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切片胚胎鸡听觉脑干以评估音调拓扑梯度与微环路

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DOI：

10.3791/63476

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2022年7月12日

 ,  ,  , 
1Roxelyn and Richard Department of Communication Sciences and Disorders, Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center, Northwestern University, 3Department of Neurobiology, Northwestern University

本文内容

摘要

本文介绍了一种获取鸡胚非冠状位听觉脑干切片的实验方案，用于在单个脑干切片中研究听觉频率拓扑特性（tonotopic properties）及发育轨迹。这些切片包括矢状面、水平面以及水平/横断面切片，相较于传统的冠状切片，可在单个切片平面内涵盖更大的频率拓扑区域。

摘要

鸡胚是一种被广泛接受的动物模型，用于研究听觉脑干，其由高度特化的微环路和沿声调拓扑轴（即频率轴）不同定向的神经元拓扑结构组成。声调拓扑轴使得高频声音在头侧-内侧区域分离编码，而低频声音则在尾侧-外侧区域编码。传统上，胚胎组织的冠状脑干切片可用于研究相对独立的等频率层。尽管这种方法足以探讨与单个等频率区域相关的解剖学和生理学问题，但在研究更大范围听觉脑干区域内声调拓扑变异及其发育过程时仍存在一定局限性。本方案介绍了涵盖鸡胚脑干下部更大频率梯度区域的脑干切片技术。采用不同的鸡胚听觉脑干切片方法，可在单个脑干切片内进行电生理和解剖学实验，从而更好地保留声调拓扑特性及发育轨迹，相较于冠状切片具有明显优势。多种切片技术的运用有助于更深入地探究听觉脑干微环路在解剖结构、生物物理特性以及声调拓扑特性方面的多样性。

引言

鸡胚是研究细胞生物学、免疫学、病理学以及发育神经生物学等多个不同科学领域基本生物学问题的重要研究模型。鸡听觉脑干的微环路是高度特化环路的典型范例，可通过听觉形态学和生理学加以理解。例如，Rubel 和 Parks（1975 年）首次描述了鸡的耳蜗核团（nucleus magnocellularis, NM）和核层状体（nucleus laminaris, NL）的音调拓扑取向（即频率梯度），其在核团轴向上呈线性分布，并相对于矢状面倾斜约 30°。NM 和 NL 中的单个神经元沿喙-内侧至尾-外侧区域编码其最佳声频率，即特征频率（characteristic frequency, CF）。对高频敏感的神经元位于喙-内侧区域，而对低频敏感的神经元则位于尾-外侧区域。因此，传统上研究听觉脑干组织音调拓扑特性的解剖方法均采用连续的冠状切片。事实上，发育中鸡胚的听觉微环路已被确立为研究音调拓扑听觉功能信号处理的模型系统，数十年来一直通过从尾侧至喙侧的连续冠状面脑干切片进行研究1,2,3,4,5,6。

然而，NM 和 NL 的拓扑组织在结构和形态上较为复杂。听觉神经输入的分布方式表现为：高特征频率（CF）输入终止于类似端球的结构，这些结构至少覆盖无树突 NM 细胞胞体周长的四分之一；相反，低 CF 输入并不形成端球样终末，而是以多个小结样突触分布在 NM 神经元的树突上；中等 CF 输入则同时以端球样和小结样突触终止4,7,8,9,10,11,12。在 NL 中，高度刻板的树突梯度不仅体现在树突长度上，也体现在树突宽度上。这种独特的树突梯度与频率拓扑轴密切相关。从高 CF 到低 CF 神经元，其树突长度增加约 11 倍，宽度增加约 5 倍6。为了克服这些核团在冠状切片中分布复杂的难题，本方案描述了矢状面、水平面以及水平/横断面的解剖方法。这些切片技术可提供在单一切片平面上展现出最大频率拓扑特性的听觉脑干组织样本。

方案

所有实验程序均经西北大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》进行。脑干组织的解剖与制备方案遵循既往已发表的方案5,13。

