受激拉曼散射（SRS）显微技术是一种强大、无损且无需标记的成像技术。其中一个新兴应用是受激拉曼组织学，该方法利用蛋白质和脂质拉曼跃迁处的双色SRS成像生成类似苏木精和伊红染色的图像。本文中，我们展示了一种用于组织诊断的实时双色SRS成像方案。
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摘要
摘要
受激拉曼散射（SRS）显微技术已成为一种强大的光学成像方法，可用于组织病理诊断。近年来，双色SRS被证明能够提供相当于苏木精-伊红（H&E）染色的图像，从而实现脑癌的快速且可靠的诊断。这一能力推动了术中癌症诊断的诸多创新应用。组织的双色SRS成像可采用皮秒或飞秒激光光源实现。飞秒激光的优势在于支持多种灵活的成像模式，包括快速高光谱成像和实时双色SRS成像。通常采用具有啁啾特性的激光脉冲进行光谱聚焦，以配合飞秒激光实现高光谱分辨率。
双色受激拉曼散射（SRS）成像可通过正交调制与锁相检测实现。脉冲啁啾、调制及表征的复杂性是该方法广泛应用的主要瓶颈。本文提供了一套详细的操作方案，用于演示频谱聚焦型SRS的实现与优化，以及在倒置模式下对小鼠脑组织进行实时双色成像。本方案可适用于多种利用SRS高速度和光谱成像能力的SRS成像应用。
引言
传统的组织学诊断依赖于染色方案，随后在光学显微镜下进行观察。病理学家常用的一种染色方法是H&E染色：苏木精将细胞核染成紫蓝色，伊红则将细胞外基质和细胞质染成粉红色。这种简单的染色方法至今仍是多种组织学诊断（尤其是癌症诊断）的金标准。然而，H&E组织病理学检查，特别是在术中环境下使用的冰冻切片技术，仍存在局限性。染色过程繁琐，涉及组织包埋、切片、固定和染色等多个步骤1。通常需要20分钟或更长的周转时间。在术中进行冰冻切片H&E染色时，若需同时处理多个切片，由于必须评估细胞特征或生长模式的三维结构以判断切缘情况，操作可能变得更加困难。此外，术中组织学技术依赖于熟练的技术人员和临床医生。许多医院中具备资质认证的病理学家数量有限，这在很大程度上限制了术中会诊的实施。随着数字病理学和基于人工智能的诊断技术的快速发展，这些限制有望得到缓解2。然而，H&E染色结果具有变异性，其质量依赖于技术人员的经验，这为基于计算机的诊断带来了额外挑战2。
这些挑战有望通过无标记光学成像技术得到解决。其中一种技术是受激拉曼散射（SRS）显微成像。SRS利用同步脉冲激光——泵浦光和斯托克斯光——高效激发分子振动3。近期研究表明，对蛋白质和脂质进行SRS成像可直接在未经处理的新鲜组织上生成与苏木精-伊红（H&E）染色相当的图像（也称为受激拉曼组织学，SRH），无需任何组织处理步骤，显著缩短诊断所需时间，并已成功应用于术中环境4。此外，SRS成像能够提供三维图像，在二维图像信息不足时为诊断提供更多依据5。SRH具有无偏性，可生成便于计算机辅助诊断的数字图像，正迅速成为术中癌症诊断和肿瘤边界分析的潜在解决方案，尤其在脑癌诊疗中表现突出6,7,8。最近的研究还提示，对组织化学变化进行SRS成像亦可提供有价值的诊断信息，有助于临床医生进一步区分不同类型的癌症或判断其发展阶段9。
尽管受激拉曼散射（SRS）成像在组织诊断应用中具有巨大潜力，但由于成像平台结构复杂，目前主要局限于光学专业领域的学术实验室。该平台包括超快激光器、激光扫描显微镜以及复杂的检测电子系统。本实验方案详细描述了如何利用一种常见的飞秒激光光源，对小鼠脑组织进行实时双色SRS成像，并生成类似苏木精-伊红（H&E）染色的伪彩图像。本方案涵盖以下操作步骤：
准直与啁啾优化
大多数受激拉曼散射（SRS）成像方案使用皮秒或飞秒激光器作为激发光源。在使用飞秒激光器时，其激光带宽远大于拉曼谱线宽度。为克服这一限制，通常采用光谱聚焦方法，将飞秒激光啁啾展宽至皮秒时间尺度，以实现窄的光谱分辨率10。只有当泵浦光和斯托克斯光的群延迟色散（也称为时间啁啾或简称色散）被精确匹配时，才能获得最佳光谱分辨率。本文演示了利用高色散玻璃棒对激光束进行准直以及优化其色散特性的操作流程和具体步骤。
