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方法文章

使用环形离子淌度质谱仪进行串联离子淌度实验

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DOI：

10.3791/63451

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2022年1月20日

 ,  ,  , 
1INRAE, UR BIA, F-44316 Nantes, France, 2INRAE, BIBS Facility, F-44316 Nantes, France

本文内容

摘要

离子淌度质谱法（IMS）是质谱技术在生物分子表征方面的一种有益补充，尤其因为它对同分异构现象具有敏感性。本方案描述了一种串联离子淌度（IMS/IMS）实验，可实现对特定分子的选择性分离，并生成其碎片的淌度谱图。

摘要

准确表征化学结构对于理解其潜在的生物学机制和功能特性至关重要。质谱法（MS）是一种常用工具，但并不总是足以完全揭示所有结构特征。例如，尽管碳水化合物具有重要的生物学意义，但由于存在多个层次的异构现象，其表征过程十分复杂。离子淌度谱法（IMS）是一种很有前景的补充技术，因为它对离子构象敏感，因而能够区分异构体。

此外，近年来的技术进步显著改进了该方法：与线性离子淌度谱（IMS）仪器相比，新一代的环状离子淌度谱（Cyclic IMS）仪器提供了更多功能，例如更高的分辨能力，或进行串联离子淌度（IMS/IMS）实验的可能性。在IMS/IMS实验中，首先根据离子的淌度选择特定离子，随后将其碎裂并重新分析，以获得其碎片的离子淌度信息。最近的研究表明，此类IMS/IMS数据中碎片的淌度谱图可作为特定聚糖的“指纹”特征，并可用于分子网络分析策略，以在结构上合理的方式对糖组学数据集进行组织。

本实验方案的目标是描述如何从样品制备到离子淌度维度的碰撞截面（CCS）校准，获得可重复的质谱谱图，从而生成IMS/IMS数据。以一种代表性糖链为例，本方案将展示如何在环形离子淌度质谱仪（Cyclic IMS）上构建IMS/IMS控制序列，如何利用该控制序列将离子到达时间转换为漂移时间（即实际施加于离子的分离时间），以及如何从原始数据中提取相关的淌度信息。本方案旨在清晰阐明IMS/IMS实验中的关键步骤，帮助初次使用环形离子淌度质谱仪的研究人员顺利完成简单且可重复的数据采集。

引言

对生物分子进行全面的化学表征是理解其潜在生物学功能特性的关键。为此，近年来发展出了"组学"科学，旨在对生物浓度下的化学结构进行大规模表征。在蛋白质组学和代谢组学中，质谱（MS）已成为揭示生物介质中结构异质性的核心技术，这尤其得益于其高灵敏度以及通过串联质谱（MS/MS）提供结构信息的能力。在MS/MS策略中，首先根据质量选择某一离子，随后使其碎裂，最终采集其碎片的质量，从而建立该分子的指纹图谱。MS/MS谱图尤其可用于比对谱图数据库1,2，或尝试重建母体结构3,4。基于“相似谱图对应相似化合物”的假设，MS/MS数据还可用于构建分子网络（MNs），通过相似性评分将相关分子物种相互关联5,6。

然而，由于质谱（MS）技术本质上只能检测离子的质荷比（m/z），该方法对多种处于（立体）异构范围内的结构特征不敏感。例如，碳水化合物由多个单糖亚基组成，其中许多互为立体异构体，甚至为差向异构体（如 Glc 与 Gal，或 Glc 与 Man）。这些亚基通过糖苷键连接，而糖苷键在连接位置（位置异构）和异头碳的立体构型（异头异构）上可能存在差异。这些特性使得单独使用质谱难以区分碳水化合物异构体7，仅能通过高能活化方法解决位置异构问题8,9,10。尽管衍生化是一种打破立体异构基团等价性的可行方法11，但其需要复杂的样品前处理。另一种更直接的方法是将质谱与对异构现象敏感的分析维度联用，例如离子迁移谱（IMS）。

