需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

荧光共振能量转移定位：一种阐明全局结构特征的新方法

1.9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63433

⸱

2022年3月16日

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

本文内容

摘要

该研究详细介绍了FRET定位的方法学，包括标记位点的选择、染料的选用、数据采集以及数据分析。该方法在确定蛋白质体系中的结合位点、构象变化和动态运动方面具有显著效果，若与现有的三维结构信息结合使用，则效果更佳。

摘要

荧光共振能量转移（FRET）是一种成熟的基于荧光的方法，已成功用于测量生物大分子内部及分子间的距离 体外 以及细胞内分子间的距离。在FRET中，能量转移效率通过荧光强度或荧光寿命的变化来测量，其大小与两个荧光分子或标记基团之间的距离相关。通过距离信息推断分子动力学和构象变化，仅是该方法在生物系统中应用的若干实例之一。在特定条件下，该方法可通过提供有关动力学、柔性以及与结合表面相互作用适应性的信息，补充并增强已有的X射线晶体结构数据。本文描述了如何利用FRET及相关的距离测定技术，通过识别结合位点或确定二聚体亚基的取向，来阐明分子的结构特性。通过合理选择标记位点，并常结合多种标记策略，我们已成功将这些定位作图方法应用于蛋白-DNA复合物以及SecA-SecYEG蛋白转运系统中全局结构特性的测定。在SecA-SecYEG系统中，我们采用FRET定位作图方法鉴定了前体蛋白的结合位点，并确定了结合态信号序列区域的局部构象。本研究概述了开展FRET定位作图研究的步骤，包括合适标记位点的筛选、可选标记物（含非天然氨基酸残基）的讨论、标记实验流程、测量操作方法以及数据解析。

引言

对于蛋白质而言，结合其三维（3-D）结构信息解析其动态变化，有助于更深入地理解生物分子系统的结构与功能关系。X射线晶体学和冷冻电子显微镜等结构生物学方法通常只能捕捉静态结构，且常常需要测定多个结构才能揭示生物分子结合及动态行为的某些方面1。本文介绍一种基于溶液的方法，用于绘制可能具有短暂性、难以通过静态方法捕获的全局结构特征，例如结合位点或结合相互作用。该方法的理想研究体系是那些已通过X射线晶体学、核磁共振（NMR）波谱法或其他结构生物学方法确定了三维结构的系统。在此案例中，我们利用SecA-SecYEG复合物的X射线晶体结构——该复合物是蛋白质通用分泌途径中的关键组分——在前体蛋白跨膜转运之前，通过荧光共振能量转移（Förster resonance energy transfer, FRET）技术定位信号肽结合位点2。通过基因改造手段对生物系统进行操控，并结合已知的三维结构信息，我们得以确定信号序列及成熟区早期区域在插入转运通道前的构象3。

FRET 涉及能量从一个分子（供体）以依赖于距离的方式通过空间无辐射地转移到另一个分子（受体）4,5。该能量转移的效率可通过供体荧光强度的降低或受体荧光强度的增强来监测。能量转移效率可描述为

E = R06/(R06 + R6)

其中 R0 值是指能量转移效率为 50% 时的距离6。该技术此前被称为分子尺，可有效测定 2.5–12 nm 范围内的距离，具体取决于供体-受体荧光染料的种类4,7,8,9。通过检测有或无受体时供体荧光的强度和寿命，可确定能量转移效率，进而推算出分子间距离5,8。由于该技术具有可及性高、方法灵敏且操作简便等优势，FRET 已广泛应用于单分子荧光光谱学和共聚焦显微镜等领域6。荧光蛋白（如绿色荧光蛋白）的出现，使得细胞内动态过程的观测和活细胞成像变得相对容易10,11。许多此类 FRET 应用在本期虚拟专题中均有详细讨论。