频率校准
谱聚焦受激拉曼散射（SRS）的一个优势在于，通过改变泵浦光与斯托克斯光激光之间的时间延迟，即可快速调节拉曼激发频率。与调节激光波长相比，这种调谐方式可实现更快的成像速度和更可靠的光谱采集。然而，激发频率与时间延迟之间的线性关系需要进行外部校准。通常使用已知拉曼峰的有机溶剂对谱聚焦SRS的拉曼频率进行校准。
实时双色成像
在组织诊断应用中，提高成像速度对于缩短分析大尺寸组织样本所需的时间至关重要。同时对脂质和蛋白质进行双色受激拉曼散射（SRS）成像，无需调节激光波长或时间延迟，可使成像速度提高两倍以上。该技术通过采用一种新颖的正交调制方法，并结合锁相放大器进行双通道解调来实现11。本文描述了正交调制与双通道图像采集的实验方案。
反射式SRS成像
迄今为止展示的大多数SRS成像均采用透射模式进行。反射式（epi-mode）成像则通过检测组织返回散射的光子12。在病理学应用中，手术标本可能相当大。对于透射式成像，通常需要对组织进行切片，这会不必要地增加额外时间。相比之下，反射式成像可以直接用于完整的手术标本。由于使用同一物镜收集背向散射光，因此也无需为透射式成像所必需的高数值孔径聚光镜进行对准。当组织难以切片时（例如骨组织），反射式成像是唯一可行的选择。我们此前已证明，对于脑组织，当组织厚度> 2 mm时，反射式成像可提供更优的成像质量13。本方案采用偏振分束器（PBS）来收集因组织作用而发生去偏振的散射光子。虽然使用环形探测器可收集更多光子，但会增加定制探测器组件的复杂性12。相比之下，PBS方法实现更为简便（类似于荧光检测），且可直接使用透射模式检测中已有的标准光电二极管。
伪H&E图像生成
在采集双色SRS图像后，可通过重新着色以模拟H&E染色效果。本文展示了将脂质和蛋白质SRS图像转换为用于病理学应用的伪H&E SRS图像的流程。实验方案详细说明了生成高质量SRS图像所需的关键步骤。此处所示方法不仅适用于组织诊断，还可拓展应用于其他多种高光谱SRS成像领域，如药物成像和代谢成像14,15。
通用系统要求
本实验方案所用的激光系统必须能够输出两束同步的飞秒激光。理想情况下，系统应配备光学参量振荡器（OPO），以实现其中一束激光波长的宽范围调谐。本方案中采用的实验装置使用商用激光系统 Insight DS+，可输出两束激光（一束固定波长为 1,040 nm，另一束基于 OPO 可调谐，波长范围为 680 至 1,300 nm），重复频率为 80 MHz。可用于受激拉曼散射（SRS）成像的激光扫描显微镜既可来自主流显微镜厂商，也可为自行搭建。本实验所用显微镜是在商用正置显微镜框架基础上构建的正置式激光扫描显微镜。采用一对 5 mm 振镜（galvo mirrors）对激光束进行扫描。对于选择自行搭建激光扫描显微镜的用户，可参考先前发表的激光扫描显微镜构建方案16。
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方案
所有实验动物操作均使用200 µm厚的固定切片小鼠脑组织进行，遵循华盛顿大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案（# 4395-01）。野生型小鼠（C57BL/6J品系）以CO2安乐死。随后进行开颅手术以取出脑组织，并在磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛中固定。脑组织被包埋于3%琼脂糖和0.3%明胶的混合物中，并使用振动切片机切成200 μm厚的切片。
1. 初始比对