由于本方案面向已熟悉离子淌度质谱（IMS）基本概念的用户，且相关详细综述已在其他文献中发表12,13，此处仅对IMS的基本原理作简要概述。IMS是一种气相分离技术，依赖离子与缓冲气体及电场之间的相互作用，最终根据离子的气相构象实现分离。目前商用仪器中可采用多种不同原理的IMS与质谱（MS）联用技术：部分仪器在交变的高、低电场下运行（非对称场离子淌度分离，FAIMS），而大多数则在低电场条件下运行，主要包括漂移管离子淌度分离（DTIMS，线性递减电场）、行波离子淌度分离（TWIMS，对称电势波）以及捕集式离子淌度分离（TIMS，利用高速缓冲气流对抗电场以捕获离子）13。低电场方法可获得一种称为碰撞截面（CCS）的参数，该参数表征离子-气体对在分离过程中相互作用的有效表面积（单位为 Å2 或 nm2）。理论上，CCS与仪器无关，因此可用于生成可在不同实验室间重复验证的数据14。离子淌度分离可能受到多种参数的影响，尤其是迁移池内气体压力和温度的波动。通过CCS校准可有效缓解此类影响，因为校准物和待测物会受到相似的环境影响13。然而，必须将仪器安装在温度可控的环境中，并配备可靠的气体压力控制系统。

离子迁移谱（IMS）的一个有趣发展是IMS/IMS，该技术由Clemmer团队于2006年首次提出，可视为质谱/质谱（MS/MS）的类比方法15,16。在IMS/IMS中，首先根据目标离子的离子迁移率对其进行选择性分离；随后对该离子进行活化（直至可能发生碎裂），并对活化后的离子或其碎片重新进行一次IMS分析。最初的仪器设计将两个IMS单元串联排列，中间通过一个离子漏斗连接，活化过程即在该漏斗处进行。自那时以来，尽管已有多种IMS/IMS装置被提出（综述见Eldrid和Thalassinos17），但首台具备IMS/IMS功能的商用质谱仪直到2019年才问世18。该仪器通过引入另一项技术突破——IMS单元的循环设计，显著改进了最初的概念。

循环离子迁移谱（IMS）单元理论上可近乎无限地增加漂移路径长度，从而提高仪器的分辨能力19。这一目标通过特殊的仪器几何结构实现，其中循环行波离子迁移谱（TWIMS）单元被垂直置于主离子光学轴线上。在IMS单元入口处设有多功能阵列区域，可控制离子路径的方向：(i) 将离子侧向导入以进行IMS分离，(ii) 向前传输至质谱（MS）检测器进行检测，或 (iii) 从IMS单元反向返回并储存至前置阵列单元。从该前置储存单元中，离子可被激活，其碎片重新注入IMS单元进行离子淌度测量，该方法已成功用于立体异构体的表征20。最终获得的数据包含前体离子及其碎片的离子淌度和m/z信息。

在最近一项使用该环状设计进行聚糖分析的研究中（Ollivier 等）21），我们证明了此类离子迁移谱/离子迁移谱（IMS/IMS）数据中片段的迁移率谱可作为生物分子的“指纹”，并可用于分子网络分析策略。由此构建的网络称为离子迁移分子网络（IM-MN），能够以结构相关的方式对糖组学数据集进行组织，而仅基于串联质谱（MS/MS）数据构建的网络（MS-MN）则提供的信息有限。为补充该研究并帮助使用环状离子迁移谱（Cyclic IMS）的用户实施该工作流程，本实验方案详细描述了数据采集的完整流程。本方案仅聚焦于生成可用于构建IM-MN网络的IMS/IMS数据（参见21）或任何其他自选应用。本文不讨论IM-MN的构建，因为分子网络的实验方案已有公开资源可供参考。22. 为获得有价值且可重复的 IMS/IMS 采集结果，必须遵循的关键步骤将被重点强调。以 Ollivier 研究的寡糖之一为例 等21，具体步骤如下：（i）样品制备，（ii）环状离子淌度谱（Cyclic IMS）仪器调谐，（iii）数据的自动峰提取，以及（iv）碰撞截面（CCS）校准。