本研究特别关注利用FRET测量获得距离值，以确定结构细节。此前，FRET测量已成功用于确定DNA分子与蛋白质结合时的构象12,13,14、蛋白质内部动力学以及蛋白质结合相互作用15,16,17。该方法的优势在于能够利用相对少量的样品，在溶液中测定柔性及动态的结构元件。需要特别指出的是，该方法在与已有结构信息结合使用时尤为有效，但不能单独用于三维结构的测定。若研究基于已有的结构信息，并常与计算模拟相结合，则该方法可提供最佳的结构洞察与精修效果18,19。本文描述了如何利用稳态和时间分辨FRET测量获得的距离，来定位SecA-SecYEG复合物晶体结构上一个未知的结合位点；SecA-SecYEG复合物是通用分泌途径中的主要蛋白质3。

一般分泌途径是一种从原核生物到真核生物乃至古菌中都高度保守的系统，介导蛋白质穿过或插入膜结构，将其运输至细胞内的功能位点。对于革兰氏阴性细菌（例如本研究所用的 E. coli），蛋白质被插入或转运穿过内膜进入周质空间。细菌的 SecY 通道复合物（称为转位子）与其他蛋白质协同作用，通过通常位于新生肽链 N 末端的信号序列，将新合成的蛋白质定向转运至细胞内的正确位置20,21。对于靶向周质的蛋白质，ATP 酶 SecA 蛋白在约 100 个氨基酸残基被翻译后，与核糖体的出口通道以及前体蛋白结合22。SecA 与 SecB 分子伴侣蛋白共同作用，使前体蛋白保持未折叠状态。SecA 与 SecYEG 转位子结合，并通过多次 ATP 水解循环，促进蛋白质跨膜转运23,24。

SecA 是一种多结构域蛋白，以胞质可溶形式和膜结合形式存在。在胞质中，SecA 为同源二聚体蛋白，包含前体蛋白结合或交联结构域25、两个核苷酸结合结构域、一个螺旋翼结构域、一个螺旋支架结构域以及双螺旋指（THF）结构域26,27,28,29（图1）。在先前对 SecA-SecYEG 复合物的晶体学研究中，THF 的位置提示其积极参与蛋白质转运过程，后续与信号肽的交联实验进一步证实了该区域在蛋白质转运中的重要作用30,31。以往研究利用 FRET 定位方法表明，外源性信号肽可结合于 SecA 的这一区域2,32。为了全面理解前体蛋白的信号序列及早期成熟区在插入 SecYEG 通道前的构象与定位，研究人员构建了一种蛋白嵌合体，将信号序列及早期成熟区残基通过 Ser-Gly 连接子与 SecA 相连（图1）。利用这一具有生物学活性的构建体，进一步证实前体蛋白的信号序列和早期成熟区以平行方式结合于 THF 结构域2。随后，采用 FRET 定位方法进一步解析了在 SecYEG 存在条件下信号序列与早期成熟区的构象与位置，如下所述3。

SecA-SecYEG复合物的三维结构33,34,35及其可能的结合位点位置的已知信息，使我们能够合理地将供体-受体标记置于特定位置，使得各个FRET距离的交汇点可识别出结合位点的位置。这些FRET定位测量结果表明，前体蛋白的信号序列及其成熟区的起始部分形成一个发夹结构，其顶端位于SecYEG通道的入口处，证明该发夹结构在进入通道之前即已形成模板。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 标记位点的选择

  1. 在现有蛋白质结构上确定至少三个潜在的标记位点，以三角定位推定的结合位点。在此案例中，通过基因融合确定了SecA、SecYEG以及与SecA连接的前体蛋白2.
    1. 选择标记位点时，应位于假定结合位点周围 25–75 Å 范围内，并处于蛋白质相对静态的区域，该距离将决定所使用的特定 FRET 染料对36. 在蛋白质区域中选择彼此相对独立的标记位点，使这些位点构成一个三角形的顶点，而假定的结合位点位于其中心图1A- D).
    2. 在不含其他半胱氨酸（Cys）残基的蛋白质中，于目标标记位点引入或确定半胱氨酸（Cys）残基，以提高特定位点的标记效率37,38.
    3. 引入非天然氨基酸，例如用于点击化学标记的对叠氮苯丙氨酸，以实现对同一蛋白质在两个不同位点分别用不同染料进行有效标记39,40.
    4. 检测半胱氨酸突变体的功能丧失情况。通过适当的活性测定方法验证无半胱氨酸突变体及非天然氨基酸突变体的活性。在此实验中，活性验证通过生长实验进行，随后进行 体外 孔雀石绿ATP酶活性测定32,41,42

