在腹膜内细菌感染的小鼠模型中分离脾微泡

Summary

从质膜脱落的微泡充当细胞效应器。脾微泡 （SMV） 是病理生理状况的替代标志物。在大鼠和小鼠中，SMV 含量和特性表征衰老或炎症，并通过细胞保护性治疗而改变，使其成为临床前研究有价值但丰富的监测工具。

Abstract

微泡 （MV） 是从活化细胞质膜释放的亚微米片段，充当促炎和促凝血细胞效应器。在大鼠中，脾脏 MVs （SMV） 是病理生理状况的替代标志物。先前的体外研究表明，牙龈卟啉单胞菌 （P. gingivalis） 是一种主要的牙周病原体，能够促进内皮脱落和细胞凋亡，而脂多糖 （LPS） 有利于脾细胞衍生的微泡 （SMV） 的脱落。体内研究表明了 SMV 脱落的药理学控制的可行性。本方案建立了从牙龈卟啉单胞菌急性小鼠感染模型中分离脾 SMV 的标准化程序。通过腹腔注射 （每周 3 次注射 5 x 10⁷ 个细菌） 诱导年轻 C57BL/6 小鼠牙龈卟啉单胞菌感染。两周后，收集脾脏，称重，计数脾细胞。通过蛋白质、 RNA 和凝血酶原酶测定分离和定量 SMV。通过碘化丙啶或台盼蓝排除染料评估细胞活力。脾细胞提取后，脾细胞培养 24 小时后通过流式细胞术获得中性粒细胞计数。在注射牙龈卟啉单胞菌的小鼠中，观察到脾脏重量增加 2.5 倍，脾细胞计数增加 2.3 倍，而中性粒细胞计数增加 40 倍。来自牙龈卟啉单胞菌注射小鼠的脾细胞活力范围为 75%-96%，培养 24 小时后降低 50%，与未暴露的对照相比，无任何显着差异。然而，通过凝血酶原酶测定或蛋白质测量，注射小鼠的脾细胞脱落了更多的 MV。数据表明，促凝血 SMV 是评估早期脾脏对腹膜内牙龈卟啉单胞菌感染反应的可靠工具。

Introduction

微泡 （MVs），也称为微粒或胞外体，是响应各种细胞刺激而释放在体液和细胞外间隙中的直径为 0.1-1.0 μm 的质膜片段。MV 最初被发现是暴露出促凝血磷脂（主要是磷脂酰丝氨酸 （PSer））的血小板尘埃，构成了凝血复合物组装的额外表面 ^1,2。循环 MV 作为促凝血效应子的关键作用已在 Scott 综合征 2 患者中得到证实，Scott 综合征² 是一种罕见的遗传病，会导致功能失调的 PSer 暴露和出血（补充图 1）。MV 已被广泛研究为与心血管疾病相关的慢性疾病（如糖尿病、慢性肾病、子痫前期和高血压）血栓形成风险的循环生物标志物 ^3,4。它们目前被认为是液体或器官组织（如心肌¹）中的真正细胞效应子。因为它们传递活性蛋白、脂质和 miRNA，所以它们会远程调节血管反应，如止血、炎症、血管生成和血管生长或组织重塑⁵。

虽然临床研究检查了 MV 在风险因素方面的预后价值，但从患者体液或组织中分离的 MV 能够对其效应特性 进行体外 评估⁶。控制 MV 生物发生和串扰能力的机制的破译通常在细胞培养模型中实现，以识别 MV 暴露或封装在 MV 中的活性分子及其下游信号传导。MV 与靶细胞的相互作用将取决于膜蛋白/蛋白质结合（当合适的反配体可用时）和/或脂质融合⁷。

在生理条件下，血浆中循环的 MV 主要来源于维管细胞，由谱系簇分化标志物 （^{CD） 鉴定8,9}。然而，在病理学中，特别是在癌症¹⁰ 和移植物排斥反应^11,12 中，MV 从受损组织中脱落并具有有害的促凝血和促炎特征。这些在体循环中检测到，使其成为监测保护性或年轻化疗法以及可能的药理学靶点的有用探针¹³。由于 MV 作为反映健康和疾病中血管和组织细胞稳态的动态储存池循环，因此在小动物静脉注射或鼻滴注后，还需要在体内更好地了解它们的远程作用^14,15。事实上，MV 被认为是耦合夸张炎症和血栓形成的复杂途径的主要贡献者¹⁶。