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方案

注意：本方案的概述见图1。本方案中所述实验所使用的参数详见补充表S1和补充表S2。

1. 样品溶液的制备

注意：本方案以阿拉伯木聚糖五糖（23-α-L-呋喃型阿拉伯糖基-木四糖或 XA2XX；参见材料表）为例进行描述。

  1. 溶剂的配制： 500 µM LiCl 在 50:50 H2O:MeOH（体积比）。
    1. 配制 100 mM 氯化锂（LiCl）储备液，溶剂为 H2O，通过称取212 mg LiCl并加入50 mL高纯度去离子水（H2O）加入50 mL聚丙烯锥形管中，振荡至完全溶解。
      注意：溶剂中掺入锂盐以促进[M+Li]的形成+ 加合物在质谱仪离子源中的应用通常能产生比其他碱金属加合物质量更高的碎片谱图。建议使用 LiCl，因为先前研究发现有机酸（及其盐）会影响离子迁移谱（IMS）的谱图特征23.
    2. 在玻璃瓶中，将LiCl储备液稀释200倍： 250 µL 的贮存液，加入 24.75 mL 的 H2O. 加入25 mL甲醇（MeOH），使LiCl的终浓度达到 500 µM 50:50 H2O：MeOH（v/v）。超声2分钟以脱气溶剂。
      注意：甲醇具有健康危害（H225，H301，H311，H331，H370）；操作时须在通风橱内进行，并穿戴实验服、手套和护目用具。甲醇/水体积比为50:502O (v/v) 似乎是寡糖电离的最佳溶剂；但如有需要，甲醇（MeOH）可用乙腈（ACN）替代。
  2. 在1.5 mL聚丙烯管中，称取1 mg碳水化合物，加入适量体积的溶剂溶解 500 µM LiCl，使其终浓度为 1 mg/mL。稀释至最终浓度 10 µg/mL 在50:50甲醇/水（MeOH/H₂O）中2O + 500 µM LiCl。储存于 4 °C.
    注意：浓度 10 µg/mL 为在IMS/IMS-MS中优化所有碎片离子的信号强度，选择该浓度（适用于纯化合物；分析混合物时需提高浓度）。采集参考IMS/IMS谱图时，不再进一步稀释样品：在发生碎裂前，质谱检测器出现饱和是预期现象，尽管仪器提供相应的校正选项（见步骤3.2）。

2. 环形离子淌度质谱仪的调谐

注意：与软件相关的操作说明（窗口、菜单和命令）以粗体标出。

  1. 从仪器控制软件中打开仪器控制台MS 调谐 页，参见软件详情中的 材料表），并将仪器放入 操作 模式。等待至少3小时，使离子迁移谱（IMS）池中的高电压稳定。
    注意：为了获得最佳的可重复性，离子淌度分离（IMS）池中的电压必须完全稳定。在进行任何循环式 IMS 分析之前，应开启高压并让仪器过夜稳定。此外，离子淌度池内的压力和温度必须尽可能保持恒定。尽管压力读数反馈功能可用，但 真空 标签，无法读取温度。请将仪器置于恒温实验室中。本研究所用仪器在1.75 mbar压力下运行，实验室温度恒定 20 °C.
  2. 环状离子淌度质谱仪设置
    注意：标准溶液必须使用仪器配置中的内置流体系统进行进样。
    1. 将装有制造商提供的适当标准品的流体容器放置到流体系统中：B储液槽（“Lockmass”）：10 pg/µL 亮氨酸脑啡肽（LEU ENK）溶于50:50乙腈/水2O + 0.1% 甲酸；储液槽 C（“校准液”）：MajorMix。