2. 蛋白质标记

  1. 将目标蛋白纯化至至少95%的纯度，以确保准确标记。按照参考文献中详述的方案纯化 SecA 和 SecYEG 蛋白3确保至少拥有 5 μg 此步骤需准备过量的纯化蛋白，因为在标记过程中会损失部分蛋白。
  2. 根据两种染料的 R 值选择用于 FRET 测量的染料0 值以及标记位点间的预测距离。估算 R0 数值，并利用荧光蛋白数据库中的信息观察供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠情况，该数据库也提供常用染料的光谱数据（https://www.fpbase.org/spectra/）36.
    注意：R0 定义为在特定染料对中能量转移效率达到50%时的距离。在作图实验中，预测距离应接近R₀0 染料对的数值，以确保能够准确测量距离。
  3. 用供体-受体染料对标记步骤 1.1.1 中确定的位置。
    1. 根据制造商的说明书对蛋白质进行标记，特别注意针对所用特定染料的最优蛋白质浓度、温度、pH值、反应时间及缓冲液等参数43,44.
    2. 将蛋白配制为浓度 1-2 mg/mL 或约 10 μM 在 25 mM Tris-HCl (pH 7.5)、25 mM KCl、1 mM EDTA (TKE) 缓冲液中。将染料溶于二甲基甲酰胺 (DMF) 或二甲基亚砜 (DMSO) 中，使其终浓度为 1 mM。在搅拌条件下逐滴加入染料溶液，使染料与蛋白质的摩尔比达到 5:1。50 μM 染料： 10 μM 蛋白）
    3. 在室温（RT）下于玻璃小瓶中轻轻摇动反应4小时，或过夜进行反应 4 °C加入 β-巯基乙醇以终止反应。
      注意：如果蛋白质与Tris缓冲液不兼容，可使用磷酸盐或HEPES缓冲液，保持pH在7.0–7.5范围内。若蛋白质含有二硫键，应在标记前加入DTT或TCEP等还原剂。在添加染料前，需通过透析或凝胶过滤去除DTT。
  4. 为获得准确的FRET测量结果，使用具有适当分子量截留值（MWCO）的离心浓缩器去除游离染料，使游离染料透过滤膜，而标记蛋白被保留在浓缩器中。
    1. 通过在3 mL浓缩器的上部加入约1 mL水，然后将水离心穿过膜（在4,300 x g下至少离心10分钟），对浓缩器膜进行预处理。 g).
    2. 通过在浓缩器中离心标记样品（4,300 x g 条件下离心 20 分钟）去除游离染料 g）。重复 3-4 次，并弃去穿流液。
    3. 使用紫外-可见吸收光谱法检测标记蛋白的标记效率。
      注意：FRET 测量要求标记效率达到 50% 或更高。标记效率较低会减弱 FRET 信号，并可能导致测量结果不准确。
    4. 在250-700 nm波长范围内获取标记蛋白的紫外-可见吸收光谱，以同时观察蛋白吸收峰和染料最大吸收峰。测定染料吸收峰处及280 nm处的吸光度。
    5. 使用校正因子 CF 及以下公式确定蛋白质浓度，并校正染料所产生的任何干扰贡献45,46:
      蛋白质浓度计算公式，C = (A280 − (Amax × CF)) / εProtein，适用于光谱分析。
      其中 C 为蛋白质的浓度（M），A280 在280 nm处的样品吸光度，A最大 是在染料吸收最大值处的吸光度，ε 蛋白 是蛋白质在 280 nm 处的消光系数，CF 是校正因子， A'280/A'最大值，其中 A'280 在280 nm处的吸光度 A'最大 仅为染料在峰最大值处的吸光度。
    6. 使用以下公式确定标记效率：
      静态平衡；E=Amax/(εdye*C)；吸收光谱公式；用于教学的示意图
      其中 ε染料 ε 是染料的摩尔消光系数，C 是步骤 2.4.5 中测定的蛋白质浓度，E 是标记效率。重复步骤 2.4.2，直至标记效率值达到平台期且低于 100%。

