小鼠腹腔细菌感染模型中脾脏微囊泡的分离

摘要

从质膜脱落的微囊泡可作为细胞效应因子。脾脏微囊泡（SMVs）是病理生理状态的替代标志物。在大鼠和小鼠中，SMV的含量和特性可表征衰老或炎症状态，并可因细胞保护性治疗而发生改变，使其成为临床前研究中一种有价值且易于获取的监测工具。

摘要

微囊泡（MVs）是活化细胞质膜释放的亚微米级片段，具有促炎性和促凝血性的细胞效应功能。在大鼠中，脾脏微囊泡（SMVs）是病理生理状态的替代标志物。此前 体外 研究表明 牙龈卟啉单胞菌 (P. gingivalis），一种主要的牙周致病菌，能够 内皮细胞脱落和凋亡，而脂多糖（LPS）则促进脾细胞来源微囊泡（SMVs）的脱落。 在体 研究表明，药物控制SMV释放是可行的。本方案建立了从脾脏中分离SMVs的标准化操作流程。 P. gingivalis 急性小鼠感染模型 P. gingivalis 通过腹腔注射（共注射3次，每次5 x 10）在幼年C57BL/6小鼠中诱导感染⁷ 细菌/周）。两周后，采集脾脏，称重并计数脾细胞。通过蛋白质、RNA和凝血酶原酶活性检测分离并定量SMV。细胞活力通过碘化丙啶或台盼蓝排斥染料法评估。脾细胞提取后，经24小时脾细胞培养，采用流式细胞术获得中性粒细胞计数。在 P. gingivalis注射小鼠的脾脏重量增加了2.5倍，脾细胞数量上升了2.3倍，而中性粒细胞数量则升高了40倍。来自脾脏的脾细胞的细胞活力 牙龈卟啉单胞菌-注射小鼠的MV释放率在75%–96%之间，在无任何显著差异的情况下，24小时培养后较未暴露对照组下降50%。然而，来自注射小鼠的脾细胞通过凝血酶原酶活性检测或蛋白定量测定显示出释放更多的微囊泡（MVs）。数据表明，具有促凝活性的脾源性微囊泡（SMVs）是评估腹腔注射后早期脾脏反应的可靠工具 P. gingivalis 感染

引言

微囊泡（MVs），也称为微颗粒或外泌体，是细胞在多种刺激下释放到体液和细胞外空间的质膜碎片，直径为0.1-1.0 µm。MVs最初被发现是暴露促凝血磷脂（主要是磷脂酰丝氨酸，PSer）的血小板尘状物，可作为凝血复合物组装的额外表面^1,2。循环MVs作为促凝血效应分子的关键作用已在Scott综合征患者中得到证实²，该病是一种罕见的遗传性疾病，表现为PSer暴露功能障碍并伴随出血倾向（补充图1）。MVs已被广泛研究作为与糖尿病、慢性肾病、子痫前期和高血压等心血管疾病相关的慢性疾病中血栓风险的循环生物标志物^3,4。目前，MVs已被认为是在体液或器官组织（如心肌）中具有真实细胞效应功能的分子¹。由于MVs携带活性蛋白、脂质和miRNA，它们可远距离调控血管反应，如止血、炎症、血管生成以及血管生长或组织重塑⁵。

尽管临床研究探讨了微囊泡（MVs）在风险因素方面的预后价值，但从患者体液或组织中分离出的微囊泡能够实现 离体 效应特性的评估

方案

所有实验方案均经当地伦理委员会（APAFIS#28745-2020121815051557）批准，并遵循所在大学及法国国家健康与医学研究院（INSERM）有关动物护理的相关指南。实验使用6至8周龄的雄性年轻C57BL/6小鼠。定期对小鼠进行检查以评估疼痛和应激情况，并每日监测其体重。除非另有说明，所有提取缓冲液和溶液必须无菌且处于室温。

1. 动物准备

1. 每2天对小鼠进行一次腹腔注射牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis，PG），共注射6次，持续2周（每周3次，每次5 × 10⁷个细菌，补充文件1）。
2. 使用100 mg/kg的氯胺酮和10 mg/kg的赛拉嗪联合麻醉小鼠。
3. 对麻醉后的小鼠实施安乐死，并通过剖腹手术取出脾脏。
   ​注：牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）感染的具体条件以及为获取脾脏而进行动物安乐死的操作详见补充文件1中的"动物实验"部分。本方案各步骤的示意图见图1。

2. 脾细胞的提取

1. 使用手术刀在已盛有 3....