      注意：在本方案中，将使用 MajorMix 校准液对两者进行校准 m/z 以及 CCS 维度。出于实际原因，将执行外部 CCS 校准（参见方案步骤 5）；因此，也可使用自制校准物混合物进行 CCS 校准，而使用另一种校准物进行 m/z （例如甲酸钠或碘化钠）。
    2. 在 调整 Quartz 控制台页面，转到 流体学 选项卡。将样品流路设置为C储液池，参比流路设置为B储液池。依次在离子源中注入两种溶液，以检查质谱信号。
    3. 进行ADC设置、检测器设置（使用LEU ENK）以及质量校准（参见 材料清单 （用于校准溶液）从 仪器设置 按照制造商说明书进行操作。
  3. 使用单次通过分离法记录校准溶液的IMS采集数据（用于IMS外部校准）。
    注意：在所有采集过程（校准和样品采集）中，离子源参数和行波（TW）参数（静态波高和波速）必须保持恒定。如果用户对样品的最佳参数尚无经验，可在完成方案第3步后进行此操作（针对[M+Li]）+ 中性寡糖加合物的代表性结果采用16 V的传输波（TW）高度和350 m/s的TW速度，可获得最佳效果。
    1. 来自 流体学 标签，选择挡板位置 样本 并注入校准物（参见 材料表通过“样品”探针以流速 10 µL/min.
    2. 建立单次通过的 IMS 序列。从 调整 页，将仪器放入 迁移率 模式，并打开 循环序列控制 窗口。选择 高级 模式。从 循环函数 在此新窗口的标签页中，选择 添加捆绑包，然后 单次/多次循环等待一系列运动事件出现在 序列 同一窗口的标签页。
      注意：要激活实时显示功能，用户必须应用仪器参数：单击 调谐 在 TOF 模式或 运行 在 活动性 模式。在仪器切换模式之前 飞行时间 和 移动性 模式，有必要 中止 任何正在进行的数据采集（包括 调整 离子的相对丰度可能因页面显示而异 TOF 模式和 活动性 模式因离子传输参数的变化而改变。
    3. 调整序列，使所有校准离子在环形离子迁移率分离跑道中仅完成一次完整通过。不要更改 注射 时间或 推出并获取 时间；然而，降低 分离 1 毫秒（在 序列 离子。如果校准混合物中的某些离子未落在显示的到达时间窗口内，可通过增加正交加速飞行时间分析器推斥器与离子迁移谱同步的次数来调整 每箱推动次数 在 ADC 设置 标签
      注意：控制序列中的时间仅用于控制多功能阵列的离子门控。只要离子仍处于其第一个（或第n个）th）在飞行管中绕行一圈时，即使在此期间阵列中行波（TW）的方向已发生改变，离子仍会完成此次绕行。将分离时间缩短至1 ms意味着阵列将在1 ms后切换至喷射模式。这确保了较快的离子在较慢离子完成第一圈绕行之前，没有足够时间穿过阵列并开始第二圈绕行。因此，所有离子都将经历相同次数的绕行（即仅一圈），这是进行离子迁移谱（IMS）校准所必需的条件。
    4. 记录2分钟的采集。在 循环序列控制 窗口，单击 获取 以打开 采集设置 弹出窗口。输入 文件名, 描述，以及 采集时长（分钟） 并点击 保存.
  4. 在与步骤2.3相同的条件下，对校准溶液再进行一次2分钟的采集（用于检查CCS校准的质量）。在 循环序列控制 窗口，单击 获取 以打开 采集设置 弹出窗口。输入 文件名, 描述，以及 采集时长（分钟） 并点击 保存.
  5. 用 50:50 H2O/ACN 以避免校准品在peek管路中结晶。

