大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养及其在肌萎缩侧索硬化研究中的应用

摘要

本文介绍了一种从大鼠大脑皮层分离胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞以建立原代培养的实验方案，用于在hSOD1^G93A大鼠模型中研究肌萎缩侧索硬化症病理生理机制时，进行细胞内Ca²⁺动态变化的延时视频成像。

摘要

本方案演示了如何从 Sprague Dawley 大鼠的大脑皮层中分离培养原代胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞，并利用这些细胞研究大鼠 hSOD1^G93A 模型中肌萎缩侧索硬化症（ALS）的病理生理机制。首先，本方案展示了如何从新生大鼠大脑皮层中分离并培养星形胶质细胞和小胶质细胞，随后通过免疫细胞化学方法，利用星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和小胶质细胞标志物离子化钙结合接头分子1（Iba1）对培养细胞进行鉴定和纯度检测。在下一阶段，介绍了对培养细胞进行染料负载（使用钙敏感性染料 Fluo 4-AM）的方法，以及在活细胞上通过视频成像实验记录 Ca²⁺ 变化的技术。

视频记录示例包括：（1）Ca²⁺ 对培养的星形胶质细胞急性暴露于自肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者分离的免疫球蛋白G（IgG）进行成像，结果显示其产生特征性且特异性的反应，与同一实验中三磷酸腺苷（ATP）诱导的反应相比具有明显差异。示例还显示，在表达人源突变SOD1（hSOD1）的细胞中，ALS IgG诱发的细胞内钙离子浓度瞬时升高更为显著。^G93A 星形胶质细胞与非转基因对照组相比；（2）Ca²⁺ 使用毒胡萝卜素（Thg）耗竭钙库过程中对培养星形胶质细胞进行成像，Thg 是内质网 Ca²⁺-ATP 酶的非竞争性抑制剂²⁺ ATP酶，随后通过在记录液中添加钙以诱导促发的钙库操纵性钙内流，表明了Ca之间的差异²⁺ hSOD1中的储存操作^G93A 以及在非转基因星形胶质细胞中；（3）Ca²⁺ 培养的小胶质细胞成像显示，其对ALS IgG主要无反应，而ATP刺激则引起Ca²⁺ 变化。本文还强调了关于细胞密度和培养纯度的关键注意事项，以及选择正确浓度的 Ca²⁺ 染料及染料负载技术

引言

细胞培养技术在健康与疾病状态下的细胞神经生理学多个领域推动了众多进展。特别是从实验动物的神经组织中新分离出的原代细胞培养，可使实验人员在不同的生化培养基和生理条件下深入研究多种细胞的行为。结合使用不同的荧光生理指示剂（如对Ca²⁺敏感的染料）和延时视频显微镜技术，能够实时更清晰地揭示细胞的生物物理和生化过程。

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种破坏性的神经退行性疾病，影响上运动神经元和下运动神经元¹。该疾病在家族性类型中具有复杂的发病机制，但大多数为散发型（占病例的90%）²。已知非细胞自主性机制参与了ALS的病理生理过程，这主要归因于胶质细胞的重要作用³。ALS也被明确定义为一种神经炎症性疾病，涉及体液和细胞炎症因子的参与。

免疫球蛋白G（IgG）被广泛用作肌萎缩侧索硬化症（ALS）及其他神经退行性疾病的分子标志物。研究该标志物的血清水平可提示疾病中神经炎症的存在及阶段^4,5,6，而其在脑脊液中的出现则可能提示血脑屏障的破坏⁷....

方案

所有实验均依照欧盟关于科学实验用途动物保护的指令，并经贝尔格莱德大学生物学院伦理委员会批准（批准编号 EK-BF-2016/08）后进行。关于患者样本（用于IgG检测的血清），其采集已获得患者知情同意，符合《世界医学协会伦理准则》（赫尔辛基宣言）中涉及人类实验的规定。该方案已获塞尔维亚临床中心伦理委员会批准（编号 850/6）。

1. 原代细胞培养的制备

1. 脑组织分离
   注意：分离操作应在冰上进行，并使用预冷的溶液。
   1. 使用出生后1-3天的新生幼鼠进行原代新生儿细胞培养³³。
      注意：本研究所用的是Sprague Dawley hSOD1^G93A 转基因大鼠和非转基因大鼠。用于基因分型时，取大鼠尾部组织用于后续DNA提取和PCR分析。
   2. 用70%乙醇喷洒幼鼠头部，然后使用剪刀迅速剪断头部。
   3. 使用小角度剪刀切开皮肤以暴露颅骨。从枕骨大孔（foramen magnum）向眼眶方向剪开颅骨，再做一条垂直于前切口的正中切口。取出脑组织并置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。
      注意：在处理不同幼鼠之间需清洁工具，以防止转基因与非转基因幼鼠之间的交叉污染。大脑皮层与其他脑区的分离应在体视显微镜下完成。
   4. 用镊子尖端撕开....