3. 确定 R 0 值

  1. 测量 R0 值 原位. 准备两份总蛋白浓度相同的蛋白质样品， 4 μM，一个仅用供体染料标记的蛋白质样品，另一个仅用受体染料标记的蛋白质样品。对于SecA蛋白，蛋白质浓度为 4 μM SecA 单体适用于这些测量。
    1. 为1 cm × 1 cm比色皿准备2.5 mL的样品体积， 600 μL 适用于5 mm × 5 mm比色皿 200 μL 用于3 mm × 3 mm比色皿。
  2. 打开荧光仪，并在使用荧光分光光度计时启动荧光软件中的光谱采集与分析程序。点击红色 M 连接计算机与仪器（图2A）并选择 发射光谱.
    1. 输入扫描参数，例如激发波长、发射扫描范围、温度和样品更换器位置，使用 收集实验 菜单项 (图2B).
    2. 点击 RTC 并通过在染料吸收最大值处设置激发波长，监测峰值处的荧光发射来优化仪器参数（例如，光谱狭缝）。对于 SecA，设置以下参数：带通为 1 nm；激发狭缝和发射狭缝分别为 1 mm 和 1.5 mm，温度设为 25 °C 搅拌速度为250 rpm。
      注意：不要超过仪器的每秒计数（cps）容量（通常为 2 x 106 cps
  3. 将标记的供体蛋白样品放入样品 holder 中，然后单击 运行 通过在染料吸收峰波长处（例如，AF488为488 nm）激发样品，并在供体染料标记的SecA蛋白（仅含供体染料AF488）的发射峰范围（505–750 nm）内进行扫描，获得仅标记供体染料的蛋白质的发射光谱。
  4. 通过将扫描范围延伸至峰尾后25-50 nm处，建立扫描基线。通过在不同浓度样品上进行吸收和荧光测量，测定仅含供体蛋白的量子产率，具体操作如所述47保持这些测量的狭缝设置不变。
    1. 以游离的供体染料作为量子产率的参照。为获得准确测定结果，需至少获取四种不同浓度下的供体蛋白和游离染料的测量数据。
    2. 绘制供体蛋白单独存在时的荧光强度或积分面积相对于吸光度的曲线，以及游离染料或参比物质的相应曲线。确定供体蛋白单独存在时的斜率（斜率D）和参考（斜率R).
    3. 量子产率（Φ) 的计算公式如下：
      荧光量子产率方程，用于光子分析的含斜率和黏度参数的示意图
      此处 ΦD 仅为供体蛋白的量子产率， ΦR 是游离染料的量子产率（通常可从生产商处获得）， 斜率D 和 斜率R 分别为步骤 3.4.2 中确定的供体蛋白和参比的斜率，且 ηD 和 ηR 分别表示仅含供体蛋白和无参考染料溶液的折射率 47.
  5. 使用1 cm光程长度的比色皿，获取仅含受体蛋白的吸收光谱。通过将吸收光谱除以染料浓度，生成受体蛋白的摩尔消光系数光谱。
  6. 生成光谱重叠积分， J (λ) 使用图形分析程序。此过程也可使用标准工作表程序（例如，电子表格）完成。
    1. 将仅含供体蛋白的荧光发射光谱（步骤 3.4）乘以仅含受体蛋白的消光系数光谱，以生成重叠光谱。
    2. 将所得的重叠光谱乘以 λ4.
    3. 通过积分重叠区域来确定曲线下面积。重叠区域定义为供体发射光谱与受体消光系数光谱相乘后产生正值的区域。光谱重叠积分定义为：
      J(λ) = ∫₀^∞ F_D(λ)ε_A(λ)λ⁴dλ；方程，辐射传递，光谱吸收分析。
      其中 FD (λ) 是仅含供体蛋白的发射光谱（在步骤 3.4 中获得）以及 εA(λ) 是受体蛋白单独存在时的消光系数光谱，单位为 M-1cm-1 （在步骤 3.5 中获得）。所得光谱重叠积分的单位应为 M-1厘米-1纳米（nm）4.
    4. 对光谱重叠积分进行归一化。将重叠积分除以同一光谱范围内仅供体蛋白光谱的积分面积：
      荧光共振能量转移，J(λ) 积分公式，光谱重叠分析示意图。
    5. 计算 R0 使用以下公式计算 Å 单位的值：
      Förster 半径 \( R_0 \) 方程；静态平衡常数；在荧光研究中具有重要意义。
      其中 κ2 是取向因子，对于自由旋转的染料通常取值为 2/3， η 是折射率，对于稀释的水溶液可近似为1.33， QD 是供体的量子产率（步骤 3.4），且 J(λ) 是步骤 3.6.3 中确定的光谱重叠积分5. 注意：如果染料未自由旋转，可引入校正，具体方法如 Ivanov 所述 48 由 Auclair 实施49 和 Zhang2,3.