注意：为获得最佳灵敏度和分辨率，需确保两束光的光束尺寸和发散角相匹配。在泵浦光束和斯托克斯光束进入激光扫描显微镜之前，对其进行准直并调节光束尺寸。为此，可在每束光进入二向色镜前使用一对消色差透镜。进行光束准直时，务必佩戴合适的激光防护眼镜。
- 光束准直
- 为泵浦光束安装一对消色差透镜。作为初始设置，使用焦距为100 mm和200 mm的透镜，将激光光束尺寸放大2倍。确保两透镜之间的距离约为300 mm。将泵浦光束对准两个透镜的中心并通过。
- 在第二个透镜后放置一面反射镜，将光束引向远处墙面（>1 m远）。长距离传输光束时需格外小心。使用红外卡纸从反射镜到墙面追踪光束，并检查光束尺寸是否随传播距离发生变化。若光束尺寸随距离变化，则需对光束进行准直。
- 若光束会聚（传播过程中尺寸减小），则将两个透镜相互靠近移动。
- 若光束发散（传播过程中尺寸增大），则将两个透镜相互远离移动。调节间距直至光束实现准直。
- 对斯托克斯光束重复步骤1.1.1和1.1.2，以完成其准直。
- 光束尺寸调节
- 若具备光束轮廓仪，测量每束光的准直后光束尺寸。否则，可使用红外卡纸和直尺进行估算，使光束直径达到4–5 mm。
- 若光束尺寸过小或过大，更换步骤1.1中使用的透镜组合。调节透镜组合，直至两束光的直径均达到4–5 mm。
注意：光束放大倍率等于第二透镜焦距与第一透镜焦距之比（f2/f1）。
- 空间重合
注意：受激拉曼散射（SRS）成像需要两束激光在空间和时间上重合，以激发分子振动。谱聚焦SRS成像的示意图见图1。- 通过安装二向色镜并配合若干导向反射镜，将两束激光合并。通过在二向色镜后两个相距较远（约1 m）的位置监测光束，优化泵浦光与斯托克斯光的空间重合。反复调节二向色镜前的导向镜及二向色镜本身，使斯托克斯光束与泵浦光束对齐。
注意：若两束光在两个不同位置均实现空间重合，则表明其重合程度已足够。 - 当扫描镜处于停放位置时，调节一对导向镜，确保合并后的光束被引导至激光扫描显微镜扫描镜的中心。确保两束光均通过显微镜物镜和聚光镜的中心。
- 在聚光镜之后，使用另一组焦距分别为100 mm和30 mm的透镜，将透射光束中继成像至光电二极管上。确保两束光均落在光电二极管的感光区域内，并安装两个低通滤波器以阻挡调制的斯托克斯光束。
- 通过安装二向色镜并配合若干导向反射镜，将两束激光合并。通过在二向色镜后两个相距较远（约1 m）的位置监测光束，优化泵浦光与斯托克斯光的空间重合。反复调节二向色镜前的导向镜及二向色镜本身，使斯托克斯光束与泵浦光束对齐。
2. SRS 信号检测
- 电光调制（EOM）
注意：使用20 MHz的EOM来调制斯托克斯（Stokes）光束的振幅。如后文所述，该EOM信号源自80 MHz的激光脉冲序列，这是实现正交调制所必需的。如果仅进行单色或高光谱SRS成像，则可使用其他调制频率，此时无需将调制频率与激光重复频率同步。可使用带有射频功率放大器的信号发生器驱动EOM，从而跳过步骤2.1.1–2.1.4。- 在斯托克斯光束路径中放置一个分光采样器，拾取10%的光束并将其引导至快速光电二极管，以检测80 MHz的脉冲序列。
注意：光电二极管信号被送入一个分频器，以生成20 MHz的TTL输出信号。该输出进一步送入一个扇出缓冲器，以复制为四个相同的20 MHz输出信号。其中一个输出用于触发示波器。 - 取扇出缓冲器的一个输出，通过带通滤波器滤波得到20 MHz的正弦波。使用射频衰减器将输出的峰峰值电压调节至约500 mV。
- 将所得输出信号送入相位调节器，该调节器可通过电压源对射频相位进行精细调节。再将该输出送入射频功率放大器，并将放大器的输出连接至EOM。
- 解除对斯托克斯光束的遮挡，并在光路中放置一个光电二极管，以优化EOM1的调制深度。调节EOM的电压和四分之一波片，直至调制深度（谷值与峰值之比）达到满意水平。