牙周炎是一种感染性炎症性疾病，影响牙齿支撑组织^17,18，^并与血栓形成风险有关。它的特点是牙龈出血、牙槽骨破坏、牙齿松动，并最终导致牙齿脱落。牙周炎在世界范围内非常普遍，影响超过 50% 的人口，其中 11% 表现为严重的¹⁹ 型。牙周炎是由龈下生物膜的细菌菌群失调引起的，它维持着加剧的炎症反应，从而引发组织破坏²⁰。在过去的十年中，牙周炎与心血管疾病、糖尿病和类风湿性关节炎等全身性疾病有关。可能的解释是牙周病原体在远处的作用和/或促炎细胞因子（如白细胞介素 （IL-1、IL-6） 和 TNF-α介导的全身炎症增加^21,22。

在与牙周炎发作和发展相关的病原体中，牙龈卟啉单胞菌 （P. gingivalis）²³ 存在于最严重的病变中，这些病变收获了多种毒力因子，包括脂多糖 （LPS）²⁴ 诱导 Toll 样受体 （TLR） 介导的炎症反应²⁵ 以及在初始感染部位募集中性粒细胞和多形核白细胞 （PMN）²⁶。来自牙龈卟啉单胞菌的 LPS 激活 TLR-4 或 TLR-2，促进免疫检测和细菌存活逃避²⁷。在血管水平，LPS 激活 TLR2 与免疫血栓形成有关。P. gingivalis 提示 TLR-2 信号传导的独特能力，而 TLR-4 依赖性识别显著受损，有利于持续性低度感染^28,29。

研究 MV 对低级别病原体慢性和持续感染的反应的体内程序很少。文献中对 tissular MVs 提取的方法描述不佳，通常涉及从实体瘤、肝脂肪变性、动脉粥样硬化血栓形成斑块或移植物等病理组织中收获 MV 11,29,30，而脾脏感知血液中的细菌和病毒。它还储存参与免疫反应的红细胞、血小板、淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。粒细胞（如来自红浆的中性粒细胞）也会产生活性氧 （ROS） 和蛋白酶，从而破坏病原体并防止感染传播^31,32。令人惊讶的是，据我们所知，脾脏 MV 并未在病原体诱导的组织损伤的情况下进行研究。全球存在未满足的需求，需要研究生理病理学中 tissular MVs 的变化。

我们实验室的体外数据表明，LPS 诱导大鼠脾细胞中促凝血 MV 脱落，进而促使培养的冠状动脉内皮细胞衰老和连续的促炎和促炎促凝血内皮表¹¹。在用优化的 omega-3 配方治疗动物后，进一步证明了脾脏 MV 药理学控制的可行性。发现中老年大鼠的口服灌胃对促凝血 MV 从脾细胞脱落及其对冠状动脉内皮的有害特性具有保护作用³³。

与血液相比，脾脏的优势在于它是一个个体白细胞的重要来源。此外，最近提出了脾-心轴 ^3,34，使脾脏成为感染相关心血管风险的可能贡献者，对药物控制有益。SMV 特性或释放的评估是了解病原体诱导或炎症反应的关键。有趣的是，它可以在治疗过的动物和不同的生理病理模型（年龄、高血压、糖尿病）中实现。事实上，通过比较中年和老年大鼠³³，在简单的 24 小时脾细胞培养后可以证明脾 MVs 特性和释放的差异。

鉴于上述证据证明脾脏 MVs 的效应特性随生理病理条件的变化及其在大鼠中进行药理学控制的可行性，本文描述了用于分离小鼠脾脏 MVs 的标准化方案。该程序将更适合对支持 SMV 介导作用的 体内 机制的深入研究，最终在工程小鼠中进行。该程序是使用 牙龈卟啉单 胞菌的局部腹膜内感染在 C57BL/6 小鼠中建立的，以证明病原体对脾脏 MV （SMV） 效应子特性的远程作用。