1. 卵的处理

  1. 从经IACUC批准的本地动物供应商处购买受精卵（Gallus gallus domesticus）。
  2. 收到卵后立即在14 °C的冰箱中储存，并在5天内开始孵化。
    注意：胚胎活力在1周后会显著下降。
  3. 在38 ± 1 °C、相对湿度约50%的条件下孵化前，用70%乙醇对卵进行消毒。

2. 人工脑脊液（ACSF）的成分与配制

  1. 将以下化学品混合于 1 L 的 18.2 MΩcm 去离子水中2O 制备10倍浓缩人工脑脊液（ACSF）储备液：NaCl（氯化钠）130 mM，NaHCO₃3 （碳酸氢钠）26 mM，KCl（氯化钾）2.5 mM，NaH2PO4 （磷酸二氢钠）1.25 mM，葡萄糖（D-(+)-葡萄糖）10 mM。将储备液保存在冰箱中。
  2. 准备 MgCl₂2 （氯化镁）1 M 和 CaCl2 (氯化钙) 1 M 溶液分别溶于 18.2 MΩcm 的去离子水2O，并置于冰箱中保存。
  3. 使用前立即将10倍浓度的ACSF稀释至1倍浓度，并持续用95% O₂和5% CO₂混合气体饱和平衡2/5% CO₂2 15-20 分钟，然后加入 MgCl2 和 CaCl2. 配制人工脑脊液（ACSF）和解剖用ACSF（dACSF），调节至终浓度为 Mg2+ 1 mM，Ca2+ 3 mM 和 Mg2+ 3 mM，Ca2+ 1 mM，分别。
  4. 调节人工脑脊液的气泡速率，使其pH值维持在7.2–7.4，渗透压介于300至310 mOsm/L之间。
    ​注意：在持续通气过程中将ACSF置于冰浴中，有助于维持溶液的低温状态，从而在解剖过程中保护组织的结构完整性。

3. 琼脂糖（5%）凝胶块制备

  1. 将5 g琼脂糖加入100 mL的dACSF中，使用100 °C水浴或微波加热2-3分钟，每30秒搅拌一次以防止结块，直至琼脂糖完全溶解并开始冒泡。
  2. 将融化的琼脂糖倒入空的培养皿中，厚度约为5 mm，在室温下静置凝固。凝固后用封口膜密封培养皿，并于4 °C保存。
  3. 用锋利刀片将琼脂糖切成立方体小块，在解剖时使用。

4. 解剖方案及听觉脑干的分离

  1. 使用70%乙醇溶液喷雾清洁解剖区域。
  2. 将支撑用或斜角琼脂糖块粘附到振动切片机载物盘上。
  3. 选择所需日龄的卵（本方案中为 E20 和 E21）。按照上述第1步所列的方案进行操作和孵化。
  4. 通过将鸡蛋置于明亮光源下（照蛋）并观察鸡蛋较大或较圆一端的气室，来确定气室的位置。
  5. 将鸡蛋置于室温下平衡，于气室上方敲破蛋壳，暴露膜囊。
  6. 在囊上做一轻柔切口以暴露喙部。
  7. 用手术刀轻轻将颈部和头部从蛋中取出。
  8. 使用锋利的剪刀迅速剪下头部。
  9. 断头后，用冰冻的dACSF清洗头部，以去除解剖垫上的多余血液。
  10. 将头部固定在冰冻的dACSF中，进行前后方向的切口。切口始于双眼后方正中位置，并沿所取颈部长度继续向后切开。
    注意：较年轻的胚胎在切开时可能需要施加较小的压力。
  11. 分离皮肤以暴露颅骨。
  12. 从正中向侧方沿眼后方切开颅骨，两侧半球均需进行此操作。
    注意：此步骤有助于将颅骨的吻侧部分与附着的脑组织分离，同时保持脑组织完整5.
  13. 切下颅骨的吻侧部分。将刀片置于眼睛后方，迅速切割。
    注意：切割附着的颅骨时可能需要用力才能切得整齐。
  14. 将头部浸入盛有冷dACSF的培养皿中。
  15. 使用小型剪刀，在颅骨尾侧区域沿中线向侧方进行剪切，以尝试在不造成组织损伤的情况下将脑组织与颅骨分离。
  16. 轻柔暴露脑干和小脑。向后牵拉整个颅骨的背侧部分，小心移除脑干，并借助细毛刷轻柔刮除覆盖物以充分暴露脑干。使用弯头镊子清除脑干周围的结缔组织和血管。特别注意第8对th 颅神经区域，并确保两侧均保留一小段完整的神经纤维。
  17. 通过切断脑桥并小心移除血管，将脑干与小脑分离。修整脑干，去除多余的血管。
    注意：确保整个操作过程始终在持续通入碳氧混合气（95% O₂ 和 5% CO₂）的冰冻脱氧人工脑脊液（dACSF）中进行。2/5% CO₂2).