结果

培养物中不同类型胶质细胞的鉴定
通常需要 15–21 天培养星形胶质细胞用于实验，而小胶质细胞的生长需要 10–15 天。通过免疫染色评估培养物的细胞纯度。图 1 显示了在各自的培养物中星形胶质细胞标志物 GFAP 与小胶质细胞标志物 Iba1 的双标表达情况。

钙成像技术可用于揭示健康星形胶质细胞与病变星形胶质细胞在细胞生理学上的差异。此前在野生型星形胶质细胞中，我们已证明肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者的IgG可通过动员胞内和胞外钙库，使细胞质中Ca²⁺浓度升高⁸。本实验方案旨在确定在急性暴露于ALS患者IgG样本后，hSOD1^G93A转基因与非转基因培养星形胶质细胞之间的钙瞬变是否存在差异。实验中，将负载Fluo4-AM的星形胶质细胞用ECS灌流3分钟，以获得稳定的基线信号；随后，在浴液中加入100 µg/mL的ALS IgG，持续5分钟；接着用ECS冲洗细胞，最后在每次记录结束时加入1.......

讨论

本文介绍了一种快速且高效的原代细胞培养方法 "在预算方面" 研究细胞（病理）生理学不同方面的工具，例如大鼠hSOD1中的肌萎缩侧索硬化症（ALS）^G93A 模型。因此，该技术适用于在单细胞水平上开展研究，并可将结果外推至更高组织层次（如组织切片或活体动物）进行进一步探究。然而，细胞培养作为一种技术手段也存在一些注意事项。最关键的是，脑组织的分离及细胞解离必须在冰上操作，并尽可能缩短从组织分离到后续制备各步骤的总时间。污染是始终存在的障碍，可通过使用充分灭菌的器械并在层流罩内谨慎操作组织解离步骤来有效避免。³⁷接种细胞时，细胞密度的控制也至关重要。若接种的细胞数量低于所需密度，将无法支持细胞在培养皿中的生长与增殖；反之，若细胞密度过高，则细胞间会因争夺培养基中的营养物质而产生竞争，从而导致更多的细胞死亡。因此，在接种前对解离后的细胞进行计数是十分必要的，尤其是在尚未积累关于起始组织量与解离体积之间恰当比例的足够经验之前。

GFAP 是一种广泛使用的星形胶质细胞标志物，常用于评估细胞培养的纯度

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	Sarstedt, Germany	62 554 502
2 mL 离心管	Sarstedt, Germany	72.691
21 G 针头	Nipro, Japan	HN-2138-ET
23 G 针头	Nipro, Japan	HN-2338-ET
5 mL 注射器	Nipro, Japan	SY3-5SC-EC
6 mm 圆形玻璃盖玻片	Menzel Glasser, Germany	630-2113
60 mm 培养皿	ThermoFisher Scientific, USA	130181
ATP	Sigma-Aldrich, Germany	A9062
AxioObserver A1	Carl Zeiss, Germany
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich, Germany	B6917
氯化钙	Sigma-Aldrich, Germany	2110
离心机	Eppendorf, Germany
DAPI	Sigma-Aldrich, Germany	10236276001
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich, Germany	158968
DMEM	Sigma-Aldrich, Germany	D5648
驴抗山羊 AlexaFluor 647 IgG 抗体	Invitrogen, USA	A-21447
驴抗小鼠 AlexaFluor 488 IgG 抗体	Invitrogen, USA	A-21202
EDTA	Sigma-Aldrich, Germany	EDS-100G
EGTA	Sigma-Aldrich, Germany	E4378
”evolve”-EM 512 数字相机系统	Photometrics, USA
胎牛血清（FBS）	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10500064
Fiji ImageJ 软件	在 GNU 通用公共许可证下的开源软件
FITC 滤光片组	Chroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AM	Molecular Probes, USA	F14201
山羊抗 Iba1 抗体	Fujifilm Wako Chemicals, USA	011-27991
HEPES	Biowest, France	P5455
高速溶液交换系统	ALA Scientific Instruments, USA
培养箱	Memmert GmbH + Co. KG, Germany
氯化镁	Sigma-Aldrich, Germany	M2393
Matlab 软件	Math Works, USA
小鼠抗 GFAP 抗体	Merck Millipore, USA	MAB360
Mowiol 40-88	Sigma-Aldrich, Germany	324590
正常驴血清	Sigma-Aldrich, Germany	D9663
多聚甲醛	Sigma-Aldrich, Germany	158127
青霉素和链霉素	ThermoFisher Scientific, USA	15140122
多聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich, Germany	P5899
氯化钾	Sigma-Aldrich, Germany	P5405
磷酸二氢钾	Carlo Erba Reagents, Spain	471686
DELFIA PlateShake 摇床	PerkinElmer Life Sciences, USA
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich, Germany	S3817
氯化钠	Sigma-Aldrich, Germany	S5886
七水合磷酸氢二钠	Carl ROTH GmbH	X987.2
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich, Germany	P5280
毒胡萝卜素	Tocris Bioscience, UK	1138
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Germany	T8787
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich, Germany	T4799
Vapro 蒸气压渗透压计 5520	Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor 成像系统	Visitron System Gmbh, Germany
VisiChrome 多色仪系统	Visitron System Gmbh, Germany
VisiView 高性能配置	Visitron System Gmbh, Germany
氙短弧灯	Ushio, Japan