方法文章

一个 体外 研究线粒体功能障碍的方法：一种胞质杂交模型

DOI：

10.3791/63452

⸱

2022年3月9日

 ,  ,  , 
1Unit of Medical Genetics and Neurogenetics, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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线粒体转染杂交细胞是通过将线粒体DNA（mtDNA）耗竭细胞（rho0细胞）与来自线粒体疾病患者的去核细胞（胞质体）融合而获得的杂交细胞。这类细胞可用于确定疾病的核源性或线粒体源性、评估生物化学活性，并验证与mtDNA相关的变异在致病过程中的作用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

执行氧化磷酸化（OXPHOS）的线粒体呼吸链复合物缺乏是人类线粒体疾病的生化标志。从遗传学角度来看，OXPHOS是一个独特的例子，因为它由两个不同的遗传系统互补形成：核DNA（nDNA）和线粒体DNA（mtDNA）。因此，OXPHOS缺陷可能由影响核基因和线粒体编码基因的突变引起。

King 和 Attardi 于 1989 年发表的开创性研究显示，将缺乏 mtDNA 的人类细胞系（称为 rho0）通过外源性线粒体重新导入，可获得所谓的"线粒体转导杂交细胞"。得益于这些含有源自线粒体疾病（MDs）患者线粒体和 rho0 细胞核基因组的杂交细胞，研究人员能够验证某种缺陷是源于 mtDNA 还是 nDNA。这些杂交细胞也是验证突变致病性及其生化层面影响的有力工具。本文提供了一项详细的实验方案，描述了杂交细胞的构建、筛选与鉴定过程。

引言

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线粒体疾病（MDs）是一类由核DNA（nDNA）或线粒体DNA（mtDNA）突变导致线粒体功能障碍而引起的多系统综合征1。它们是最常见的遗传性代谢疾病之一，患病率约为1:5,000。与mtDNA相关的疾病遵循线粒体遗传规律：母系遗传、异质性、阈值效应以及有丝分裂分离2。人类mtDNA是一个大小为16.6 kb的双链环状DNA分子，包含一个短的控制区，该区域含有复制和转录所需的序列，以及13个编码蛋白质的基因（均为呼吸链的亚基）、22个tRNA基因和2个rRNA基因3。

在健康个体中，仅存在一种线粒体DNA基因型（同质性），而在病理状态下则存在多种基因型共存（异质性）。有害的异质性突变必须超过某一临界阈值，才会破坏氧化磷酸化（OXPHOS）并导致疾病，这些疾病可在任何年龄影响任何器官4。氧化磷酸化系统的双重遗传特性决定了其遗传模式：核DNA突变可表现为常染色体隐性或显性遗传以及X连锁遗传，线粒体DNA突变则表现为母系遗传，此外还存在核DNA和线粒体DNA突变的散发病例。

在线粒体医学时代的初期，King 和 Attardi5进行了一项具有里程碑意义的实验，通过创建杂交细胞，确立了理解导致线粒体病（MD）的突变起源的基础。这些杂交细胞包含来自完全缺失线粒体DNA（即rho0细胞）的肿瘤细胞系的细胞核，以及来自线粒体病患者的线粒体。当时尚未出现下一代测序（NGS）技术，因此很难确定某一突变位于核基因组还是线粒体基因组。该方法于1989年被首次描述，随后被多位从事线粒体医学研究的研究人员所采用6,7,8,9；最近已发表详细的实验方案10，但尚未制作相关视频。在如今NGS技术已能精确且快速地定位突变位置的情况下，为何这一实验方案仍然具有重要意义？答案在于，细胞质杂交（cybrid）构建仍是当前确认任何新发现的线粒体DNA突变致病性的先进方法，可用于关联异质性水平百分比与疾病严重程度，并在核背景均一、且完全排除患者自身核基因组干扰的系统中开展生化研究11,12,13。

本方案描述了如何从在35 mm培养皿中生长至融合的患者来源成纤维细胞中获取去核细胞质体。在细胞松弛素B存在下对培养皿进行离心，可分离出无细胞核的细胞质体，随后在聚乙二醇（PEG）存在下将这些细胞质体与rho0细胞融合。所获得的细胞质杂交细胞（cybrids）随后在选择性培养基中培养，直至克隆形成。代表性结果部分展示了对所获得的细胞质杂交细胞进行分子表征的示例，以证明其线粒体DNA（mtDNA）与供体患者成纤维细胞的mtDNA相同，而核DNA（nDNA）则与肿瘤来源的rho0细胞系的核DNA一致。

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方案

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注意：使用人成纤维细胞可能需要获得伦理批准。本研究中使用的成纤维细胞来源于肌营养不良症（MD）患者，并按照伦理要求储存在机构生物样本库中。已为细胞的使用提供知情同意。所有细胞培养操作均须在室温（RT，22–25 °C）下的无菌超净工作台中进行。使用适用于细胞培养的无菌过滤溶液和无菌设备。所有细胞系均在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养。应每周进行支原体检测，以确保细胞无支原体污染。143BTK- rho0 细胞可按照先前描述的方法制备5。

1. 细胞培养

  1. 在开始任何操作之前，需验证来自线粒体病（MD）患者的成纤维细胞中是否存在该突变，并通过限制性片段长度多态性（RFLP）和/或全线粒体DNA测序分析，定量检测异质性或同质性突变的比例。14.
  2. 在四个35 mm培养皿中分别接种成纤维细胞，每个培养皿中加入2 mL完全培养基（Complete Culture Medium）表1让细胞生长至80%汇合度（48小时）。
  3. 培养 143BTK- rho0 8 mL 补充培养基中的细胞 培养基表1在100 mm培养皿中。
  4. 将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2.
  5. 检测 rho 中 mtDNA 的缺失情况0 通过测序技术分析细胞14.