5. 振动切片机切片

注意：在以下步骤中，必须使用一块立方形琼脂糖支撑组织的背面。

  1. 将振动切片机刀片沿水平轴放置，并将脑干固定在切片托盘上。固定脑干的吻侧，使吻尾轴保持垂直，以制备冠状切片。
    1. 制备矢状切片时，保持内外侧轴垂直。
    2. 固定脑干的腹侧，使背腹轴保持垂直，以制备水平切片。
  2. 为获得急性角度的矢状-水平切面，将脑干的腹侧固定在琼脂糖块的斜面表面（该斜面以45°角切割），使腹背轴在该斜面上保持垂直。将琼脂糖块的另一表面朝向切片托盘固定，并使吻尾轴与刀片边缘平行。

6. 处理脆弱或较大的脑干组织样本

  1. 在步骤5的另一种方法中，将分离的脑干浸入盛有35 mm × 10 mm培养皿的4%低熔点（LMP）琼脂糖溶液中，温度约为40 °C。
    1. 将琼脂糖倒入浸没的脑干后，将培养皿置于冰上使其凝固。使用锋利的剃须刀片切割包含脑干的立方形琼脂糖块。
  2. 将LMP琼脂糖块的头端朝下粘附固定，使脑干的头-尾轴保持垂直。
    1. 连续切取冠状面切片，直至可见NM区域。
    2. 用锋利刀片将琼脂糖块从胶上取下。为定位核团，用细针在NM区域轻轻滴加0.5 µL染料（甲苯胺蓝或橙G）。
    3. 将该琼脂糖块重新安装至切片托盘，进行矢状面或水平面切片，并参照染色区域确定核团位置。
  3. 为获得最佳效果，设置振动切片机的切片速度为4 - 5（约30 ± 4 mm/min），振动频率为85–87 Hz，切片振幅为4–6（约1 ± 0.2 mm）。
  4. 脑干切片完成后，将连续收集的200–300 µm切片置于 commercially available 切片孵育室中，在室温下用持续通入95% O2/5% CO2混合气体的ACSF溶液平衡1小时（pH 7.2–7.4，渗透压300–310 mOsm/L）。在此条件下，切片可保持活性达5–6小时。

7. 电生理学：膜片钳技术

  1. 将脑干切片转移至记录室，并持续灌注含碳合气体的ACSF，流速约为1.5 ± 0.5 mL/min。
  2. 使用微电极拉制仪制备膜片电极，使其尖端直径为1–2 µm，电阻范围为3–6 MΩ。
    1. 用基于K-葡萄糖酸的内液填充电极（用于电流钳记录）。
  3. 为检测切片内不同拓扑区域神经元的特性，定位切片平面两端的神经元，并用记录电极接近目标神经元。
  4. 在接近神经元时，保持电极尖端正压。
  5. 移动电极直至在神经元表面观察到压痕。随后迅速执行接下来的两个步骤。
  6. 通过释放正压形成吉欧姆（1 GΩ）密封。
  7. 将放大器设置为电压钳模式，并将电极偏移调零至0 pA。运行封接测试（100 Hz下施加10 mV测试脉冲），然后施加负压以破裂小片神经元膜。
  8. 为检测听觉神经元的主动内在特性，施加超极化和去极化胞体电流注入。
    注意：该操作的示例可在补充视频S1 、S2中查看。该操作的详细信息见视频图注。