注意：在20 MHz调制（激光重复频率的1/4）下，每50 ns应出现两个脉冲。
- 在斯托克斯光束路径中放置一个分光采样器，拾取10%的光束并将其引导至快速光电二极管，以检测80 MHz的脉冲序列。
- 时间重合
注意：通过将其中一个激光脉冲序列延迟，实现泵浦光与斯托克斯光的时间重合。延迟通过安装在延迟平台上的后向反射器完成（图1显示斯托克斯光被延迟）。粗略的时间重合通过示波器监测，精细重合则通过SRS信号监测。如有条件，也可使用自相关仪实现精细时间重合。- 在二向色镜后放置一个光电二极管以检测激光光束。首先遮挡斯托克斯光束。在示波器上放大其中一个泵浦脉冲的峰值。使用示波器的垂直光标标记该峰值的时间位置。
- 遮挡泵浦光束，解除对斯托克斯光束的遮挡。移动延迟平台，使示波器上斯托克斯脉冲的峰值时间位置与上一步标记的位置对齐。参见图2，以查看两束光时间重合的示意图。
- （可选）若延迟平台的移动范围不足以实现两束光的时间对齐，则将延迟平台移至其运动范围的中间位置。
- 通过计算两束光之间的时间差，并将该时间差乘以光速，得到为实现时间对齐所需调节的距离。
- 相应地延长较快光束的光路，或缩短较慢光束的光路，以大致匹配时间延迟。
- 准备一个显微镜载玻片样品，使用DMSO和双面胶带作为间隔物，将样品夹在载玻片与盖玻片之间。
- 将样品放置在显微镜上，使盖玻片一侧朝向显微镜物镜。切换显微镜至明场照明模式，并通过目镜观察样品。首先找到玻璃-胶带界面处上下两层气泡的焦平面，然后将焦点调整至两层胶带之间。
注意：在观察目镜前，务必确保激光光束已被遮挡。 - 将可调谐激光器输出设为798 nm。根据聚光镜的光学透过率，调节泵浦光和斯托克斯光在物镜焦点处的光功率，使其均约为40 mW。
- 在MATLAB中打开ScanImage（或其他控制显微镜的扫描软件），点击标有FOCUS的按钮以开始扫描。
注意：激光束将对样品进行光栅扫描以生成图像。光电二极管输出的低频信号（<100 kHz）直接输入数据采集卡的通道1（称为DC通道）。光电二极管的高频输出（>100 kHz）输入锁相放大器，锁相放大器的X输出信号输入数据采集卡的通道2（称为AC通道）。 - 调节扫描振镜前的转向镜，使DC信号在通道1的显示中居中。移动电动延迟平台，并密切观察通道2（即AC通道）上显示的锁相放大器输出。
注意：当泵浦光与斯托克斯光在时间上重合时，AC通道将出现信号。调节AC通道的颜色标度以显示微弱的强度变化将有助于观察。 - 通过精细调节时间延迟，使AC信号强度最大化。调节二向色镜，使SRS信号在AC通道中居中（同时保持DC通道信号居中）。调节锁相放大器的相位以使信号最大化。参见图3以查看满意的信号。
3. 光谱分辨率优化
注意：为了最大限度提高光谱分辨率，到达样品的泵浦光束和斯托克斯光束应具有相同量的群延迟色散（GDD）。色散程度强烈依赖于实验装置。此处描述的实验装置使用波长分别为1,040 nm和800 nm的飞秒脉冲作为斯托克斯光和泵浦光。采用重火石玻璃棒（H-ZF52A）作为脉冲展宽介质。
- 将一根48 cm长的高色散玻璃棒（H-ZF52A或等效重火石玻璃）插入800 nm光束路径中。使用公式（Eq）估算群延迟色散（GDD）。1):
(1)
注意：不同波长下各种玻璃材料的群速度色散（GVD）可从折射率数据库资源中查得。例如，H-ZF52A 的 GVD 为 220.40 fs2在800 nm处为/mm。总GDD为105792 fs2. - 计算需要向1,040 nm光束光路中加入多少厘米的色散玻璃棒，以匹配泵浦光的群延迟色散（GDD）。将相应长度的色散玻璃棒插入1,040 nm光束光路中，粗略匹配800 nm光束的GDD。注意，加入玻璃棒会改变两束光之间的时间重叠，可能需要调整延迟。
- 光谱分辨率的校准
- 使用DMSO制备显微镜载玻片样品。将载玻片置于显微镜上，检测显微镜聚光镜出射光束的功率。根据需要调节光强，使样品焦点处每束光功率约为40 mW。