2. 成纤维细胞去核

  1. 将四个 250 mL 可用于离心的瓶子在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟进行灭菌处理。随后在实验室烘箱中或室温下干燥。
  2. 将离心机预热至 37 °C。
  3. 使用 2 mL 不含钙和镁的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），对含有成纤维细胞的 35 mm 培养皿清洗两次。
  4. 用 70% 乙醇清洁培养皿外表面，并等待乙醇完全挥发。
  5. 取下培养皿盖和瓶子的螺旋盖，将每个无盖的培养皿倒置放置于每个 250 mL 离心瓶底部。
  6. 缓慢向每个瓶子中加入 32 mL 去核培养基（表 1），使培养基流入培养皿并与细胞接触。使用长玻璃巴斯德吸管（其尖端经本生灯火焰弯折）去除培养皿中的气泡。
    注意：必须去除气泡，以确保培养基能够进入培养皿并与细胞充分接触。
  7. 用螺旋盖密封每个瓶子，并将其转移至离心机中。
  8. 在 37 °C 条件下以 8,000 × g 离心 20 分钟，加速度设为最大，减速度设为慢速。注意离心机的平衡：每个瓶子均需配重。如有必要，可通过添加适量体积的去核培养基来调整重量。
  9. 在离心过程中，使用真空泵或 10 mL 血清移液管吸除并弃去 143BTK- rho0 培养板中的培养基，并用 4 mL 不含钙和镁的 1× PBS 清洗两次。
  10. 加入 2 mL 胰蛋白酶，使其完全覆盖细胞单层。
  11. 将培养皿置于 37 °C 培养箱中约 2 分钟。
  12. 从培养箱中取出培养皿，使用倒置显微镜（物镜 4× 或 10×）观察活细胞的脱落情况，并通过加入 2 mL 补充型培养基终止酶活性。
  13. 用 10 mL 移液管吸取培养皿中 4 mL 细胞悬液，转移至 15 mL 锥形管中。
  14. 使用血球计数板（Burker 计数室）或自动细胞计数仪对细胞进行计数。
  15. 离心结束后（步骤 2.8），吸除瓶子中的培养基并弃去。
  16. 将瓶子倒置在预先喷有 70% 乙醇的无菌纱布上，取出培养皿。用 70% 乙醇清洁培养皿及其盖子的外表面，待乙醇挥发后盖上盖子。
  17. 继续操作前，使用倒置显微镜（物镜 4× 或 10×）检查胞质体（“鬼影”细胞）的形成情况。观察因细胞松弛素 B 诱导细胞核排出而导致的极度拉长的成纤维细胞形态。
  18. 向每个 35 mm 培养皿中加入 1 × 106 个重悬于 2 mL 含 5% 胎牛血清（FBS）的 143BTK- rho0 培养基中的 143BTK- rho0 细胞。
  19. 将培养皿置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育 3 小时，使 143BTK- rho0 细胞沉降并附着于“鬼影”细胞上。期间勿扰动培养皿。

3. 去核成纤维细胞与rho 0细胞的融合

  1. 孵育3小时后，吸去并弃去培养皿中的培养基。
  2. 用2 mL无血清的高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）或最低必需培养基（MEM）洗涤贴壁细胞两次。
  3. 吸去并弃去培养基。
  4. 向细胞中加入500 µL聚乙二醇（PEG）溶液（见材料表），准确孵育1分钟。
  5. 吸去并弃去PEG溶液。
  6. 用2 mL无血清的高糖DMEM或MEM洗涤细胞三次。
  7. 加入2 mL融合培养基（表1），在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育过夜。