3. 离子迁移谱/离子迁移谱-质谱采集

  1. 使用注射泵，注入（掺锂）样品 10 µg/mL 以流速通过样品探针 10 µL/min.
  2. 将仪器切换至 TOF 模式（来自 MS调谐 翻页）以检查信号的稳定性。记录样品的全扫描MS采集（1分钟），可用于检查同位素分布模式及潜在污染物的存在。
    注意：由于样品浓度的选择旨在获得良好的碎片离子信号，因此在此步骤中可能出现飞行时间饱和（TOF饱和）。可通过以下现象识别TOF饱和：（i）质谱分辨率人为升高，（ii）同位素比例发生变化，（iii）同位素峰之间出现大量低丰度峰。使用 DRE 镜头 （动态范围增强， 四极杆/质谱分析/差分响应增强 主标签页 调整 以减弱离子传递并消除饱和现象 TOF 模式（图2A，B).
  3. 将仪器放入 MSMS 模式（四极杆/质谱仪分析 主标签页 调整 页）并选择目标离子的质量数 MSMS 质谱 四极杆中用于分离的场（示例中： m/z 685.2，对应于[M+Li]+ 阿拉伯木聚糖五糖的离子种类）。数据处理时，记录1分钟的采集以检查前体离子的分离情况。
    注意：锂加合物在单一同位素峰处存在一个 -1 Da 的同位素峰，需从 MS/MS 选择窗口中去除，以避免干扰后续处理步骤。可通过缩小选择范围来去除该峰。 LM分辨率 和 HM分辨率 参数在 四极杆/质谱分析谱图 标签图 2C).
  4. 建立一个“切片”离子迁移谱（IMS）序列，以基于迁移率选择目标异构体。
    1. 切换仪器至 活动性 模式（见步骤 2.3.2）。在 循环序列控制 窗口，从 循环函数 标签，选择 添加束 然后 切片. 等待复杂的迁移事件序列出现 序列 标签图3).
      注意：可以可视化 IMS/IMS 过程的每一步：单击 弹出并获取 事件在 序列 标签。一旦以红色高亮显示，使用其将该标签移动至序列中的适当位置 向上 和 向下 按钮。
    2. 将 弹出并获取 事件紧随第一次之后发生 分离 事件（即，在序列中将其从第8行移至第3行，如图所示） 图3）然后单击 运行. 观察初始分离结果的实时显示。延长第一阶段的持续时间 分离 通过调整序列中该事件的时间值，实现多通分离，直至离子迁移谱峰的分辨率令人满意为止。采集1分钟数据作为参考。
      注意：请注意以下事项 ADC启动延迟 值在 ADC设置 标签：检查分离质量将是有用的。
    3. 点击 暂停请注意，初始分离的结果将被显示，但在用户点击之前，对控制序列所做的修改不会生效 运行 再次。放置 弹出并获取 事件下方的 弹出, 弹出至预存位置，以及 握持与弹出 事件。调整事件的持续时间，使目标峰位于其中 弹出至预存位置 区域，而任何其他离子则处于 推出 或 握持与弹出 区域
      注意：这三个事件的持续时间与到达时间分布（ATDs）相比，可通过迁移谱下方的颜色编码条进行可视化显示 迁移谱图 标签图3).
    4. 放置 弹出并获取 序列末尾的事件，位于下方 从预存样本重新注射 以及第二个 分离 事件。点击 运行 以显示选定的细胞群体。
      注意：由于所选群体已离开 IMS 细胞，所有先前的分离效果均已丧失，此时恢复为单次通过分离（此为预期状态）。
    5. 检查分离纯化的质量。为验证仅目标峰被成功选取，需在重新进样前后进行相同的分离操作（即，相同的 分离 时间）如图所示 图 4记录1分钟的采集数据作为参考。
      注意：建议用户检查被分选的细胞群； 弹出至预存 时间窗口应为基线水平（图 4B）。为了验证这一点，将 ADC启动延迟 在 手动 模式在 ADC 设置 标签，输入步骤 3.4.2 中记录的延迟时间。采集 1 分钟数据作为参考。
    6. 在 序列 标签，位于用户自定义事件时间所在列的旁边（ 时间绝对值 列（以红色标出），查找所有事件的累计时间。记录下总时间 时间吸收 位于该线上的 从预存样本重新注射 执行 CCS 校准的事件。
  5. 在两轮离子淌度分离（IMS）之间对目标峰进行碎裂。改变重注入步骤的电压，以增加离子的动能，使其在与离子淌度气体碰撞时发生碎裂。
    1. 设置持续时间 分离 事件直接前导的 弹出并获取 至1毫秒（参见步骤2.3.3中的说明）。
    2. 在 从预存样本重新注入 线，勾选 启用激活 若谱图满意（例如，基峰为碎片离子），则直接进入步骤 3.5.4。
      注意：启用激活后，线路上的三个电压将变为灰色：如果需要手动优化电压，用户需更改这三个电压（参见下一步）。这三个电压（预阵列梯度，预阵列偏置 和 阵列偏移）形成用于激活离子的梯度。离子的动能将随着两者之间的斜率增加而增大 预阵列偏差 和 阵列偏移 （参见 图5）。梯度→偏置→偏移电压的默认值为：无激活时为 85 → 70 → 45 V；内置功能最大激活时为 185 → 170 → -5 V（+150 V）。碎片化后，切勿忘记使用以下参数重新调整离子传输： DRE 镜头 （降低信号衰减）（参见步骤 3.2）。
    3. 如果使用内置控制进行片段化效果不理想，请取消勾选 激活启动 盒中，并手动优化重注入电压。增加 预阵列梯度 电压（ 预阵列偏差 电压必须始终保持在15 V以下 预阵列梯度，并降低 阵列偏移 电压（可设为负值），直至结果满意为止。
      注意：在手动调节多功能阵列的电压时，用户可从“迁移谱图”视图切换至显示多功能阵列中施加电压的交互式示意图PE图）以更清晰地显示电压设置（图 5A).
    4. 记录2分钟的采集。在采集弹出窗口中，勾选 保留漂移时间 生成仅包含到达时间与 m/z （用于色谱分析的采集时间——即保留时间——已从文件中移除）。请注意，该文件已标注 _dt.RAW.
      注意：如果用户忘记勾选该选项 保留漂移时间 选项，仍可使用 Driftscope 2.9 软件提取 IMS 维度文件 | 导出至 MassLynx | 保留漂移时间).
  6. 将仪器转回 飞行时间 主模式 调整 页面，并用 50:50 甲醇/水彻底冲洗系统2在进行下一个样品之前。

