小鼠脑组织诊断的实时双色受激拉曼散射成像

摘要

受激拉曼散射（SRS）显微技术是一种强大、无损且无需标记的成像技术。其中一个新兴应用是受激拉曼组织学，该方法利用蛋白质和脂质拉曼跃迁处的双色SRS成像生成类似苏木精和伊红染色的图像。本文中，我们展示了一种用于组织诊断的实时双色SRS成像方案。

摘要

受激拉曼散射（SRS）显微技术已成为一种强大的光学成像方法，可用于组织病理诊断。近年来，双色SRS被证明能够提供相当于苏木精-伊红（H&E）染色的图像，从而实现脑癌的快速且可靠的诊断。这一能力推动了术中癌症诊断的诸多创新应用。组织的双色SRS成像可采用皮秒或飞秒激光光源实现。飞秒激光的优势在于支持多种灵活的成像模式，包括快速高光谱成像和实时双色SRS成像。通常采用具有啁啾特性的激光脉冲进行光谱聚焦，以配合飞秒激光实现高光谱分辨率。

双色受激拉曼散射（SRS）成像可通过正交调制与锁相检测实现。脉冲啁啾、调制及表征的复杂性是该方法广泛应用的主要瓶颈。本文提供了一套详细的操作方案，用于演示频谱聚焦型SRS的实现与优化，以及在倒置模式下对小鼠脑组织进行实时双色成像。本方案可适用于多种利用SRS高速度和光谱成像能力的SRS成像应用。

引言

传统的组织学诊断依赖于染色方案，随后在光学显微镜下进行观察。病理学家常用的一种染色方法是H&E染色：苏木精将细胞核染成紫蓝色，伊红则将细胞外基质和细胞质染成粉红色。这种简单的染色方法至今仍是多种组织学诊断（尤其是癌症诊断）的金标准。然而，H&E组织病理学检查，特别是在术中环境下使用的冰冻切片技术，仍存在局限性。染色过程繁琐，涉及组织包埋、切片、固定和染色等多个步骤¹。通常需要20分钟或更长的周转时间。在术中进行冰冻切片H&E染色时，若需同时处理多个切片，由于必须评估细胞特征或生长模式的三维结构以判断切缘情况，操作可能变得更加困难。此外，术中组织学技术依赖于熟练的技术人员和临床医生。许多医院中具备资质认证的病理学家数量有限，这在很大程度上限制了术中会诊的实施。随着数字病理学和基于人工智能的诊断技术的快速发展，这些限制有望得到缓解²。然而，H&E染色结果具有变异性，其质量依赖于技术人员的经验，这为基于计算机的诊断带来了额外挑战²。

这些挑战有望通过无标记光学成像技术得到解决。其中一种技术是受激拉曼散射（SRS）显微成像。SRS利用同步脉冲激光——泵浦光和斯托克斯光——高效激发分子振动³。近期研究表明，对蛋白质和脂质进行SRS成像可直接在未经处理的新鲜组织上生成....

方案

所有实验动物操作均使用200 µm厚的固定切片小鼠脑组织进行，遵循华盛顿大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案（# 4395-01）。野生型小鼠（C57BL/6J品系）以CO₂安乐死。随后进行开颅手术以取出脑组织，并在磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛中固定。脑组织被包埋于3%琼脂糖和0.3%明胶的混合物中，并使用振动切片机切成200 μm厚的切片。

1. 初始比对

注意：为获得最佳灵敏度和分辨率，需确保两束光的光束尺寸和发散角相匹配。在泵浦光束和斯托克斯光束进入激光扫描显微镜之前，对其进行准直并调节光束尺寸。为此，可在每束光进入二向色镜前使用一对消色差透镜。进行光束准直时，务必佩戴合适的激光防护眼镜。

1. 光束准直
   1. 为泵浦光束安装一对消色差透镜。作为初始设置，使用焦距为100 mm和200 mm的透镜，将激光光束尺寸放大2倍。确保两透镜之间的距离约为300 mm。将泵浦光束对准两个透镜的中心并通过。
   2. 在第二个透镜后放置一面反射镜，将光束引向远处墙面（>1 m远）。长距离传输光束时需格外小心。使用红外卡纸从反射镜到墙面追踪光束，并检查光束尺寸是否随传播距离发生变化。若光束尺寸随距离变化，则需对光束进行准直。
      1. 若光束会聚（传播过程中尺寸减小），则将两个透镜相互靠近移动。<....

结果

优化光谱分辨率：
材料中的色散效应受色散介质（长度和材料）以及波长的影响。改变色散棒的长度会影响光谱分辨率和信号大小。这是一种权衡关系，可根据具体应用需求进行调整。色散棒可将光束脉冲从频域宽、时域窄的状态展宽为频域窄、时域宽的状态。图7展示了不同色散棒长度对光谱分辨率的影响。图7A显示光谱分辨率极差；该配置未使用玻璃啁啾棒，二甲亚砜（DMSO）的两个拉曼峰完全无法分辨。在图7B、C中，随着玻璃啁啾棒数量的增加，两个拉曼峰开始得以分辨。最后，图7D展示了匹配啁啾如何实现两个峰的完全分辨，并可用于将位移台位置校准至频率。

使用 DMSO 进行校准：
DMSO 在 C-H 区域具有两个尖锐的拉曼峰，分别位于 2,913 和 2,994 .......