- 开放 ScanImage 来自 MATLAB。通过扫描延迟台找到最大的 SRS 信号，该信号对应于 2,913 cm⁻¹ 处的峰-1 DMSO的拉曼峰。根据之前的位置，结合因插入玻璃棒导致的光程增加，估算载物台的新位置。由于加入玻璃棒后光束存在微小偏移，需重新调整光束的空间重叠。
- 通过移动电动载物台并依次采集一系列SRS图像，保存一个高光谱SRS扫描。
注意：延迟扫描范围覆盖了两个拉曼峰，分别对应于 2,913 cm⁻¹-1 和 2,994 cm-1 DMSO 的拉曼峰。当使用 800 nm 泵浦光和 1,040 nm 斯托克斯激光时，可观察到这两个跃迁。 - 使用 ImageJ 或 MATLAB 绘制 DMSO 溶液的 SRS 谱图。对 DMSO 在 2,913 cm⁻¹ 处的强峰进行拟合-1 使用 MATLAB 将峰拟合为高斯函数或洛伦兹函数，以计算该峰的半高全宽（FWHM）。
注：代表性结果如图所示 图4. 如果仅出现一个宽峰，则意味着要么光谱分辨率太低，无法区分两个峰，需要增加玻璃棒数量，要么扫描范围太小而未能检测到第二个峰。通常，可接受的光谱分辨率 DMSO 约为 ~20–25 cm⁻¹-1 当玻璃棒长度为 >使用60 cm。组织成像通常采用较低分辨率，以换取更短脉冲带来的更高信号。17.
- （可选）使用自相关仪或FROG（频率分辨光学门控）测定每束光的脉冲持续时间，以精确计算所需色散量（GDD）以及用于匹配泵浦光与斯托克斯光之间GDD的棒材长度。
- 重复步骤 3.3.2–3.3.4，针对斯托克斯光束使用不同长度的玻璃棒，以找到最佳光谱分辨率，即通过实验确定最佳群延迟色散（GDD）匹配。采用多组长度不同的玻璃棒，实现最优的光谱分辨率。
4. 信噪比（SNR）表征
- 确保在完成完全的空间和时间对齐后执行步骤 4.2。
- 获取对应于 2,913 cm⁻¹ 的 SRS 图像-1 DMSO的拉曼峰。在ImageJ中打开图像，并在画面中心选择一个小区域。使用 测量 用于计算所选区域内数值的平均值和标准差的函数。
- 将选定区域的平均值除以标准差，以计算信噪比（SNR）值，如公式（2).
(2)
注意：对于该系统而言，良好的信噪比（采用锁定放大器的时间常数为 4 μs使用DMSO，两臂在焦点处均为40毫瓦/40毫瓦 >800. 如果数据采集卡的位深度有限，可使用较低浓度的DMSO或较低的功率，以更准确地估算信噪比。 - 如果信噪比过低，需重新调整激光脉冲，以优化空间重叠、时间重叠、光束尺寸/准直匹配和/或色散匹配。对于带有像差校正环的物镜，可通过调节校正环来优化信号。
5. 频率轴校准
注意：此步骤用于将延迟阶段位置与扫描的拉曼跃迁相关联。需要仔细选择溶剂以生成合适的“拉曼标尺”。DMSO 是 C-H 键的有效溶剂，因其在 2,913 cm-1 和 2,994 cm-1 处具有两个尖锐的拉曼峰。
- 保存一个覆盖 DMSO 的 2,913 cm-1 和 2,994 cm-1 拉曼峰的延时台范围的高光谱扫描。保存与该高光谱数据集对应的台位置。
注：光谱的全局最大峰对应于 DMSO 的 2,913 cm-1 拉曼位移，第二最大峰对应于 DMSO 的 2,994 cm-1 拉曼位移。 - 对 2,913 cm-1 和 2,994 cm-1 处的台位置与拉曼位移进行线性回归。利用台位置与拉曼位移之间的线性回归方程，将延迟位置转换为对应的拉曼频率。
6. 正交调控与双色成像
注意：仅在需要实时双色成像时，才需要正交调制步骤。该方案的示意图见图5。正交调制使用一对电光调制器（EOM），其驱动频率为激光频率的四分之一（对于80 MHz的激光器为20 MHz），且两个调制器之间具有90°的相位差。对于单色SRS成像或高光谱SRS成像，可跳过此正交调制步骤。