4. 使用 MZmine 2 进行 IMS/IMS-MS 数据处理24

注意：MZmine 2 可从材料表中提供的 URL 获取。建议使用 MZmine 2.51 版本。在撰写本文时，由于导入功能的更改，较新版本无法打开来自 Cyclic IMS 仪器的 RAW 文件。

  1. 使用原始数据方法 | 原始数据导入导入仅包含离子迁移谱（IMS）和m/z维度的原始文件（*_dt.RAW）。
    注意：原始文件将显示在主MZmine窗口的左侧。请勿导入仍包含保留时间维度的原始*.RAW文件。MZmine无法区分保留时间与IMS到达时间，两个维度的数据点将会重叠。
  2. 在原始数据文件列表中选择一个代表性文件，以优化工作流程参数。
    1. 评估数据中的噪声水平。在原始数据文件列表中右键单击该文件，选择显示TIC并显示基峰“色谱图”（BPC）。双击肉眼可观察到的最小峰以显示其质谱图。将该谱图中基峰第二同位素峰的强度视为数据中的噪声水平，并在后续处理步骤中将此值用作所有强度阈值的参考。
      注意：数据采用四极杆隔离采集，因此被MZmine视为MS/MS数据。在整个MZmine处理过程中，请确保使用MS级别 = 2。
    2. 使用原始数据方法 | 特征检测 | 质量检测进行质量检测。对于以轮廓模式采集的数据，使用小波变换算法。为在MZmine中设置算法参数，请点击算法旁边的[...]按钮，并使用显示预览选项在优化参数时可视化数据。
      注意：在此阶段，算法选中的峰将在预览窗口中以红色显示。当在专有RAW文件上使用小波变换算法时，MZmine有时会将轮廓数据点误认为是质心化峰。软件将显示一条提示消息，指出用户正在质心化谱图上运行轮廓算法：请忽略此消息并点击确定。
    3. 使用上一步生成的“质量”质量列表，通过原始数据方法 | 特征检测 | ADAP色谱构建器重建每个碎片质量的提取离子迁移谱（EIM）。由于此阶段的m/z容差输入为扫描间容差，因此请确保其值至少为整体预期准确度的3-4倍。
    4. 由于上一步无预览选项，可直接通过主MZmine窗口右侧面板中出现的特征列表检查峰提取质量。打开特征列表，选择所有行，右键单击并选择显示/XIC（对话框）。点击全部以在迁移谱上显示所有离子。检查以彩色显示的已提取峰，确保无明显遗漏的峰。
    5. 对EIM进行解卷积，将包含不同峰的m/z拆分为多个特征。使用特征列表方法 | 特征检测 | 色谱解卷积，并选择小波（ADAP）算法。使用显示预览选项及以下关键参数优化算法：信噪比阈值、系数/面积阈值和保留时间小波范围。
      注意：建议检查解卷积后谱图的形态。使用第4.2.4步所述的色谱可视化工具。解卷积后的峰将以彩色显示，相同质量的峰应被正确分离，如图6A所示。
    6. 使用特征列表方法 | 同位素 | 同位素峰分组器对解卷积后的EIM进行去同位素处理。使用仪器的预期准确度作为m/z容差值，并将到达时间容差设为0.1 ms（在MZmine中显示为保留时间容差0.1 min），因为在IMS分离过程中同位素未被分辨。检查特征列表：若仍有同位素残留，请提高容差值。
      注意：尽管理论上可在特征列表处理的任意阶段进行去同位素处理，但建议最后执行此步骤，以便导出电荷值（其他步骤所用算法有时会移除电荷状态信息）。
  3. 若处理多个IMS/IMS-MS谱图，请使用这些优化后的参数重复处理。对所有谱图保持相同的参数。
  4. 若存在多个谱图，使用特征列表方法 | 对齐 | 合并对齐器将它们合并为单个表格以便导出；否则直接跳至第4.5步。由于目标并非实际对齐峰，因此对m/z和到达时间使用严格的容差值。对两个维度赋予相同的权重。
  5. 将最终特征列表导出为*.csv文件。使用特征列表方法 | 导出/导入 | 导出为CSV文件，并导出以下值：导出行m/z、导出行保留时间（实际IMS到达时间）、峰m/z和峰强度。使用逗号作为字段分隔符。

5. 去簇合 IMS/IMS 谱图的 TWCCSN2

注意：本方案将采用对数拟合校准25,26，该方法通常比线性校准效果更佳，且易于在电子表格或内部处理脚本中实现。相关内部脚本（使用 R 语言编写）可在材料表提供的 URL 处获取。