讨论

本方案中介绍的双色SRS成像技术依赖于单色SRS成像的正确实施。在单色SRS成像中，关键步骤包括空间对准、时间对准、调制深度和相位偏移。两束光的空间合并通过二向色镜实现。在将光束导向二向色镜时，使用多个转向镜进行精细调节。一旦光束通过二向色镜合并，可通过用一面镜子分出合并后的光路并投射到墙面来确认空间对准情况 >1 米处，同时检查合束是否与红外卡重叠。通过显微镜完成空间对准后，利用基于后向反射镜的延迟平台调节光程长度，实现时间重叠，该方法的优势在于可保持空间对准不变。本方案中，1,040 nm 光臂为延迟光束。若延迟平台的调节范围不足以使两束光在时间上重叠，则无法实现时间重叠。此时，可能需要将整个延迟平台移至不同位置，以确保时间重叠点位于延迟扫描范围的中部附近。例如，若测得两束光之间的时间差为 6 ns，则需要进行 1.8 米的调节。该调节量表示对较快光束的光路进行延长，或对较慢光束的光路进行缩短的长度。

除了光束对准之外，斯托克斯（Stokes）光束的光斑尺寸匹配和调制也对最大化受激拉曼散射（SRS）信号至关重要。理想情况下，两束光均应在物镜平面处准直，并与物镜后光阑的尺.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 毫米消色差透镜	THORLABS	AC254-100-B	宽带，650 - 1,050 纳米，消色差透镜焦距，100 毫米
20 兆赫带通滤波器	Minicircuits	BBP-21.4+	集总LC带通滤波器，19.2 - 23.6 兆赫，50 Ω
200 毫米消色差透镜	THORLABS	AC254-200-B	宽带，650 - 1,050 纳米，消色差透镜焦距，200 毫米
消色差半波片	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	宽带半波片
消色差四分之一波片	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	宽带四分之一波片
光束取样器	THORLABS	BSN11	10:90 板式分束器
二向色镜	THORLABS	DMSP1000	可使用其他中心波长约为 1,000 纳米的二向色镜。
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma Aldrich	472301	用于拉曼位移校准的溶剂。也可使用其他具有已知拉曼峰的溶剂。
电光幅度调制器	THORLABS	EO-AM-NR-C1	正交调制和双通道成像需要两个电光调制器。建议使用谐振版本，以便使用较低的驱动电压。
假H&E染色脚本	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
扇出缓冲器	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS扇出缓冲器和线路驱动器，用于生成电光调制器驱动频率及锁相参考信号
快速光电二极管	THORLABS	DET10A2	硅探测器，1 纳秒上升时间
频率分频器	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL频率分频器（f/2, f/4, f/8, f/16），用于从激光输出生成20兆赫信号。
高色散玻璃棒	Union Optic	CYLROD01	高色散H-ZF52A棒状透镜120毫米，SF11棒状透镜100毫米
Insight DS+	Newport		激光系统，可输出两束同步脉冲激光（一束固定波长为1,040纳米，另一束可调谐，波长范围为680-1,300纳米），重复频率为80兆赫。
锁相放大器	Liquid Instruments	Moku Lab	用于从光电二极管中提取SRS信号的锁相放大器。也可使用Zurich Instrument HF2LI或类似仪器。
反射镜	THORLABS	BB05-E03-10	宽带介质反射镜，750 - 1,100 纳米。也可使用银镜。
电动延迟台	Zaber	X-DMQ12P-DE52	用于精细控制泵浦光与斯托克斯光激光时间重叠的延迟台。其他任何电动平台也可使用。
油浸式聚光镜	Nikon	CSC1003	1.4 数值孔径。也可使用数值孔径>1.2 的其他聚光镜。
示波器	Tektronix	TDS7054	任何带宽为400兆赫或更高的其他示波器均可使用。
相位移器	SigaTek	SF50A2	用于调节调制频率的相位
光电二极管	Hamamatsu Corp	S3994-01	大面积硅PIN二极管（10 x 10 厘米2）。也可使用其他大面积且低电容的二极管。
偏振分束器	Union Optic	PBS9025-620-1000	宽带偏振分束器
折射率数据库			refractiveindex.info
后向反射器	Edmund Optics	34-408	宽带增透膜直角棱镜。也可使用其他棱镜或后向反射器。
射频功率放大器	Minicircuits	ZHL-1-2W+	增益模块，5 - 500 兆赫，50 Ω
扫描反射镜	Cambridge Technologies	6215H	我们使用了一组镀银的5毫米反射镜
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	激光扫描显微镜控制软件
短通滤波器	THORLABS	FESH1000	25.0 毫米优质短通滤波器，截止波长：1,000 纳米。为有效抑制斯托克斯光，可能需要两个滤波器。
正置显微镜	Nikon	Eclipse FN1	可使用其他任何显微镜框架。如果有激光扫描显微镜，可直接使用；否则，需在显微镜上添加振镜扫描器和扫描透镜。
水浸物镜	Olympus	XLPLN25XWMP2	多光子25倍物镜的数值孔径为1.05。其他类似的物镜也可使用。