结果

本文所示的所有脑干切片均取自脑干组织（约200–300 μm），使用5倍物镜和微分干涉差（DIC）光学系统进行成像。相机安装在解剖显微镜上，并连接至配备图像采集软件的计算机（见材料表）。这些图像的卫星插图（右侧面板）使用60倍水浸物镜拍摄。在获取数字图像时，需确保脑干切片的所有区域均以相同的放大倍数成像。照片在最佳亮度和焦距下拍摄。脑干切片的数字图像根据重叠区域进行平面拼接，并导入台式计算机，进一步调整亮度、对比度和灰度。鸡听觉脑干的基本微环路根据先前的研究1,2,5,13进行鉴定。在显微镜下（5倍物镜），听觉核团被识别为位于切片背侧区域、同侧和对侧核团周围致密髓鞘化神经纤维相邻的区域。

图1 显示脑干组织的传统冠状切面（200-300 µm) 来自E21鸡胚。此处所示的四个冠状切面代表听觉脑干核团中相对的等频率区域，从最低特征频率（CF）的听觉区域（图1A，从尾外侧逐渐进展至最高特征频率的听觉区域（图1D，前内侧）。对于全部四个冠状切片 图1A-D，标记的NM和NL区域的放大图显示在中间一列，右侧为该图面板中相应区域的更高倍放大图（卫星插图中的a和b，分别使用60倍物镜放大）。图中的箭头指向 图1A，B 显示听觉神经纤维的输入，箭头所示为切片左侧NM轴突的分叉。 图1C 显示另一种禽类耳蜗核结构，称为角状核（nucleus angularis, NA，左侧箭头和右侧箭头所示）。最靠吻侧的两个冠状切面显示位于冠状切面腹外侧区域的上橄榄核（superior olivary nucleus, SON）图1C，D，白色虚线圆圈）。

图2 显示脑干组织的矢状切面（200-300 µm) 来自E21鸡胚。对于所有三个矢状切面（图 2A-C），标记的NM和NL区域在图中面板的中间列中显示，并在图中右侧（卫星图像中的a和b）以60倍物镜放大显示。NM和NL的定位依据为听觉神经纤维（图 2A, 中间箭头）进入在较高放大倍数下观察到的神经元簇（图2A，中等、小型白色虚线圆圈和箭头）并标示听觉区域的起始点（图 2A，左侧，大白色虚线圆圈及箭头所示）。SON 在最外侧切片的前外侧区域被识别（图2A，小的白色虚线圆圈。 图2B 沿喙尾轴显示出包含来自NM和NL的相对低特征频率（CF）和高特征频率（CF）听觉区域的扩展拓扑区域（白色轮廓区域，另见卫星插图）。 图2C 显示 最内侧切片中同侧与对侧的轴突簇以及听觉区域的终点（左箭头和中箭头）。此处所示切片的方向与传统切片方向不同，传统切片方向如图所示 图1 即冠状面。此方向用于展示最有利于进行电生理记录时玻璃微电极接近的取向。

为证实耳蜗拓扑轴的较大区域在其中有所表征 图2B对NM神经元进行电流钳电生理记录。 图3 显示从冠状切片记录的大鼠成熟（E21）NM神经元的功能相似性与差异图3A，B) 以及一个矢状切面（图 3C，D, 补充视频 S1, S2). 从冠状切片的内侧端和外侧端各选取一个NM神经元（切片类似于图中所示） 图1B），并在矢状切片中从NM的头端和尾端各选取两个NM神经元（如图示切片所示） 图2B). 图 3A，B 对躯体电流注入（-100 pA 至 +200 pA，+10 pA 递增，持续时间 100 ms）表现出相似的电生理反应特性。这两种NM神经元在此切片平面上的放电模式存在细微差异，提示中频NM神经元具有相对的等频率层状结构。 图3C，D 表明放电模式在头-尾轴上存在显著差异，提示来自低频听觉神经元（NM）的拓扑频率梯度相对较高图 3C) 到一个高频NM神经元（图3D）。两个神经元均表现出 具有此前报道的典型放电模式14,15.