- EOM1 调制
- 在第一个 EOM 之后的斯托克斯光束路径中安装一个偏振分束器（PBS2）、一个四分之一波片（QWP2）以及第二个电光调制器（EOM2）。断开 EOM2 的信号输入。连接 EOM1 的信号输入并开启。
- 通过将光束穿过第一个 EOM，在 20 MHz（f0/4）下对斯托克斯光束（固定在 1,040 nm）进行调制。调整 EOM1 的倾斜角度和位置，确保光束垂直且居中通过 EOM 晶体。
- 使用两个光电二极管监测从 PBS1 输出的两个偏振方向的光，并在示波器上显示调制情况，以监控调制深度。
- 调节 QWP1、EOM1 电压以及 20 MHz 输入信号的相位（使用移相器），使透射光束的调制深度优化至接近 100%。调制深度良好的示意图参见 图 2B。
- EOM2 调制
- 断开 EOM1 的连接，接入 EOM2。
- 将第二个放大器在 20 MHz 下的高压输出接入 EOM2。调整 EOM2 的倾斜角度和位置，确保光束垂直且居中通过 EOM 晶体。
- 再次使用示波器观察从 PBS2 输出的两个偏振方向，监测调制深度。根据需要调节 QWP2、EOM2 电压和移相器，使两个偏振方向的调制深度均接近 100%。
- 确保脉冲序列调制相对于第一次调制具有 90° 的相位差。
注：如果两个泵浦脉冲序列不呈 90° 正交，则两个通道之间将出现串扰问题。 - 通过同时开启并连接 EOM1 和 EOM2，测试调制的正交性。使用示波器监测 PBS2 分束后的两个偏振方向。如果第二个 PBS 后的脉冲序列与 图 2C 不符，则需分别重新优化 EOM1 和 EOM2。
- 在 EOM2 下游安装一块 20 mm 的双折射石英晶体（BRC）和一个半波片（HWP）。同时连接两个 EOM，并监测脉冲序列，使其与 图 2D 相符。
注：对于本实验所用的啁啾，20 mm 的 BRC 引起的时间延迟对应于 80 cm-1 的拉曼位移。若使用不同的啁啾，则可能需要不同长度的 BRC。
- 校准
- 使用 DMSO 对系统进行校准，通过检测锁相放大器 X 和 Y 通道的输出信号（送至数据采集卡的第 2 和第 3 通道）完成。
- 检查由较快偏振方向产生的 2,913 cm-1 峰值信号与较慢偏振方向产生的信号在锁相放大器上是否接近 90° 异相。若非如此，需调整 EOM 的对准，直至两个信号接近 90° 异相。
- 完成校准后，找到延迟位置，使其中一个正交光束探测 2,930 cm-1 处的蛋白质跃迁。确保另一偏振方向探测 2,850 cm-1 处的脂质跃迁。
7. 反射模式 SRS 成像
注意：在透射模式成像方案中，物镜将激光聚焦到样品中，然后由聚光镜将透射光束引导至光电二极管进行锁相检测。在倒置（epi）模式成像方案中，由样品背向散射并去偏振的光被聚焦物镜重新收集，并通过偏振分束器进行分离。分离出的背向散射光子经由一对中继透镜传输至光电二极管，进行锁相检测。图6展示了倒置模式成像方案。
- 在光束进入显微镜之前安装一个HWP，以改变进入显微镜的光束偏振态。在物镜上方放置一个PBS，使去偏振的背向反射光束能够到达探测器。
- 使用一对透镜，包括一个75 mm消色差透镜和一个30 mm非球面透镜，将从物镜后孔径出射的背向散射光子中继至光电探测器。安装探测器以收集由PBS引导的背向散射光。安装滤光片以阻止调制光束进入探测器。
- 将组织样本置于物镜下方。由于在反射模式成像中无需聚光镜，若需要更多空间，可将其移除。
- 成像
- 使用快门遮挡光束；从侧面用白光光源照射样本；利用明场模式找到物镜的焦平面。
- 打开两束光，利用预先校准的延迟位置，从锁相放大器的两个输出端获取组织的脂质和蛋白质SRS图像。
- 调节锁相增益和像素合并因子，以获得高质量图像。
8. 假色染色
- 使用 ImageJ 打开图像堆栈。