Protocol

所有实验方案均经当地伦理委员会 （APAFIS#28745-2020121815051557） 以及母校和 INSERM 的动物护理部门批准并遵循相关指导方针。使用雄性年轻 C57BL/6 小鼠，6-8 周龄进行实验。定期检查小鼠以评估疼痛和压力，并每天监测它们的体重。除非另有说明，否则所有提取缓冲液和溶液都必须在室温下无菌。

1. 动物准备

1. 每 2 天给小鼠腹膜内注射 6 次牙龈卟啉单 胞菌 （PG），持续 2 周（每周 3 次注射 5 x 10⁷ 个细菌/周， 补充文件 1）。
2. 使用 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 甲苯噻嗪的组合麻醉小鼠。
3. 处死麻醉小鼠，剖腹手术后收获脾脏。
   注意:P . gingivalis 感染的具体条件和动物为收获脾脏而牺牲的具体条件在 补充文件 1 的"动物实验"部分有详细说明。协议步骤的示意图如图 1 所示。

2. 提取脾细胞

1. 使用手术刀，在培养皿中将脾脏组织切碎成 ~1 mm 的切片，培养皿中已经装满了 3 mL 含有抗生素（链霉素 （100 U/mL）/青霉素 （100 U/mL）、真菌酮 （250 mg/mL）、L-谷氨酰胺 （2 mM）），并补充有 10% 胎牛血清 （FBS）（见 材料表）。
2. 将切片转移到筛子中（参见 材料表），筛子事先连接到 50 mL 聚苯乙烯管上。
3. 使用注射器的柱塞作为杵，将组织压碎筛子上。
4. 用 RPMI 培养基 （3 mL） 冲洗筛子。
5. 在室温下以 450 x g 离心细胞悬浮液洗脱液 5 分钟，然后通过回流小心弃去上清液。

3. 通过 渗透压休克去除红细胞

1. 加入 1 mL ACK 缓冲液（参见 材料表），充分混合，在室温下孵育 3 分钟，然后用手旋转轻轻摇晃。
2. 加入 9 mL RPMI 稀释，并使用吸液和回流充分混合。
3. 在室温下以 450 x g 离心 5 分钟。
4. 通过抽吸和回流弃去上清液，并将沉淀重悬于 5 mL RPMI 培养基中。
5. 轻轻混合（吸液/回流），最终通过移液或使用筛子去除任何脂质碎片。

4. 调整分离的脾细胞浓度

1. 填充含有 900 μL RPMI 的 1.5 mL 微管。
2. 使用微量移液器，取 100 μL 细胞悬液，加入含有 900 μL RPMI 培养基的 1.5 mL 微管中，并充分混合。
3. 将 10 μL 稀释的细胞转移到微管中，加入 10 μL 台盼蓝排阻染料，并充分混合。
4. 将 10 μL 溶液（步骤 3.3）放入自动细胞计数仪的计数玻片中（参见 材料表）并确定细胞计数。
   注意:设备软件给出两个值:总细胞数和活细胞数和百分比。
5. 将活细胞浓度调节至 3 或 5 x 10⁶ 个细胞/mL（V_max = 20 mL;最大总容量为 100 x 10⁶ 个细胞/mL）。
6. 将细胞接种在含有 RPMI 的 75 mL 培养瓶中。
7. 将烧瓶在 37 °C 的加湿培养箱中垂直孵育 24 小时。
   注意: 台盼蓝是一种致突变剂和致癌剂^35,36。确保在计数时戴手套，即使在引擎盖外也是如此。立即将吸头和液体倒入容器中，并清洗工作台表面。
   注:如果收集的细胞小于 50 x 10⁶，请使用 25 mL 培养瓶。细胞数量不应因人而异。在此步骤中，活细胞的百分比通常优于 80%。

