定至少三个潜在的标记位点，以三角定位推定的结合位点。在此案例中，通过基因融合确定了SecA、SecYEG以及与SecA连接的前体蛋白2.
- 选择标记位点时，应位于假定结合位点周围 25–75 Å 范围内，并处于蛋白质相对静态的区域，该距离将决定所使用的特定 FRET 染料对36. 在蛋白质区域中选择彼此相对独立的标记位点，使这些位点构成一个三角形的顶点，而假定的结合位点位于其中心图1A- D).
- 在不含其他半胱氨酸（Cys）残基的蛋白质中，于目标标记位点引入或确定半胱氨酸（Cys）残基，以提高特定位点的标记效率37,38.
- 引入非天然氨基酸，例如用于点击化学标记的对叠氮苯丙氨酸，以实现对同一蛋白质在两个不同位点分别用不同染料进行有效标记39,40.
- 检测半胱氨酸突变体的功能丧失情况。通过适当的活性测定方法验证无半胱氨酸突变体及非....
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结果
本研究旨在确定前体蛋白插入SecYEG通道之前其结合位点在SecA上的位置。为了定位该结合位点，我们在前体蛋白的不同区域与SecA及SecYEG蛋白上的三个不同位置之间进行了FRET实验（图1A-D）。结合所获得的距离数据以及SecA、SecYEG和前体蛋白的三维结构，预测了前体蛋白结合位点的位置。为进行这些测量，未采用三种独立组分（SecA、SecYEG和前体蛋白），而是通过基因改造，在引入Gly-Ser连接肽后，将PhoA信号序列连接至SecA2,3。为了便于染料标记，在PhoA前体蛋白的第2、22、35和45位残基处引入了Cys残基或琥珀突变（图1E）。
结合位点的鉴定与标记
先前已通过类似的FRET定位方法鉴定出信号序列的一个潜在结.......
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讨论
通过使用FRET定位方法，我们确定了信号序列在SecA蛋白上的结合位点。重要的是，该复合物的三维晶体结构的存在极大地促进了我们的研究。这种定位方法的优势在于能够利用已有的结构信息来确定标记位点。该方法不能用于确定三维结构；然而，确定结构元件56、优化已有结构49、确定结合位点位置2,32，或阐明动态运动过程57，均为该方法的可行应用。
在SecYEG-SecA-PhoA复合物中，三个标记位点围绕假定的结合位点形成一个三角形（图1）。利用该三角形顶点至同一残基的多个距离测量值，可像全球定位系统（GPS）导航方法一样，精确定位信息。在SecA和SecY上确定了三个位点：SecA37、SecA341和SecY292；同时在前体蛋白的信号序列及成熟区早期确定了四个位点：Ph.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助项目R15GM135904（授予IM）和美国国立卫生研究院资助项目GM110552（授予DBO）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 490 nm LED 激光器 | Horiba | 1684-LED | |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne | Life Technologies | A20347 | |
| 琼脂 | Difco | DF0812 | |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne | Life Technologies | A10254 | |
| Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10904 | |
| Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10906 | |
| Amicon Ultra4 离心滤膜（50 kDa 截留分子量） | Sigma | UFC805008 | |
| 十二烷基麦芽糖苷（DDM） | Anatrace | D310 | |
| E. coli 碱性磷酸酶信号肽 SP22 | Biomolecules Midwest | N/A | 定制合成产品 |
| 延长型信号肽 SP41 | Biomolecules Midwest | N/A | 定制合成产品 |
| FluorEssence | Horiba | 版本 2.4 | Fluoromax4 荧光光谱仪的光谱采集程序 |
| Fluoromax 4 荧光光谱仪 | Horiba | N/A | |
| GlobalsWE | 加州大学欧文分校荧光动力学实验室 | 用于时间分辨衰减分析的光谱分析程序 | |
| H4叠氮苯丙氨酸（AzidoPheOH） | BACHEM | 4020250.0001 | |
| LB（Miller）肉汤 | Fisher Scientific | BP9723 | |
| Ludox HS-40 胶体二氧化硅（水中 40 wt.% 悬浮液） | Sigma-Aldrich | 420816 | 需稀释以制备合适的散射溶液 |
| PTI Felix GX | Horiba | 版本 4.1.0.4096 | PTI Time Master 仪器的光谱采集程序 |
| PTI Time Master 仪器 | Horiba | NA | |
| Pymol 分子图形程序 | Schrodinger | 版本 2.4 | |
| 水浴锅 | Thermo Scientific | NESLAB RTE 10 |
参考文献
- Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
- Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Cons....
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