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无标记非线性光学技术用于研究中枢髓鞘中微管蛋白依赖性缺陷

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DOI：

10.3791/63449

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2023年3月24日

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1Centro de Investigaciones en Óptica A.C. (CIO), 2Division of Sciences and Engineering, Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, Universidad de Guanajuato, 3Institute of Physiology, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 4Dirección General de Desarrollo Internacional, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过简单且创新的二次谐波产生显微成像方法，在微管蛋白病模型中检测微管负载的少突胶质细胞的实验方案。

摘要

脑内细胞骨架成分的满意可视化具有挑战性。微管、微丝和中间纤维网络普遍分布于所有神经组织中，加之荧光蛋白融合策略的结果存在变异性，以及 将抗体和药物作为发色团载体进行动态研究时，经典光学方法的适用性有限，因此在这些应用中不如研究其他蛋白质时有效。当需要研究微管蛋白时，由于其分子具有非中心对称的结构，二次谐波的无标记生成是一种非常合适的选择。该技术与显微镜结合后，能够定性描述生物样品中微管平行束的三维分布，且额外优势在于可直接用于未经固定和透化的鲜活组织。本文介绍如何利用商用二次谐波生成显微成像系统对微管蛋白进行成像，以突出少突胶质细胞中富含微管蛋白结构内的微管 在一种新近描述的髓鞘疾病——伴有基底节和小脑萎缩的低髓鞘形成（H-ABC）微管蛋白病中。

引言

在组织和器官样本中对细胞骨架结构进行光学成像并非易事。细胞骨架丝结构广泛存在于各类细胞中，因此如果进行通用性染色，例如针对α-微管蛋白、β-肌动蛋白，或在上皮样本中针对角蛋白进行染色，信号很可能在整个样本中分布得较为均匀。为了将染色限制在更具生物学意义的细胞组分子集中，可以采用表达特定标记的转基因小鼠1，或选择使用亚型特异性抗体。尽管目前市场上此类特异性抗体极少（且总体上种类非常有限2,3,4），但可能已有适用的转基因动物模型。然而，实验室需要获取并妥善饲养这些动物，整个过程涉及较高的成本。某些抗体或化学试剂，例如荧光染料偶联的药物（如鬼笔环肽或紫杉醇），可能部分或完全不适用于活细胞或活体组织，从而限制了其仅能用于固定样本的研究。

对于微管蛋白而言，还需考虑另一个因素，即微管聚合物对固定剂的敏感性。已知传统的甲醛化学固定法不足以充分保持微管结构的完整性5。此外，最近一项研究证实，甲醛交联会引起微管超微结构的细微改变，这种变化与某些药物或生理分子（如GTP）结合时所引起的变化类似6。

因此，对未染色、未固定的样品中的微管进行直接可视化观察通常是可取的。为实现这一目标，一种技术手段是二次谐波产生（second harmonic generation, SHG）显微技术7，该技术基于平行排列的微管束可作为谐波生色团，在强脉冲红外激光适当照射下发射频率倍增的光信号。尽管胶原蛋白和肌球蛋白能够产生更强且更稳定的二次谐波信号——这是目前所知除微管外仅有的两种具备频率倍增能力的生物材料——但微管蛋白产生的信号迄今主要用于研究有丝分裂纺锤体的重组过程8,9,10以及轴突内微管的形态结构11,12,13。

在本研究中，我们提出了一种二次谐波生成（SHG）显微技术的新应用，将其作为一种诊断工具，用于区分受微管蛋白β4A（TUBB4A）微管蛋白病影响的中枢神经系统（CNS）组织与其健康组织14。该微管蛋白主要在神经组织中表达，其某些突变（例如导致基底节和小脑低髓鞘化及萎缩的H-ABC相关突变）可引起少突胶质细胞内微管过度填充15,16；细胞骨架的这些改变继而导致脱髓鞘等下游效应，严重损害运动和感觉通路16,17,18,19。本研究采用的taiep小鼠模型在少突胶质细胞中表现出异常的微管含量，并重现了H-ABC患者大多数感觉运动症状17。本实验方案详细说明了如何对胼胝体和小脑等结构进行成像，这些区域通常高度髓鞘化，在H-ABC患者以及taiep大鼠中均受到严重累及19，从而突出显示健康组织与突变组织之间SH信号的差异。