4. 进行FRET光谱测量

  1. 制备相同浓度的仅含供体蛋白、仅含受体蛋白以及供体-受体蛋白样品；浓度为 4 μM 建议使用 200 μL 若使用 3 mm × 3 mm 比色皿，溶液的体积为 600 μL 若使用5 mm × 5 mm比色皿，或使用1 cm × 1 cm比色皿时为2.5 mL。
    1. 使用等摩尔量的仅含供体蛋白和仅含受体蛋白样品制备供体-受体蛋白样品。
    2. 在仅含供体和仅含受体的蛋白质样品中，通过向其中一种样品（仅含供体或仅含受体）加入等摩尔量的未标记蛋白，使对照供体样品中的标记样品量保持一致。例如，对于相同浓度的溶液，每份仅含供体的FRET样品将包含 100 μL 仅供体蛋白 100 μL 未标记蛋白质的 200 μL 体积
  2. 分别采集仅含供体、仅含受体以及供体-受体样品的荧光发射光谱。按照步骤3.2中所述优化信号。优化完成后，所有样品均保持相同的仪器设置。
    1. 按照步骤3.3所述获取仅含供体的扫描结果。在供体染料吸收最大值处激发溶液，并扫描供体和（预期）受体的发射峰。
    2. 更换样本至仅含受体蛋白的溶液，或更改样品更换器位置至装有仅含受体蛋白溶液的比色皿。
    3. 使用与步骤 4.2.1 相同的设置，对仅用受体染料标记的蛋白质（仅受体蛋白质）进行发射扫描。在供体激发波长处激发样品。
      注意：该光谱用于校正受体在供体波长处被激发的量（FA 在步骤 5.1.2 中
    4. 将样品更换为供体-受体标记的蛋白质样品，或调整样品更换器的位置至含有供体-受体标记蛋白质的比色皿。
    5. 使用与步骤 4.2.1 和 4.2.3 相同的设置，获取供体-受体蛋白样品的发射扫描图谱。
    6. 对所有光谱，通过减去扫描结束时测得的背景计数来校正背景荧光。
  3. 测量按照4.1.2步骤制备的仅含供体样品及供体-受体样品的供体荧光寿命。使用具备测量和分辨纳秒（10⁻⁹ s）级荧光衰减能力的时间相关单光子计数荧光仪器。-9 s）时间范围。
    注意：对于FRET染料对，应将激发光源与供体染料的吸收最大值相匹配。
    1. 打开仪器。启动采集软件，使用仪器控制软件通过荧光光谱仪进行数据采集。
    2. 用于采集，选择 TCSPC 衰减，时间范围为55 ns，增益为1，共4096个通道。
    3. 使用非乳制奶油剂溶液或商用散射溶液获取仪器响应函数（IRF），并在 490 nm 处监测散射信号。根据需要调整狭缝宽度并使用中性密度滤光片，以保持足够低的计数率，避免脉冲堆积。5. 点击 接受 然后 开始这将开始数据采集。
      注意：对于 180 kHz 的重复频率，最大计数率为 4000 cps。
    4. 在490 nm处采集仪器响应函数（IRF），直至峰道计数达到最大值20,000。每次测量荧光衰减前后均需采集一次IRF。
    5. 通过在供体发射波长520 nm处监测荧光发射，获取仅含供体以及供体-受体样品的荧光衰减曲线。
    6. 调节狭缝设置，使最大计数率不超过 4000 cps。蛋白质样品的狭缝设置通常为 15–20 nm 带宽。持续采集衰减信号，直至峰道计数达到 20,000。
  4. 分析衰减或荧光强度 (I) 随时间变化 (t) 荧光寿命 (τ). 将衰减拟合为以下方程所示的指数和：
    衰减信号方程：I(t)=Σa_ie^(-t/τ_i)，用于说明多指数衰减分析。
    其中 αI 指前因子 ith 组分和 τI 是寿命。将拟合结果与仪器响应函数（IRF）重新卷积，以匹配荧光衰减曲线。根据减小的 Χ2 参数。