图 4 显示脑干组织的水平切面（200-300 µmE21 鸡胚的水平切片（图4A，B），标记的NM和NL区域的放大图像分别显示在中间一列，以及图中右侧（卫星插图中的a和b，分别以60倍物镜放大）。在水平切片中，NM和NL朝向中线分布，神经元沿外侧-内侧轴展开图 4A，B, 中部，白色虚线区域）。放大图像显示了频率拓扑梯度的广泛分布。低频神经元位于尾侧外侧区域，而高频神经元位于头侧内侧区域（图 4A，B，右侧，卫星区）。沿头尾轴穿过中线走行的纤维显示了听觉核团的对侧连接，但这些纤维的排列并不处于一个简单的平面内。然而，从水平/横断面进行急性角度切割，可使这些轴突纤维朝矢状面方向延伸。切片厚度为200-300 µM 以锐角切取厚的脑干组织（45°) 来自水平面的角度如图所示 图5. 听觉脑干核团可见于从最外侧切片延伸至最内侧切片的广阔对角线区域（图5A-C，标记的中间面板，白色轮廓区域）。此外，NM 和 NL 区域的角度方向也可以在连续的不对称切片中可视化（图 5A-C, 标记的中间面板，白色虚线框区域）。放大图像（60倍物镜）显示听觉核团的音调定位轴沿头侧-内侧至尾侧-外侧轴走行（图 5A-C，右侧，卫星图插图）。切片的方向在 图5 与……相似 图2它们与传统的图像呈现方式不同，但更适合用于电生理学实验。