  1. 从校准物采集数据中选取参考到达时间值（参见步骤 2.3）。使用构造软件（见材料表）手动完成此操作，以检查所有离子迁移谱（IMS）校准物峰的形态。
    1. 在色谱图窗口中，打开对应于校准物的*_dt.RAW文件。
    2. 对于每个校准点，使用显示 | 质量选项生成扩展离子迁移谱（EIM）。
    3. 检查 EIM 的轮廓。若某些峰形不清晰，使用处理 | 平滑选项进行平滑处理（通常采用 Savitzky-Golay 算法，3 个数据点内平滑 2 次效果最佳）。将各峰顶点值记录至电子表格中。
      注意：由于参考点通常使用低分辨率 DTIMS 设备采集，在环状 IMS 中可能根据校准物出现一些多模态分布。若某峰呈现此类分布，应将其从校准列表中剔除。
  2. 根据校准物计算对数拟合参数。
    1. 对所有校准点，计算以下参数。
      1. 使用公式 (1) 计算漂移时间：
        静态平衡方程 \(t_d = t_A - t_{inj}\)，表示数学表达式。 (1)
        其中 td 为漂移时间，tA 为测得的到达时间，tinj 为离子注入 IMS 脱溶室的时间（单位均为 ms）。
        注意：对于小分子（如寡糖片段），不同质量之间的死区时间（IMS 脱溶室出口至检测器的飞行时间）变化处于 CCS 校准误差范围内，可忽略不计。
      2. 使用公式 (2) 计算离子的中性质量：
        静态平衡公式：m_neutral=(m/z)×|z|-m_ion；与质谱相关的方程。 (2)
        其中 z 为离子的电荷态，mion 为反离子的质量（单位 Da）。应使用精确质量以避免引入不确定性。若存在原子丢失而非反离子，使用负的 mion 值（例如，对于 [M-H]-，mneutral = (m/z) * |z| - (-1.007276) = (m/z) * |z| + 1.007276）。
      3. 使用公式 (3) 计算 CCS' 参数：
        质谱分析中 CCS' 参数计算的静态平衡公式示意图。 (3)
        其中 CCS 为参考漂移管 DTCCSN2 值（单位 nm2），mgas 为漂移气体的质量（单位 Da；例如氮气：mgas = 28.01 Da）。
      4. 使用公式 (4) 计算 td' 参数：
        质谱离子漂移时间计算方程。 (4)
        其中 d 为实验中用于校正死区时间的检测器启动延迟（通常约为 1.5 ms）。
      5. 计算上述参数的对数值：
        ln (CCS') 和 ln (t'd)
    2. 进行线性回归，以确定对数拟合的 R2 系数以及公式 (5) 中的 x 和 y 参数（其中 x 为斜率，ln(y) 为截距）：
      静态平衡方程，ln(CCS') = x×ln(t₀ᵈ) + ln(y)，公式表示。 (5)
      注意：用户可绘制 ln(CCS') 与 ln(td') 的关系图以直观检查校准结果，但此步骤为可选。
  3. 将校准应用于实验数据，以校准 MZmine 为导出至 *.csv 文件的每个 IMS/IMS 谱所选取的峰。对每个数据点，计算以下参数。
    1. 使用公式 (6) 计算漂移时间：
      数据采集延迟方程：\( t_d = t_A - t_{seq} \)。 (6)
      其中 tseq 为最终 IMS 分离前的时间（即步骤 3.4.6 中记录的“Time Abs”值）。
      注意：若对使用不同序列采集的多个 IMS/IMS 谱进行校准，需仔细核对 tseq 的值。
    2. 使用公式 (7) 计算离子的中性质量：
      质谱公式，\(m_{neutral} = (m/z) \times |z| - m_{ion}\)，用于化学分析。 (7)
    3. 使用公式 (8) 和公式 (9) 计算 td' 和 td'' 参数：
      质谱时间校正方程；公式：t'_d = t_d - 0.001 × d × (m/z)^0.5。 (8)
      质谱方程；离子传输性质公式；光谱分析方法。 (9)
    4. 使用公式 (10) 计算最终校准的 CCS 值（TWCCSN2，单位 nm2）：
      静态平衡公式，TWCC_S_N2 = t'_d × y；用于科学分析的数学方程。 (10)
      注意：尽管步骤 5.2.2. 给出的截距为 ln(y)，但必须使用 y 来获得最终的 CCS 值。切勿忘记应用指数函数。
  4. 通过将校准应用于步骤 2.4 中采集的校准溶液的第二次数据采集，检查校准的准确性。
    注意：校准结果的误差应在 ~1–2% 范围内。