- 右键单击图像，选择 复制，提取对应脂质（2,850 cm-1）和蛋白质（2,930 cm-1）的两张图像。
- 将脂质图像重命名为 脂质，蛋白质图像重命名为 蛋白质。
- 进入 处理 | 图像计算器，执行 蛋白质 减去 脂质 的运算。
- 通过选择 图像 | 颜色 | 合并通道 将图像合并，设置 脂质 为 绿色，蛋白质 为 蓝色。打开 图像通道 工具（图像 | 颜色 | 通道工具），并调整亮度和对比度（图像 | 调整 | 亮度/对比度）。
- 使用 通道 工具分别调整每个通道的亮度和对比度。对于脂质通道，调节对比度直至细胞结构呈现深色；对于蛋白质通道，调节对比度直至细胞结构呈现蓝色。通过选择 图像 | 类型 | RGB 颜色，将合并后的绿/蓝通道图像转换为 RGB 图像。通过 文件 | 另存为 | Tiff 导出该图像。
注：在伪 H&E 染色中，颜色方案显示细胞质为粉红色，细胞核为深蓝紫色。 - 从 材料表 中的伪 H&E 染色脚本资源下载 HE.m MATLAB 脚本。
- 在 MATLAB 中运行 HE.m 脚本。选择上一步导出的 RGB 图像，以生成人工 H&E 染色图像。
- （可选）对大视野成像进行图像强度归一化，因为图像边缘区域比中心区域更暗。
- 为执行图像视野归一化，尽可能多地平均多张图像，然后在 ImageJ 中去除强度特征（处理 | 滤波 | 高斯模糊 | 半径=50）。
- 测量模糊图像的最大强度（Ctrl+M），将模糊图像除以最大强度（处理 | 数学 | 除法），再将原始 SRS 图像除以该模糊图像（处理 | 图像 | 计算器）。
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结果
优化光谱分辨率：
材料中的色散效应受色散介质（长度和材料）以及波长的影响。改变色散棒的长度会影响光谱分辨率和信号大小。这是一种权衡关系，可根据具体应用需求进行调整。色散棒可将光束脉冲从频域宽、时域窄的状态展宽为频域窄、时域宽的状态。图7展示了不同色散棒长度对光谱分辨率的影响。图7A显示光谱分辨率极差；该配置未使用玻璃啁啾棒，二甲亚砜（DMSO）的两个拉曼峰完全无法分辨。在图7B、C中，随着玻璃啁啾棒数量的增加，两个拉曼峰开始得以分辨。最后，图7D展示了匹配啁啾如何实现两个峰的完全分辨，并可用于将位移台位置校准至频率。
使用 DMSO 进行校准：
DMSO 在 C-H 区域具有两个尖锐的拉曼峰，分别位于 2,913 和 2,994 ...
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讨论
本方案中介绍的双色SRS成像技术依赖于单色SRS成像的正确实施。在单色SRS成像中，关键步骤包括空间对准、时间对准、调制深度和相位偏移。两束光的空间合并通过二向色镜实现。在将光束导向二向色镜时，使用多个转向镜进行精细调节。一旦光束通过二向色镜合并，可通过用一面镜子分出合并后的光路并投射到墙面来确认空间对准情况 >1 米处，同时检查合束是否与红外卡重叠。通过显微镜完成空间对准后，利用基于后向反射镜的延迟平台调节光程长度，实现时间重叠，该方法的优势在于可保持空间对准不变。本方案中，1,040 nm 光臂为延迟光束。若延迟平台的调节范围不足以使两束光在时间上重叠，则无法实现时间重叠。此时，可能需要将整个延迟平台移至不同位置，以确保时间重叠点位于延迟扫描范围的中部附近。例如，若测得两束光之间的时间差为 6 ns，则需要进行 1.8 米的调节。该调节量表示对较快光束的光路进行延长，或对较慢光束的光路进行缩短的长度。
除了光束对准之外，斯托克斯（Stokes）光束的光斑尺寸匹配和调制也对最大化受激拉曼散射（SRS）信号至关重要。理想情况下，两束光均应在物镜平面处准直，并与物镜后光阑的尺...