FRET 数据分析

  1. 根据以下公式，通过供体-受体样品相对于仅含供体样品的供体荧光强度降低来计算 FRET 效率。
    荧光共振能量转移效率方程，E=1-(FDA/FD)，公式。
    其中 FDA 表示供体-受体样品的荧光强度，FD 表示在供体荧光峰处仅含供体样品的荧光强度。若数据噪声较大，应使用峰的积分面积。
    1. 校正仅含供体样品与供体-受体样品之间标记效率的差异。根据供体的标记程度按以下公式计算校正值：
      荧光猝灭方程：F'D=FD(fDA/fD)，用于光化学过程分析。
      其中 fDA 表示供体-受体样品中供体的标记效率，fD 表示仅含供体样品中的标记效率。
    2. 通过从供体-受体蛋白光谱中减去仅含受体蛋白的光谱（步骤 4.2），校正受体荧光对供体激发光谱的贡献。
      动态力计算方程：F'DA = FDA - FA。
    3. 校正仅含受体蛋白相对于供体-受体蛋白样品中标记效率的差异，从而得到以下用于计算效率的方程：
      效率的静态平衡方程；公式 E=((1-F'DA/F'D)*1/fA)；物理学概念。
      其中 fA 表示受体标记的比例。该方程包含了由于染料标记和受体荧光所引起的所有校正项。
    4. 使用以下公式根据效率计算 FRET 距离：
      Förster 共振能量转移 (FRET) 效率公式；能量转移计算方程。
      使用步骤 3.6.5 中获得的 R0 值。
    5. 利用步骤 4.3.3–4.3.5 中测得的仅含供体和供体-受体样品的荧光寿命，按以下公式计算 FRET 效率：
      荧光共振能量转移 (FRET) 效率公式；E=1–(τDA/τD)；科学方程。
    6. 使用振幅加权寿命计算 FRET 效率，并与稳态结果进行比较5。
      静态平衡公式，⟨τ⟩=Σaiτi，方程，用于物理或化学分析。
    7. 根据荧光寿命测定的效率，按步骤 5.1.4 的方法计算距离。比较稳态与时间分辨测得的 FRET 效率和距离值，并确认它们在误差范围内一致。