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图1：脑干的代表性冠状连续切片。 (A-D左侧：从尾侧到头侧轴向的切片， 听觉核团及连接纤维以白色虚线圆圈标出。中间插图为听觉区域的放大视图，其中核团显示在白色虚线圆圈内 a：NM 和 b：NL。箭头指示听觉神经传入纤维，箭头尖指示NM轴突的分叉处 A，B。 箭头指示 NA 的位置 C。侧方白色虚线圆圈显示视上核（SON） C,D右图：卫星插图显示了60倍物镜下的这些细胞核： a：NM 和 b：NL。缩写：NM = 多大核；NL = 层状核；NA = 角状核；SON = 上橄榄核；LF = 相对低频神经元；MF = 中频神经元；HF = 高频神经元；D = 背侧；L = 外侧；V = 腹侧。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图2脑干代表性矢状连续切片。 (A-C左侧：从外侧到内侧轴向的切片 听觉核团以白色虚线圆圈标出。中间插图为同一听觉核团区域的放大视图，以白色虚线圆圈标记。A切片中央的白色虚线圆圈标示视上核（SON）；箭头指示听觉神经纤维，箭头末端指示NA。切片右侧尖端的黑色斑点为成像伪影。在两个切片中，听觉区域背侧均可见小脑区域。 A 和 B 在左侧面板中。B) 在切片过程中将方向由矢状面调整为冠状面的切片。用蓝色染料标记听觉区域（黑色箭头），随后再次按矢状面进行切片。A-C) 中间插图显示 NM 和 NL 区域，以白色虚线标出。右侧：卫星视图显示 a：NM 和 b：在60倍物镜放大下观察到NL。听觉核团中的低频（LF）和高频（HF）拓扑梯度沿头尾轴显示。箭头指向（中的深色区域C) 显示 具有厚髓鞘的NM纤维穿过中线沿内侧轴横向走行，连接双侧听觉核团。缩写：NM = 多形细胞核；NL = 层状核；NA = 角状核；SON = 上橄榄核；LF = 相对低频神经元；HF = 高频神经元；D = 背侧；V = 腹侧；R = 头侧；C = 尾侧。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图3：电流钳模式下神经元对胞体电流注入（−100 pA 至 +200 pA，步长 +10 pA，持续时间 100 ms）的电生理记录。在同一个脑片中，选择位于NM区域两端极端位置的神经元进行记录。（A,B）单个冠状切片中代表性神经元反应，显示相对相似的等频率特性，但存在细微差异。反应特性来自同一冠状切片中最内侧（A）和最外侧（B）区域记录的两个不同中频神经元。（C,D）单个矢状切片中的代表性神经元记录。记录显示相对低频的NM反应（C）和高频的NM反应（D），突显了在单个矢状切面上音调拓扑梯度的显著差异。缩写：NM = nucleus magnocellularis；LF = 相对低频神经元；MF = 中频神经元；HF = 高频神经元。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图 4脑干代表性水平连续切片。 (A,B左侧：沿背侧至腹侧轴向的切片，听觉核团以白色虚线圆圈标出。8th 颅神经传入纤维连接被箭头标记的听觉核团。中间插图为听觉核团区域的放大视图，听觉核团位于白色虚线下的NM和NL区域中。在图中可清晰观察到听觉核团的拓扑性排列。 A，B. (A,B) 右：显示大范围卫星视图 a：NM 和 b：NL。右侧插图显示在60倍物镜放大下观察到的听觉核团，以及从低频（LF）到高频（HF）沿尾外侧至头内侧轴呈弯曲拓扑排列。缩写：NM = 多形核；NL = 层状核；LF = 相对低频神经元；HF = 高频神经元；L = 外侧；R = 头侧；C = 尾侧。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：代表性水平/横断面急性斜向（45°）连续切片。（A-C）左侧：脑干的连续切片，听觉核团以白色虚线圆圈标出。中间插图为听觉区域的放大视图。（A）中间插图显示在这些切片中NM与NL神经元分布范围最大。（B,C）中间插图：与（A-C）相比，以白色虚线标记的听觉核团显示出逐渐的拓扑变化。右侧：卫星插图，显示在60倍物镜放大倍数下的听觉核团a：NM 和 b：NL。NM与NL中从低频（LF）到高频（HF）区域的拓扑轴在由外侧至内侧的切片中呈角度旋转。缩略词：NM = 疣状核（nucleus magnocellularis）；NL = 层状核（nucleus laminaris）；LF = 相对低频神经元；HF = 高频神经元；V = 腹侧；R = 头侧；D = 背侧；C = 尾侧。 请点击此处查看该图的高清版本。

补充视频 S1：超极化和去极化胞体电流注入。 在电流钳模式下，对同一矢状位脑干切片中选取的低频和高频神经元施加持续100 ms的胞体电流注入，记录其响应特性。电流注入范围为-100至+200 pA，以+10 pA为步长递增。当施加足够强度的去极化电流脉冲时，可观察到动作电位的产生。该视频对应于图3C中所示的最终记录迹线。请点击此处下载该文件。

补充视频 S2：超极化与去极化胞体电流注入。 与补充视频 S1类似，本视频展示了在电流钳模式下，低频和高频神经元对持续100 ms的胞体电流注入的响应特性。神经元选自同一矢状位脑干切片。电流注入范围为从 -100 到 +200 pA，以 +10 pA 为步长递增，持续时间为 100 ms。当施加足够强度的去极化电流步阶时，可观察到动作电位的产生。该视频对应于图3D中所示的最终记录迹线。请点击此处下载此文件。

讨论

数十年来，鸡胚脑干组织的冠状切片一直被用于研究相对独立的等频率层1,2,5。然而，鸡听觉脑干的拓扑频率（即频率）组织在结构上较为复杂，其研究可能因具体科学问题的不同而在其他解剖轴向上更为便利。尽管冠状切片足以用于探讨与单个等频率区域相关的解剖学和生理学问题，但在研究较大范围听觉脑干区域内频率拓扑变化及其发育过程时，冠状切片存在一定的局限性。为克服这一限制，本实验方案描述了在矢状面、水平面以及水平/横断面方向上的切片方法，以提供额外的听觉脑干组织切片示例，这些切片可在单个脑干切片中更充分地展示最大化的频率拓扑特性及梯度分布。