结果

所提供的数据全面展示了整个实验过程，使用了两种主要的动物状态：未经处理的对照组年轻C57BL/6小鼠，以及其同窝小鼠在接受为期两周、每2天一次、共六次腹腔（IP）PG注射后的实验组。这些数据还显示了腹腔注射PG后2周对脾脏反应的远端作用。脾细胞微囊泡通过凝血酶原酶酶学检测法进行定量，或通过分光光度法测定其蛋白质和RNA浓度；脾细胞悬液中中性粒细胞的比例则通过流式细胞术^33,38确定（见补充文件1的第2-4节及补充图2）。

脾脏重量和细胞数量在腹腔注射2周后增加 P. gingivalis
在年轻成年小鼠中，注射PG后2周脾脏重量显著增加至2.6倍，可能归因于免疫反应。事实上，脾细胞总数也增加了2.3倍（图2每种条件下 n = 5 只小鼠， .......

讨论

本研究证实，与小鼠血液等其他来源（体积有限）相比，脾脏是具有生理病理学意义的微囊泡（MVs）的主要且可靠的来源。只要采取适当预防措施，该方法易于建立，且无需昂贵设备。由于目前尚无其他替代方法 体内 评估可用的情况下，当前模型似乎是研究前药对微囊泡释放影响的一种有价值的方法。重要的是，本文所展示的小鼠脾脏微囊泡（SMVs）收获的标准化方案，应能满足该领域尚未满足的需求 体内 在注射或鼻腔滴注后，对经基因工程改造的小鼠中SMV介导效应的调控进行研究。

该方法还表明，SMVs 是研究局部感染远端效应的相关临床前工具，例如 P. gingivalis 腹腔感染。事实上，通过多种方法观察到，从SMV中释放出的显著差异 P. gingivalis-处理 与未处理动物的测量结果表明，局部腹腔注射已产生可远距离检测到的影响，且在2周后即可观察到。本实验室使用其他远距离指标获得的初步数据 P. gingivalis 感染部位已确认 P. gingivalis 可在感染后第7天.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 mL Eppendorf管	Dutscher	54816	锥形底部é微量离心管
Allegra 64 R 离心机	Beckman Coulter
自动细胞计数仪	伯乐（Biorad）
牛血清白蛋白	Euromedex	04-100-812-E	经准备后，用0.22 μm滤膜过滤 µm筛网过滤后，4℃保存 °在无菌条件下，使用以下配方：2 mM EDTA、0.5% BSA 和无菌 PBS
CD11（Mac-1）	e-Biosciences	45-00112-80	与 eFluor 450 偶联； λ最大 激发波长 405 nm λ最大 发射波长 445 nm
CD16/32	BD 生物科学	553142	未结合的
EDTA	Calbiochem	Calbiochem	S 6381-92-6
Falcon管	细胞饥饿	227261	50 mL
胎牛血清	Dutscher	S1810-500	批次号 = S14028S1810
Fortessa Aria	BD 生物科学		用于细胞分选
Fortessa 流式细胞仪	BD公司
Fungizone	PAN biotech	P06-01050
HBSS	Gibco	14175-053	不含酚红，不含钙+2 和 Mg+2
ICAM-1	abcam	ab171123
LYG-6（Gr-1）	BD 生物科学	566218	与BUV395偶联； λ最大 激发波长 348 nm， λ最大 发射波长 395 nm
红细胞裂解缓冲液（ACK）	Sigma		经0.22微米滤膜过滤 µm筛网过滤后，4℃保存°在无菌条件下，使用以下公式计算：NH4Cl，0.15 M（摩尔浓度），53.491（分子量）4 g KHCO3 1 mM（摩尔浓度）（分子量 100.115），50 mg EDTA  0.1 mM（摩尔浓度），292.24（分子量），14.6 g pH：7.2–7.4
NanoDrop 1000 分光光度计	赛默飞世尔科技
PBS	Lonza	17-516F	无钙条件下+2  和 Mg+2
塑料培养皿			100 mm
聚苯乙烯管	Falcon	352070
q-纳米金	iZON science
RPMI 1640 培养基：2 g/L 葡萄糖	PAN biotech	p04-18047	添加链霉素（100 U/mL）、青霉素（100 U/mL）、两性霉素B（250 mg/mL）、L-谷氨酰胺（2 mM）和10%胎牛血清。
手术刀
尼龙筛网	Falcon USA	352360	100 µm
链霉素/青霉素	PAN biotech	P06-07100
注射器			2 mL
台盼蓝	伯乐（Biorad）	1450013
VCAM1	abcam	ab215380