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方案

所有操作程序均符合墨西哥政府《一般卫生法》关于卫生研究的第七章法规（NOM-062-ZOO-1999）所批准的法律和规范，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的建议，且已获得瓜纳华托大学和普埃布拉自治大学研究生物伦理委员会的批准。

1. 显微镜设置

  1. 开启显微镜系统。
  2. 打开脉冲激光器，以确保在样品提取和制备完成后，激光器能够以最佳且稳定的功率水平进行激光输出。
  3. 将激光器调谐至 810 nm。为研究组织微管结构，使用可用激光功率的 10%–20%，在本实验系统中，这相当于在物镜后焦面测得的 13–26 mW。
  4. 使用将用于二次谐波成像的物镜，确保显微镜已进行柯勒照明校准（补充文件 1）。
    注意：这一点非常重要，因为在本研究所用的商用系统中，信号检测是通过聚光镜以透射模式进行的。
  5. 从光学检测光路中移除不必要的滤光片（图 1A）。
  6. 确保聚光镜光圈完全打开，以避免在此层面不必要地阻挡光线。
  7. 准备一个 25×/0.8 数值孔径（NA）的油浸物镜，并在镜头上滴加少量浸油。
    ​注意：选用此物镜是为了最好地匹配数值孔径为 0.55 的聚光镜（理想情况下，NAcond ≥ NAobj）。

2. 显微镜初步检查

注意：除非设置发生更改，否则仅需执行一次初步的显微镜控制。

  1. 将干燥的玉米淀粉夹在玻璃载玻片之间，使用SHG参数成像，以生成揭示激光偏振方向的SHG图像。操作步骤参照补充文件2，但激光功率需低于5%（针对玉米淀粉）。
  2. 获取一幅稀疏分布的玉米淀粉颗粒图像，并标记SHG信号叶瓣在x-y平面上的方向。该方向对应于激光的取向（图2A）。
  3. 作为对照，对同一标本再采集一幅图像，在光路中插入一个半波片（位置见图1A），以改变激光的振荡方向。所得图像显示SHG信号叶瓣发生旋转（图2B、C）。
  4. 若使用不同类型的SHG带通滤光片，需通过比较图像（图2D、E）以及沿线扫描的像素信号强度（图2F）来确认其具有最佳透射性能。

3. 组织提取

注意：进行手术操作时，务必使用洁净的器械。

  1. 使用6至12月龄的 taiep 大鼠和年龄匹配的Sprague-Dawley大鼠 对照组（WT）。
  2. 通过腹腔注射将氯胺酮-赛拉嗪混合物（0.125 mg/kg 和 5 mg/kg）溶于0.9%无菌NaCl溶液中，对动物进行麻醉。
    1. 检查疼痛反射，仅在疼痛反射消失的情况下继续操作。
  3. 处死动物 通过 断头
  4. 头部分离后，沿中线小心打开颅骨穹窿，从顶部最尾端开始向鼻部切开，从眼眶向中线切开，再从最尾端切至脑和小脑下方。
    注意：骨剪和咬骨钳可有效去除头骨，同时不损伤脑部结构。
  5. 将脑和小脑从颅骨中取出。可将两个半球分离。若分离半球，则取其中一半用于二次谐波成像（SHG成像），另一半置于化学通风橱中，用3.7%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）固定20分钟，用于后续切片与染色。