听觉脑干区域的矢状切面显示，与冠状切面相比，不同拓扑区域在切片内分布于更大的范围（矢状听觉区域约300-600 µm，冠状听觉区域约200-350 µm）。例如，在矢状切面中，NM和NL区域在头尾轴方向上可视化的范围更大（如图2B所示），并且沿此解剖轴分布的功能性拓扑梯度在单个矢状切片中基本完整保留。这一点通过电流钳记录进一步证实，记录显示神经元内在特性在头尾梯度方向上存在差异，与先前报道一致14,15（如图3C、D所示）。未来研究若能在单个矢状切片平面内突出显示沿拓扑轴的解剖学和免疫组织化学特性，将有助于进一步探究已知的听觉特性梯度。这些特性包括但不限于MAP2染色和钾通道表达模式，这些均为已知的NM和NL树突结构及内在特性的梯度特征，此前已在连续冠状切片中得到证实16。

听觉脑干区域的水平切面显示，NM和NL位于靠近中线的位置。部分听觉轴突纤维以对角线或垂直于水平面的方向走行（图4）。通过制作与矢状面成45°锐角的切片，可以追踪这些纤维。所得的水平/横断切片比矢状切片或传统水平切片更大，且在同侧和对侧均可见沿前后轴走行的长轴突纤维。NM和NL可在较大的对角区域（约400–700 µm）内同时被观察到，从而使得沿外侧-内侧轴的对侧连接得以显现。此外，水平/横断切面还显示了听觉区域及其形成的音调拓扑梯度如何呈现角度转折（图5）。在更大范围内以角度暴露对侧连接，使这类切片相较于传统的冠状切片更适用于电生理刺激和微环路研究。

其他优势
听觉微环路的形成需要在时空上协调多种信号，以促进神经元存活、突触发生、轴突分化、树突结构构建以及成熟过程。因此，鸡胚脑干切片中的听觉微环路可用于以下研究方向：不同拓扑维度下神经元的形态学组织；所有听觉和前庭核团连接组的构建与图谱绘制；等频率平面及音调拓扑平面上环路组分活动模式的识别与表征；兴奋性与抑制性微环路的拓扑组织及其与特化神经元群体（核团）的关系；听觉核团神经元的空间定位及其对特征频率（CF）的预测能力17；特定音调拓扑神经元类型的系统性靶向研究；前体细胞的追踪及其向保守核团发育的过程；细胞的遗传谱系与神经环路演化的关系18；不同物种间脑干解剖结构的比较；前庭环路（如Deiter's前庭复合体（DC））的研究19；以及前庭核团之间的同步性与交叉对话。

采用不同切片平面的多角度方法可能有助于回答关于脑干微环路未知的解剖学和生物物理特性的基本问题。一个典型的例子是主要听觉核团（NM、NA、NL 和 SON）与前庭核团（包括外侧丘系背侧核（LLDp）、半月核（SLu）20 和切向核（TN）3）之间的关系。然而，本实验方案及基于切片的研究仍存在一定的局限性。

注意事项与局限性
根据进行实验的机构不同，伦理准则以及鸡胚的操作方法可能有所差异。尽管美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》允许快速断头法，但鸡胚安乐死亦存在其他替代方法21。早期发育阶段的鸡胚脑干组织相较于较晚期的胚胎更为柔软且脆弱，其表面存在多个连接结构和血管，在去除时需格外小心。组织应保存在冰冻的dACSF中，并以95% O2/5% CO2 气体持续灌注，以提高组织活性。

矢状切片法仅适用于同侧耳蜗拓扑定位。与冠状切片相比，该切片方法获得的切片更大，操作时可能较为困难。然而，可采用其他文献中详细描述的交叉针法对切片进行修整22。使用4%低熔点琼脂糖包埋脑干可保护切片中的精细结构，但需注意避免倾倒温度过高的琼脂糖。将包埋好的脑干置于低温环境中约1分钟以快速凝固，有助于提高切片用于电生理记录的可行性。