6. 测定距离

  1. 利用计算出的距离，将结合位点映射到三维结构上。使用第5.1.4步中给出的公式以及在第3.6.5步中获得的每对FRET探针对应的R0值，计算所有检测的染料对及位置之间的距离及其误差。
    1. 使用PyMOL50等三维图形可视化程序将距离信息映射到结构上（脚本见补充文件）。可将脚本中的命令直接输入命令窗口，并填入相应的距离信息。
    2. 根据每项测得的距离及其相关误差生成相应的球壳（图3、图4、补充图1-3）。
    3. 通过不同球壳的交集确定位置（补充图1-3）。信号肽结合位点是通过SecA和SecYEG上的三个不同位置以及信号肽上的四个不同位置共同确定的（图1）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本研究旨在确定前体蛋白插入SecYEG通道之前其结合位点在SecA上的位置。为了定位该结合位点，我们在前体蛋白的不同区域与SecA及SecYEG蛋白上的三个不同位置之间进行了FRET实验（图1A-D）。结合所获得的距离数据以及SecA、SecYEG和前体蛋白的三维结构，预测了前体蛋白结合位点的位置。为进行这些测量，未采用三种独立组分（SecA、SecYEG和前体蛋白），而是通过基因改造，在引入Gly-Ser连接肽后，将PhoA信号序列连接至SecA2,3。为了便于染料标记，在PhoA前体蛋白的第2、22、35和45位残基处引入了Cys残基或琥珀突变（图1E）。

结合位点的鉴定与标记
先前已通过类似的FRET定位方法鉴定出信号序列的一个潜在结...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

通过使用FRET定位方法，我们确定了信号序列在SecA蛋白上的结合位点。重要的是，该复合物的三维晶体结构的存在极大地促进了我们的研究。这种定位方法的优势在于能够利用已有的结构信息来确定标记位点。该方法不能用于确定三维结构；然而，确定结构元件56、优化已有结构49、确定结合位点位置2,32，或阐明动态运动过程57，均为该方法的可行应用。

在SecYEG-SecA-PhoA复合物中，三个标记位点围绕假定的结合位点形成一个三角形（图1）。利用该三角形顶点至同一残基的多个距离测量值，可像全球定位系统（GPS）导航方法一样，精确定位信息。在SecA和SecY上确定了三个位点：SecA37、SecA341和SecY292；同时在前体蛋白的信号序列及成熟区早期确定了四个位点：Ph...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院资助项目R15GM135904（授予IM）和美国国立卫生研究院资助项目GM110552（授予DBO）支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
490 nm LED 激光器Horiba1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO AlkyneLife TechnologiesA20347
琼脂DifcoDF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO AlkyneLife TechnologiesA10254
Alexa Fluor 488 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10904
Alexa Fluor 647 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10906
Amicon Ultra­4 离心滤膜（50 kDa 截留分子量）SigmaUFC805008
十二烷基麦芽糖苷（DDM）AnatraceD310
E. coli 碱性磷酸酶信号肽 SP22Biomolecules MidwestN/A定制合成产品
延长型信号肽 SP41Biomolecules MidwestN/A定制合成产品
FluorEssenceHoriba版本 2.4Fluoromax4 荧光光谱仪的光谱采集程序
Fluoromax 4 荧光光谱仪HoribaN/A
GlobalsWE加州大学欧文分校荧光动力学实验室用于时间分辨衰减分析的光谱分析程序
H­4­叠氮苯丙氨酸（Azido­Phe­OH）BACHEM4020250.0001
LB（Miller）肉汤Fisher ScientificBP9723
Ludox HS-40 胶体二氧化硅（水中 40 wt.% 悬浮液）Sigma-Aldrich420816需稀释以制备合适的散射溶液
PTI Felix GXHoriba版本 4.1.0.4096PTI Time Master 仪器的光谱采集程序
PTI Time Master 仪器HoribaNA
Pymol 分子图形程序Schrodinger版本 2.4
水浴锅Thermo ScientificNESLAB RTE 10

参考文献

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488(2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492(2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140(2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433(2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622(2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872(2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

FRET DNA SecA SecYEG
荧光共振能量转移定位：一种阐明全局结构特征的新方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。