4. 振动切片机切片

  1. 准备一个振动切片机缓冲液托盘，内装温暖的（37 °C）Hank's 平衡盐溶液（HBSS）。
  2. 使用氰基丙烯酸酯胶水将脑组织固定在样本板上 通过 一块遮蔽胶带。最尾侧部分/区域接触胶水，以便能够从相对的头侧部分切出可用的冠状切片。
    1. 等待约10秒，使胶水充分聚合，以实现样品的有效粘附。
      注意：当脑组织定位至刀片切割方向最适当时，可获得最佳结果 "从上到下" 而不是 "左右移动" (图1B).
  3. 将样本板转移至缓冲液托盘内的磁性支架上。
  4. 开始切割300–500 µm厚的切片，直至所获得的切片覆盖整个脑表面。
  5. 此时，将切片厚度减小至160 µm。
  6. 当在胼胝体水平切下完整的160 µm切片后，使用带有较大火焰抛光口的改良玻璃巴斯德移液管回收切片（图1C).
  7. 将其转移至含有新鲜温热HBSS的洁净培养皿中，或直接置于显微镜用玻璃载具上（盖玻片或玻璃底培养皿）。
    ​注意：在所述实验条件下，在样品上方加盖盖玻片会对成像产生不利影响。

5. 转移至显微镜

  1. 如果显微镜位于不同的房间，准备一个带有预热凝胶包的保温箱，用于转移组织切片并维持其温度。该保温箱还可用于在成像前保持切片的温度。
  2. 将样品置于显微镜下，并通过透射光直接观察目镜，确保其物镜下方位置正确。
    注意：目标是将预测的发射结构与激光的振荡方向对齐，以最大化发射（从而被检测到）的二次谐波信号（SHG）。
  3. 去除多余的HBSS，使一层薄液膜覆盖整个样品。每隔几分钟目视检查液膜，避免过度蒸发和样品干燥。
    注意：在所述条件下，切片使用时间不超过20分钟。样品干燥会导致严重的伪影效应（补充图1A）。如果需要更长的成像时间，建议定期将切片浸入温热的新鲜培养基中，而不是直接添加更多HBSS。对于较长时间的实验，建议使用灌流 chamber 以及胶水或低熔点琼脂糖固定组织。
  4. 为非扫描成像准备显微镜载物台，可能包括关闭暗培养室的所有门，或用黑色尼龙聚氨酯涂层织物覆盖培养室。

6. 成像

  1. 选择透射路径中的"非去扫描"成像模式，以优化微弱的微管蛋白SH信号的采集。
  2. 选择LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA物镜。
  3. 将激光功率设置在13 mW至26 mW之间，像素驻留时间为12.6 µs。图像尺寸不超过512像素 × 512像素，扫描速度设为5，平均次数为2，平均采集时间约为15秒。
    注意：使用更高的激光功率和/或更长的驻留时间可能会损伤样品（补充图1B）。
  4. 首先使用485 nm短通滤光片（SP485）采集图像，第二步再添加一个锐利的405 nm带通滤光片（BP405；图3）。请参照补充文件2中报告的步骤进行操作。
    注意：可通过同一探测器利用可见光激光线（405 nm或488 nm激光效果最佳）的残余激光光采集伪明场图像。

7. 小脑的处理

  1. 首先，用手术刀将小脑切成两个半球，然后将切面（切割后得到的平坦部分）朝下，用胶水固定在振动切片机的支撑物上。
  2. 以与大脑相同的方式对小脑进行切片和成像（160 µm切片，相同的振动切片机设置、相同的刀片、相同的显微镜设置等）。
    注意：由于小脑的解剖结构特点，在切片时其方向并不关键；在远离表面的大多数切片中，小脑叶片均可清晰地切至白质区域。

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结果

由于生物组织中存在谐波产生分子的数量极少，采用该方法获得的图像具有固有的低背景水平，这是该方法的主要优势之一。

在对胼胝体纤维进行成像时，可在taiep小鼠脑中持续观察到纤维状的短结构和圆形成分（图3B），而对照组脑组织的胼胝体在整个脑区表现出更为异质且各向同性的信号（图3A）。这种信号差异的来源特异性地存在于二次谐波产生（SHG）现象中，因为加入窄带通滤光片后，仅降低了对照组图像中的非特异性信号强度（图3C-D），而选择性地去除了taiep图像中围绕胞体样结构及短而细长结构周围的微弱弥散信号，这些结构始终会产生强烈的SH光信号（图3E-F）。