过量使用万能胶可能具有毒性，必须尽量少用，多余的胶应立即通过更换dACSF清洗掉。对于急性斜切（45°）切片，琼脂糖块切割角度至关重要；切割时可使用镜子观察琼脂糖块前端角度，同时用锋利刀片进行切割。市售刀片可能带有蜡涂层，使用前应以酒精擦拭并干燥。由于轴突纤维束比皮层或基质组织更硬，需要优化振动切片机的切割速度和频率。保持高振幅并使用冷却的解剖液有助于防止组织损伤。

所有溶液均应新鲜配制，且在95% O2/5% CO2 混合气体饱和后，再向人工脑脊液（ACSF）中添加Ca2+和Mg2+，否则可能导致Ca2+沉淀。在振动切片机中操作脑片时应使用画笔轻柔处理。尽量将总切片时间控制在15分钟以内。可使用玻璃巴斯德吸管移动脑干切片。

请勿使用洗涤剂或腐蚀性清洗剂清洗用于电生理实验切片且会接触切片的玻璃器皿和设备。所拍摄的图像代表了在微分干涉差（DIC）光学显微镜下200-300 µM厚组织的外观。其视觉质量将低于免疫组织化学或电子显微镜，但能准确反映实验人员在进行电生理记录时所观察到的实际视野。

关于鸡听觉脑干中沿替代解剖轴（如背腹轴、头尾轴或同侧-对侧轴）发育的微环路早期发育的研究较为有限。其原因之一在于，转录编码及其对脑干内音调拓扑发育调控作用的机制尚未完全阐明。在观察神经活动时，诸如自上而下的调控和自发性活动等功能性现象常常难以捕捉。 体外。然而， 体内 研究还辅以仅在这些脑片条件下才可能实现的特异性和直接的单神经元记录。通过沿不同方向获取脑干组织的技术优化，可为鸡听觉脑干微环路中频率拓扑梯度的发育与复杂性提供深入见解。

披露

所有作者声明，本研究是在无任何商业或财务利益的情况下进行的，且他们不存在任何利益冲突。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院/国家耳聋与其他沟通障碍研究所（NIH/NIDCD）R01 DC017167 基金资助。 我们感谢 Kristine McLellan 对本论文早期版本提供的编辑意见。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Adobe Photoshop 2021Adobe
防震台 30"x 36" - OTMC - 63533TMC
CellSens Standard 软件OLYMPUS
Digidata 1440AMOLECULAR DEVICES
数字放大器 Multiclamp 700BMOLECULAR DEVICES
DSK 切片机 LineaRazor Pro7TED PELLA, INC
显微操作器 MPC-385 / OSI-MPC-385-2OLYMPUS AMERICA INC
微电极拉制仪 P-97SUTTER INSTRUMENTS
显微镜 BX51W1OLYMPUS AMERICA INC
MS ICE 软件Microsoft Corporation
Ohaus 天平 AV212 型Ohaus Adventurer
奥林巴斯 DPSI0 /DPS80 相机OLYMPUS
pClamp 和 Axoclamp 数据采集软件MOLECULAR DEVICES
pH 计 Lab 850 台式SCHOTT INSTRUMENTS
锋利不锈钢刀片Dorco/Personna
蒸汽压渗透压计 5600 型WESCOR INC
纯水系统 Smart2pure 6UV/UFThermo Scientific
化学品列表
低熔点琼脂糖 IB70051IBI SCIENTIFIC
CaCl2（氯化钙）ACROS organics
Cynergy 瞬干胶 CA6001Resinlab
右旋葡萄糖（D-(+)-葡萄糖）VWR Life Science
乙醇IBI SCIENTIFIC
KCl（氯化钾）Amresco.Inc
MgCl2 （氯化镁）Sigma-Aldrich
NaCl（氯化钠）Amresco.Inc
NaH2PO4（磷酸二氢钠）Amresco.Inc
NaHCO3（碳酸氢钠）Amresco.Inc

参考文献

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