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结果

以阿拉伯木聚糖五糖 XA2XX 为例说明本实验方案。该化合物可商业获得，但仅以与另一种阿拉伯木聚糖五糖 XA3XX 的混合物形式提供（纯的 XA3XX 也可商业获得）。XA2XX 和 XA3XX 的结构见补充图 S1。由于商业混合物中 XA2XX 与 XA3XX 的比例约为 50:50，因此配制浓度为 20 µg/mL 的混合物溶液，以在 50:50 MeOH/H2O + 500 µM LiCl 体系中使 XA2XX 的浓度达到约 10 µg/mL。

首先，采用高分辨质谱对 XA2XX + XA3XX 混合物进行质谱分析。由于这两种化合物为同分异构体，仅在 [M+Li]+m/z 685.24 处观察到一个单一质谱峰。通过四极杆选择该质谱峰，并调整选择窗口以去除 -1 Da...

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讨论

SELECT SERIES Cyclic IMS 是一种强大的工具，能够在无需上游色谱分离的情况下，选择特定质荷比（m/z）和离子淌度的离子群体。该仪器可生成该离子群体的二维碎片图谱，并从中提取出 MS/MS 和 IMS/IMS 谱图。然而，用户在实验过程中必须注意若干需要特别关注的关键点。

首先，用户应仔细检查质谱隔离窗口中是否存在可能的同重数干扰物。实际上，四极杆的隔离窗口相对较宽，了解可能在四极杆中被共选出的、m/z 略有差异的离子，将有助于用户在离子淌度中正确指认目标峰。

其次，在进行初始分离时，操作者必须确保所有离子在循环离子淌度池中经历相同次数的循环。这是循环式装置中离子淌度分离的一个重要且关键的环节。若对特定离子的循环次数评估错误，可能导致峰的错误鉴定与误读。由于单次循环路径较短（约1米），不同离子群体的循环次数控制较为困难，淌度差异较大的物种可能迅速发生重叠。

特别地，当离子群通过时，若阵列改变方向，则一个峰可能在两次不...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

S.O. 感谢法国国家科研署对其博士研究的资助（项目编号 ANR-18-CE29-0006）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
33-α-L- 与 23-α-L-阿拉伯呋喃糖基-木寡四糖（XA3XX/XA2XX）混合物Megazyme Ltd., Wicklow, IrelandO-XAXXMIXXA2XX + XA3XX 混合物
33-α-L-阿拉伯呋喃糖基-木寡四糖（XA3XX）Megazyme Ltd., Wicklow, IrelandO-XA3XX纯 XA3XX 标准品
Eppendorf Safe-Lock 离心管，1.5 mL，Eppendorf 品质，无色，1,000 支Eppendorf, Hamburg, Germany0030120086用于制备碳水化合物储备液及其稀释液
FALCON 50 mL 聚丙烯锥形离心管，30 × 115 mmCorning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico352070用于制备 100 mM LiCl 水溶液储备液
氯化锂（ACS 级试剂，≥99%）Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France310468用于向样品中掺杂锂离子
Major Mix IMS/Tof 校准试剂盒Waters Corp., Wilmslow, UK186008113质谱与离子淌度校准溶液
MassLynx 4.2 SCN1016 版本 6（Waters 嵌入式分析平台，Cyclic IMS 2.9.1 版本 9）Waters Corp., Wilmslow, UK721022377用于仪器控制与数据处理的 Cyclic IMS 厂商软件
用于 HPLC 的甲醇，PLUS 梯度级Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France412383高纯度溶剂
MS 亮氨酸脑啡肽试剂盒Waters Corp., Wilmslow, UK700002456用于质谱仪调谐的参考化合物
SCHOTT DURAN 100 mL 硼硅酸盐玻璃瓶VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US218012458用于制备 50:50 MeOH/水溶液中 500 µM LiCl 溶液
SELECT SERIES Cyclic IMSWaters Corp., Wilmslow, UK186009432配备环形离子淌度池的离子淌度-质谱联用仪
网站：http://mzmine.github.io/MZmine 开发团队-MZmine 软件下载链接
网站：https://github.com/siollivier/IM-MNINRAE, UR BIA, BIBS 设施，南特，法国-内部 R 脚本下载链接，包含 CCS 校准函数

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