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R35 GM133435 项目资助，受资助者为 D.F.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 毫米消色差透镜 | THORLABS | AC254-100-B | 宽带，650 - 1,050 纳米，消色差透镜焦距，100 毫米 |
| 20 兆赫带通滤波器 | Minicircuits | BBP-21.4+ | 集总LC带通滤波器，19.2 - 23.6 兆赫，50 Ω |
| 200 毫米消色差透镜 | THORLABS | AC254-200-B | 宽带，650 - 1,050 纳米，消色差透镜焦距，200 毫米 |
| 消色差半波片 | Union Optic | WPA2210-650-1100-M25.4 | 宽带半波片 |
| 消色差四分之一波片 | Union Optic | WPA4210-650-1100-M25.4 | 宽带四分之一波片 |
| 光束取样器 | THORLABS | BSN11 | 10:90 板式分束器 |
| 二向色镜 | THORLABS | DMSP1000 | 可使用其他中心波长约为 1,000 纳米的二向色镜。 |
| DMSO（二甲基亚砜） | Sigma Aldrich | 472301 | 用于拉曼位移校准的溶剂。也可使用其他具有已知拉曼峰的溶剂。 |
| 电光幅度调制器 | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | 正交调制和双通道成像需要两个电光调制器。建议使用谐振版本，以便使用较低的驱动电压。 |
| 假H&E染色脚本 | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
| 扇出缓冲器 | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS扇出缓冲器和线路驱动器，用于生成电光调制器驱动频率及锁相参考信号 |
| 快速光电二极管 | THORLABS | DET10A2 | 硅探测器，1 纳秒上升时间 |
| 频率分频器 | PRL-220A | Pulse Research Lab | TTL频率分频器（f/2, f/4, f/8, f/16），用于从激光输出生成20兆赫信号。 |
| 高色散玻璃棒 | Union Optic | CYLROD01 | 高色散H-ZF52A棒状透镜120毫米，SF11棒状透镜100毫米 |
| Insight DS+ | Newport | 激光系统，可输出两束同步脉冲激光（一束固定波长为1,040纳米，另一束可调谐，波长范围为680-1,300纳米），重复频率为80兆赫。 | |
| 锁相放大器 | Liquid Instruments | Moku Lab | 用于从光电二极管中提取SRS信号的锁相放大器。也可使用Zurich Instrument HF2LI或类似仪器。 |
| 反射镜 | THORLABS | BB05-E03-10 | 宽带介质反射镜，750 - 1,100 纳米。也可使用银镜。 |
| 电动延迟台 | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | 用于精细控制泵浦光与斯托克斯光激光时间重叠的延迟台。其他任何电动平台也可使用。 |
| 油浸式聚光镜 | Nikon | CSC1003 | 1.4 数值孔径。也可使用数值孔径>1.2 的其他聚光镜。 |
| 示波器 | Tektronix | TDS7054 | 任何带宽为400兆赫或更高的其他示波器均可使用。 |
| 相位移器 | SigaTek | SF50A2 | 用于调节调制频率的相位 |
| 光电二极管 | Hamamatsu Corp | S3994-01 | 大面积硅PIN二极管（10 x 10 厘米2）。也可使用其他大面积且低电容的二极管。 |
| 偏振分束器 | Union Optic | PBS9025-620-1000 | 宽带偏振分束器 |
| 折射率数据库 | refractiveindex.info | ||
| 后向反射器 | Edmund Optics | 34-408 | 宽带增透膜直角棱镜。也可使用其他棱镜或后向反射器。 |
| 射频功率放大器 | Minicircuits | ZHL-1-2W+ | 增益模块，5 - 500 兆赫，50 Ω |
| 扫描反射镜 | Cambridge Technologies | 6215H | 我们使用了一组镀银的5毫米反射镜 |
| ScanImage | Vidrio | ScanImage Basic | 激光扫描显微镜控制软件 |
| 短通滤波器 | THORLABS | FESH1000 | 25.0 毫米优质短通滤波器，截止波长：1,000 纳米。为有效抑制斯托克斯光，可能需要两个滤波器。 |
| 正置显微镜 | Nikon | Eclipse FN1 | 可使用其他任何显微镜框架。如果有激光扫描显微镜，可直接使用；否则，需在显微镜上添加振镜扫描器和扫描透镜。 |
| 水浸物镜 | Olympus | XLPLN25XWMP2 | 多光子25倍物镜的数值孔径为1.05。其他类似的物镜也可使用。 |
参考文献
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