5. 分离脾细胞微泡

1. 24 小时后，将培养瓶内容物倒入 50 mL 聚丙烯或聚苯乙烯管中。
2. 在室温下以 450 x g 离心 15 分钟以去除细胞和碎片。
3. 离心后，保留 100 μL 第 1 上清液 （SN1），用于最终测量初始 MV 浓度以计算分离产量。请注意 SN1 卷。
4. 在室温下以 450 x g 离心 SN1 15 分钟。
5. 弃去沉淀，在室温下再次以 450 x g 离心 15 分钟。快速提取并收集 SN2 （注意体积）。
6. 将 SN2 转移至底部呈锥形的 1.8 mL 微离心管中。保留 100 μL SN2 用于初始 MV 浓度的最终测量，以计算分离产量，以防过多的碎片最终损害 SN1 中的 MV 测量。
7. 向沉淀物（细胞）中加入 5 mL RPMI 培养基并计数脾细胞。
   注:细胞悬液也可以固定在 0.1% 多聚甲醛（终浓度）中用于流式细胞术表征³⁷。
8. 将SN2 在4°C下以14,000 x g 离心1小时，并最终通过在4°C下运行空转子来提前冷藏转子。 此步骤生成 SN3。
9. 立即从每个微管中取出 SN3，方法是倒置在一根无菌 50 mL 试管上（在引擎盖下）。请注意 SN3 卷。
10. 在引擎盖下使用移液器轻轻混合 SN3。在悬浮液中保留等分试样以进行最终测量。
    注意:该溶液现在已耗尽 MV，但包含可溶性介质和外泌体。
11. 在带尖刺的架子上刮擦每个微管（封闭），以机械地有利于 MV 在颗粒中的重悬。
12. 在第一个微管中加入 200 μL 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ （HBSS） 的 Hank 平衡盐水溶液（参见 材料表）。
13. 使用 1 mL 微量移液器通过轻柔的吸液/回流循环（~10 次）重悬第一管的 MV 沉淀。要非常小心地避免起泡，因为这会促进悬浮液中囊泡和其他部分的氧化。
14. 收获前 200 μL 重悬的 MV，并将它们倒入沉淀上方的第二根试管中。如上所述轻轻混合，然后再次倒入第三管中并轻轻混合。悬浮液从管到管变得越来越浑浊。关闭第三根管子。
15. 如上所述开始收集接下来的三个微管（步骤 4.14）。
16. 将所有重悬的 MV 收集在单个（或两个）收集微管（2 mL，底部呈锥形）中。保留 50 μL 用于最终计算此步骤的产量。注意悬浮液体积。
17. 将收集管在 4 °C 下以 14,000 x g 离心 1 小时。 此步骤生成 SN4。
18. 立即丢弃 SN4（倒在上清液收集管上）。保留 SN4 等分试样以计算纯化步骤的产量，并将沉淀轻轻重悬于 500 μL HBBS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）中。保留 50 μL 等分试样的重悬沉淀，以计算纯化产量并记录其体积。
19. 将重悬的沉淀在 4 °C 下储存长达一个月，以便在无菌条件下进行功能测定，或在 -20 °C 下储存用于结构测定。
20. 通过测量上清液和/或沉淀悬浮液中 MV 的浓度，计算每个步骤或整个过程的纯化产量（参见下面的注释）。
    注:纯化产量 （%）:（[MV1] x SN1 体积）/（[MV4] x 最终悬浮液体积）x 100。
    该产量需要根据从培养瓶中分离的脾细胞数量合理化，并在步骤 4.4 中计数。本实验的纯化产量为 ~70%，从 111 x 10⁶ 个细胞和 60 mL 上清液开始。
    1. 通过测量残留在 SMV 耗尽且主要含有外泌体（SN2 和 SN4）的上清液中残留的 SMV，评估该程序引起的 SMV 损失。
    2. 通过 TRPS 或凝血酶原酶测定法³⁸ 测量 MV 浓度，以获得高灵敏度和特异性。
       注意:离心后通过快速倒入上清液收获 MV。等待或使用 U 形微管会提示微管壁上的 MV 丢失。切勿使用微量移液器丢弃上清液;颗粒可以被吸出。离心机停止后切勿延迟该过程。超速离心将导致 MV 沉淀被外泌体污染。
       注:离心速度和持续时间针对 MV 富集进行了优化，外泌体的污染最小。该方案对于研究脾单核细胞/巨噬细胞 MV 不可靠，因为这些细胞可以吞噬细胞并快速重新捕获自己的 MV³⁹。由于细胞活力导致细胞损失，该方案不能暂停和稍后重新启动。

Results

提供的数据使用两种主要动物条件完整地代表了整个过程:对照未经治疗的年轻 C57BL/6 小鼠及其同窝小鼠每 2 天进行 6 次腹膜内 （IP） PG 注射，持续 2 周。它们还显示了 2 周后腹膜内 PG 注射对脾脏反应的远程作用。通过凝血酶原酶测定或通过分光光度法测量其蛋白质和 RNA 浓度来定量脾细胞微泡，并通过流式细胞术^33,38 测定脾细胞悬液中中性粒细胞的比例（补充文件 2 和补充图 2 的第 4-1 节）。