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讨论

二次谐波显微技术（SHG显微技术）是一类非线性光学技术的组成部分，该类技术还包括双光子激发显微技术、三次谐波生成显微技术和相干反斯托克斯拉曼散射显微技术，这些技术共同拓展了传统光学显微技术在生命科学领域的应用范围20。

具体而言，SHG显微镜的主要优势和局限性均源于同一条件：信号来源于非中心对称结构21。这种特定的结构特征常见于无机和有机晶体中，但在生物样本中较为罕见。除胶原蛋白和肌球蛋白外，微管也能够产生二次谐波信号22，当平行聚合物束内发生足够多的信号叠加时，该信号可通过显微镜检测到。在细胞内，微管蛋白会形成平行束结构，主要存在于轴突的核心区域（具有细胞类型特异性）、有丝分裂纺锤体（具有时间特异性分布），以及本研究所展示的一种特征性微管聚集模式——即最近描述的一种微管病变：伴有基底节和小脑萎缩的低髓鞘化症（H-ABC）（这是首次报道的此类病理性分布）14,

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披露

作者无竞争性财务利益。

致谢

本工作由墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）通过以下项目资助：VP-CIO 的基础设施项目 226450，V.P. 的基础设施项目 255277，以及 V.H. 的 FORDECYT-PRONACES/194171/2020 项目。我们感谢 CIO 的 Juvenal Hernández Guevara 在视频制作过程中提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
405/10 nm BrightLine(R) 单通带滤光片 SemrockFF01-405/10-25直径32 mm，带安装环
黑色尼龙聚氨酯涂层织物ThorlabsBK55 英尺 × 9 英尺（1.5 m × 2.7 m）× 0.005"（0.12 mm）厚 
振动切片机刀片任意商用品牌；例如 Wilkinson Sword 经典不锈钢双刃剃须刀片
细胞培养皿，35 mm任意商用品牌；例如 Falcon351008
共聚焦显微镜ZeissLSM710NLO AxioObserver Z1倒置显微镜，所用物镜为 LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA 
保温箱任意商用品牌任何带隔热功能的聚苯乙烯箱均可使用，用于维持样品温度约 37 °C
玉米淀粉例如 Maizena超市购买
盖玻片 #1.5任意商用品牌矩形
氰基丙烯酸酯胶水例如 Loctite用于将脑组织粘附于遮蔽胶带上
精细镊子fine science tools11412-11通过脑膜操作组织切片
精细剪刀fine science tools14370-22用于剪开皮肤 
尖端弯曲的精细剪刀fine science tools14061-09用于沿中线剪切
甲醛 37%Sigma-Aldrich252549用 PBS 稀释 1:10
Friedman 骨钳fine science tools16000-14用于切割骨骼
凝胶加热包任意商用品牌预热至 37 °C，以帮助维持保温箱内温度
改良型玻璃巴斯德移液管任意商用品牌用于转移组织切片
Hanks′ 平衡盐溶液（HBSS）Gibco14025-076可用粉末配制
Kelly 止血钳fine science tools13018-14用于分离骨骼 
遮蔽胶带任意商用品牌用于保护样品板表面
NDD 模块，C 型Zeiss000000-1410-101用于检测信号，减少光损失。内置 000000-1935-163 滤光片组与 SP485
偏移式骨剪fine science tools16101-10用于切割骨骼
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco10010-031可用粉末或片剂配制
脉冲激光器CoherentChameleon Vision II680–1080 nm 可调谐激光器
手术刀任意商用品牌直刃，尖端锋利
标准齿纹镊子fine science tools11000-18
Vannas 弹簧剪fine science tools15018-10用于剪除仍连接在振动切片机所得切片与粘附于样品板上的组织切片之间的脑膜。
振动切片机任意商用品牌；例如 LeicaVT1200

参考文献

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