4. 细胞融合体的筛选与扩增

  1. 过夜培养后，从培养箱中取出培养板，按上述方法消化细胞（步骤 2.9–2.13），并将每个 35 mm 培养皿中的内容物转移至一个 100 mm 培养皿中。
  2. 加入 8 mL 筛选培养基（表 1），将培养皿置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中。
  3. 每 2–3 天更换一次培养基。
  4. 持续筛选约 10–15 天，直至出现细胞克隆集落。
  5. 将四个培养皿中的一个通过收集所有克隆并建立"大量"培养物的方式冻存，作为细胞融合子的备份，以便后续重新克隆和进一步研究使用。
  6. 将剩余培养皿中的细胞进行胰蛋白酶消化，计数后以每皿 50–100 个细胞的密度接种于一个或多个培养皿中，使用补充培养基（表 1），直至克隆出现，继续培养数天。
  7. 在室温下以 1,200 × g 离心 3 分钟，沉淀剩余细胞，并弃去上清液。
  8. 从细胞沉淀中提取 DNA（参见材料表）。
  9. 采用串联重复序列可变数目（VNTR）分析法进行基因分型，方法如先前报道15。
  10. 在体视显微镜下使用克隆环或移液器吸头从培养皿中挑取克隆，避免不同克隆混合，然后将其转移至 96 孔板中，每孔含有 200 µL 补充培养基（表 1）。
  11. 扩增每个克隆，直至获得足够数量的细胞用于冻存和 DNA 提取。
  12. 通过限制性片段长度多态性（RFLP）或其他测序方法验证每个克隆的突变比例。理想情况下，应获得含有野生型线粒体 DNA（0% 突变）的克隆，以及含有不同突变比例的克隆，最终获得纯合突变型线粒体 DNA（100% 突变）的克隆。细胞融合子构建流程的示意图见图 1。

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结果

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构建胞质杂交细胞（cybrids）需要3天的实验操作，加上约2周的筛选期，以及额外1至2周的克隆生长周期。关键步骤在于胞质体（cytoplasts）的质量以及筛选阶段。胞质杂交细胞的形态与rho0供体细胞相似。必须对胞质杂交细胞中的线粒体DNA（mtDNA）和核DNA（nDNA）进行正确鉴定，以确认细胞身份。如图2所示，本例中我们从一名携带异质性m.3243A>G突变患者的成纤维细胞出发构建了胞质杂交细胞，该突变是最常见的与线粒体肌病、脑病、乳酸酸中毒及中风样发作（MELAS）相关的mtDNA突变之一。VNTR分析显示，胞质杂交细胞的nDNA与rho0细胞一致（图2A），证实患者原有的nDNA已被143B细胞基因组所取代。可通过限制性片段长度多态性（RFLP）分析和/或测序分析来检测mtDNA突变的存在及其异质性水平（图2B、C）。

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讨论

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线粒体DNA（mtDNA）的突变率远高于核DNA（nDNA），原因是缺乏保护性的组蛋白，且其位置靠近呼吸链，使该分子暴露于氧化损伤效应中，而修复系统无法有效抵消这种损害。16. 首个致病性线粒体DNA突变于1988年被发现17,18，此后，已报道了大量突变。NGS技术是筛查整个线粒体基因组并快速识别变异的有效方法。14然而，评估一种从未被描述过的线粒体DNA突变的致病作用具有挑战性，仍然依赖于 "传统式" 如本方案中所述的细胞融合杂交细胞的生成方法11,12,13此处所述的胞质杂交体生成方法重现了King和Attardi最初描述的实验方法。5然而，其他方案包含一些细微的修改，主要...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究在Mariani基金会资助的线粒体儿科疾病研究中心（http://www.mitopedia.org）进行。VT是欧洲罕见神经肌肉疾病参考网络（ERN EURO-NMD）成员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-溴-2'-脱氧尿苷Sigma-Aldrich (Merck)B5002-500MG
6 孔板Corning3516
96 孔板Corning3596
血液与细胞培养 DNA 提取试剂盒QIAGEN13323
离心机Beckman CoulterAvanti J-257,200 rcf，37 °C
离心瓶，250 mLBeckman Coulter356011
来自德氏霉菌（Drechslera dematioidea）的细胞松弛素 BSigma-Aldrich (Merck)C2743-200UL
透析胎牛血清（FBS）Gibco26400-036 100mL
高糖 DMEM 培养基（不含 L-谷氨酰胺，含丙酮酸钠）EuroCloneECB7501L
杜氏磷酸盐缓冲液 - PBS（不含钙、不含镁）EuroCloneECB4004L
无水乙醇Carlo Erba414601
FetalClone III（牛血清制品）Cytiva - HyClone LaboratoriesSH30109.03
玻璃巴斯德吸管VWRM4150NO250SP4
用于活细胞显微成像的倒置研究显微镜NikonECLIPSE TE200
JA-14 固定角铝制转子Beckman Coulter339247
实验室高压灭菌器 Vapormatic 770Labotech29960014
L-谷氨酰胺 200 mM（100 倍浓缩液）EuroCloneECB 3000D
最低必需培养基（MEM）EurocloneECB2071L
MycoAlert 支原体检测试剂盒LonzaLT07-318
聚乙二醇溶液（PEG）Sigma-Aldrich (Merck)P7181-5X5ML
青霉素-链霉素溶液（100 倍浓缩液）EuroCloneECB3001D
Primo TC 培养皿 100 mmEuroCloneET2100
Primo TC 培养皿 35 mmEuroCloneET2035
丙酮酸钠 100 mMEuroCloneECM0542D
体视显微镜NikonSMZ1000
HBSS 中的 2.5% 胰蛋白酶EuroCloneECB3051D
尿苷Sigma-Aldrich (Merck)U3003-5G

参考文献

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DNA

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