牙龈卟啉单胞菌 IP 注射 2 周后脾脏重量和细胞数量增加
在年轻成年小鼠中，PG 注射导致 2 周后脾脏重量显着增加 2.6 倍，这可能是由于免疫反应。事实上，总脾细胞计数也增加了 2.3 倍（图 2

Discussion

本研究证实，与小鼠体积有限的血液等其他来源相比，脾脏是具有生理病理学相关性的 MV 的主要可靠来源。如果采取预防措施，该方法易于设置，不需要昂贵的设备。由于除了 体内 评估之外没有其他方法可用，因此目前的模型似乎是研究前药对 MV 脱落影响的有价值的方法。重要的是，此处介绍的收获小鼠脾微泡 （SMV） 的标准化方案应该适合控制 SMV 介导效应的 体内 研究的未满足需求，最终在注射或鼻腔滴注后在工程小鼠中。

该方法还表明，SMV 是研究局部感染（如 牙龈卟啉单 胞菌 IP 感染）的远程影响的相关临床前工具。事实上，使用多种方法，从 牙龈卟啉单胞菌处理释放的 SMV 与。测量未治疗的动物，表明局部 IP 注射的远程效应，2 周后已经可以检测到。我们实验室使用其他远程 牙龈卟啉 单胞菌感染部位的初步数据证实， 牙龈卟啉单 胞菌可能早在感染后第 7 天就开始 SMV 升高 1.7 倍。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL 离心管类型 Eppendorf	Dutscher	54816	锥形底柱;riel 微管
Allegra 64 R 离心机	Beckman Coulter
自动细胞计数器	Biorad
牛血清白蛋白	Euromedex	04-100-812-E	制备，用 0.22 µ 过滤;m 筛并储存在 4 °C 在无菌条件下使用以下公式：2 mM EDTA、0.5% BSA 和无菌 PBS
CD11 （Mac-1）	e-Biosciences	45-00112-80	与 eFluor 450 偶联;λ<亚>最大激发 405 nm 和 lambda;<亚>最大发射 445 nm
CD16/32	BD Biosciences	553142	未偶联的
EDTA	Calbiochem Calbiochem		S 6381-92-6
Falcon 管	细胞星	形227261	50 mL
胎牛血清	Dutscher	S1810-500	批号 = S14028S1810
Fortessa Aria	BD Biosciences		用于细胞分选
Fortessa 流式细胞仪	Becton-Dickinson。
Fungizone	PAN 生物技术	P06-01050
HBSS	Gibco	14175-053	不含酚红，不含 Ca+2 和 Mg+2
ICAM-1	abcam	ab171123
LYG-6 （Gr-1）	BD Biosciences	566218	与 BUV395 偶联;λmax激发波长 348 nm，λ<亚>最大发射 395 nm
裂解缓冲液 红细胞 （ACK）	Sigma		制备，用 0.22 &微量过滤;m 筛并储存在 4°C 在无菌条件下使用以下公式： NH4Cl， 0.15 M（摩尔浓度）， 53.491 （mw） 4 g KHCO3 1 mM（ 100.115 （mw）， 50 mg EDTA 0.1 mM（摩尔浓度），292.24 （mw），14.6 g pH：7.2–7.4
NanoDrop 1000 分光光度计	Thermoscientific
PBS	Lonza	17-516F	无 Ca+2  和 Mg+2
塑料培养皿			100 mm
聚苯乙烯管	Falcon	352070
q-Nano Gold	iZON science
RPMI 1640 培养基：2 g/L 葡萄糖	PAN 生物技术	p04-18047	补充有链霉素 （100 U/mL） /青霉素 （100 U/mL）、真菌酮 （250 mg/mL）、L-谷氨酰胺 （2 mM） 和 FBS 10%。
手术刀
Sieve Nylon	Falcon USA	352360	100 µm
链霉素/青霉素	PAN 生物技术	P06-07100
注射器			2 mL
台盼蓝	Biorad	1450013
VCAM1	abcam	ab215380