利用脉冲振幅调制叶绿素荧光测定法对作物非光化学淬灭进行高通量分析

摘要

该方案介绍了一种利用脉冲振幅调制叶绿素荧光测定法高通量测量非光化学淬灭弛豫过程的方法。该方法已应用于大田种植的Glycine max，并可适用于其他物种，用于筛选遗传多样性或育种群体。

摘要

现代作物品种的光合作用并未达到最优状态，因此存在改进空间。加快非光化学猝灭（NPQ）的恢复速度已被证明是提高光合性能的有效策略。然而，由于对田间种植作物植株进行取样和数据采集存在局限性，目前尚缺乏通过育种手段改良NPQ的潜力以及对NPQ恢复遗传基础的全面理解。在先前研究基础上，本文介绍了一种利用脉冲振幅调制（PAM）叶绿素荧光测定法对大豆（Glycine max）NPQ恢复速率进行高通量分析的实验方法。从田间种植的大豆植株上采集叶片圆片，运输至实验室后，在封闭式PAM荧光仪中测定NPQ的恢复过程。通过将双指数函数拟合到由高光转为低光后测得的NPQ数值，计算出NPQ恢复参数。利用该方法，可在一天内检测数百个基因型。该流程可用于筛选突变体库和遗传多样性群体中NPQ恢复的变异，因此可应用于基础研究和应用研究中的多种科学问题。

引言

光合作用包括光吸收、初级电子传递、能量稳定以及光合产物的合成与运输¹。理解每一步骤对于指导提高作物光合效率的努力至关重要。光照影响光合作用速率，需要将光子形式的能量供应与还原当量的需求相平衡。当供应超过需求时，例如在强光条件下或由于气孔关闭导致CO₂固定减少时，还原力的积累会增加活性氧物种形成的概率，从而可能损伤光合机构并阻碍电子传递。因此，为防止损伤，植物已进化出多种光保护机制，包括活性氧物种的解毒以及叶绿素激发态的非光化学猝灭（NPQ）²。

在田间环境中维持较高的光合作用速率具有挑战性。季节性和昼夜变化，以及风引起的叶片运动和短暂的云层覆盖等环境波动，会导致植物进行光合作用所接收的光照量和光强发生变化³。非光化学猝灭（NPQ）能够耗散多余的光能，有助于防止强光下的光损伤，同时维持较高的光合作用速率⁴。然而，在由高光强转为低光强的过程中，NPQ若持续时间过长，会继续耗散本可用于碳还原的能量⁵。因此，加快NPQ的弛豫过程可提高光合作用效率⁶，使NPQ弛豫成为作物改良的一个理想靶点。

脉冲振幅调制叶绿素荧光（PAM）分析可用于根据可测量参数计算非光化学淬灭（NPQ）（补充表 1 和 补充表 2）^7,8,9。本文重点介绍如何测定田间生长植物中NPQ的弛豫速率，以用于筛选种质资源中的自然变异。然而，PAM叶绿素荧光分析也可广泛应用于从藻类到高等植物等多种物种，并已在其他文献中进行了综述^7,8,9。

在暗适应的叶片或细胞中，光系统II（PSII）反应中心处于开放状态，能够接收电子，此时不存在非光化学猝灭（NPQ）。开启低强度的测量光可激发叶绿素荧光，同时避免激发PSII中的电子传递。在此暗适应状态下记录到的最小荧光值用参数 F_o 表示。对暗适应的叶片施加一次高强度的光脉冲，可迅速还原结合在醌A位点上的醌类物质所构成的第一个稳定电子受体库。这会暂时阻断PSII反应中心的电子传递能力，此时反应中心被称为关闭状态，无法从水裂解过程中接收电子。由于采用的是短暂的脉冲持续时间，不足以诱导NPQ的发生。此时测得的叶绿素荧光相当于在无NPQ条件下所能达到的最大荧光值，即最大荧光 F_m。最小荧光与最大荧光之间的差值称为可变荧光 F_v。光系统II的最大光化学量子产率（F_v/F_m）由这两个参数通过以下公式计算得出：

F_v/F_m = (F_m-F_o)/F_m

这可以作为光系统功能和胁迫状态的重要指标。开启激发光（光合作用光）会诱导非光化学淬灭，随后施加一个饱和脉冲光，可测定光适应状态下的最大荧光值 F_m'。通过比较暗适应与光适应状态下的最大荧光差异，可根据 Stern-Volmer 方程¹⁰计算 NPQ：

NPQ = F_m/F_m' - 1

在高等植物中，非光化学淬灭（NPQ）被认为至少包含五个不同的组分，即qE、qT、qZ、qI和qH。目前对NPQ所涉及的精确机制尚未完全阐明；然而，qE被认为是大多数植物中NPQ的主要组分。实现qE充分激活的关键因素包括类囊体膜上质子梯度的建立、光系统II亚基S^11,12的活性，以及去环氧化的叶黄素类物质，如玉米黄质、花药黄质、叶黄素，尤其是玉米黄质¹³。qE是所有NPQ组分中弛豫速度最快的（< 2分钟）¹⁴，因此qE的可逆性激活对于适应变化的光照强度尤为重要。NPQ的第二个较慢弛豫阶段（约2–30分钟）包括与状态转换相关的qT，以及涉及玉米黄质向紫黄质转化的qZ¹⁵。缓慢弛豫（> 30分钟）的NPQ可能包含光抑制性淬灭（qI）¹⁶以及与光损伤无关的过程^17,18，例如qH，即由质体脂质运载蛋白介导的光系统II外周天线中持续存在的淬灭过程^19,20。

在强光照射下，非光化学猝灭（NPQ）会增强。随后转移至弱光条件可能导致NPQ下调。快速、中速和慢速弛豫相的衰减过程可通过双指数函数的参数进行描述^15,21,22,23

NPQ = Aq1^(-t/τ1) + Aq2^(-t/τ2) + Aq3

双指数函数的理论基础源于对假设淬灭剂一级利用的假设，包括qE（Aq1）、qZ和qT的联合弛豫（Aq2），其对应的时间常数分别为τq1和τq2，以及长期的非光化学淬灭（NPQ），后者包含qI和与光损伤无关的过程（Aq3）。因此，与缺乏理论基础的简单Hill方程相比，双指数函数能够更真实地反映参与叶绿素荧光淬灭的多个相互关联的生物学过程²⁴。

NPQ 可使用多种市售的 PAM 荧光仪进行测量^25,26，从简单的手持设备²⁷到更先进的封闭系统²⁸均有应用。然而，这些方法中的一些存在通量相对较低的局限性，若无多台设备和研究人员团队，对大量植物样本进行筛选将具有挑战性。为解决这一问题，McAusland 等人开发了一种基于离体叶片组织的实验方法，并利用该方法鉴定出两种小麦品种之间在叶绿素荧光上的差异²⁹。该方法的优势在于，使用单一设备从多株植物上取样获得的叶盘进行成像，可在一天内实现对数百个基因型的筛选。这使得将 NPQ 恢复过程中的变异评估应用于全基因组关联研究成为可能，也可用于育种种群的筛选，从而有望提高作物的光合效率并最终提升产量。

基于McAusland等人的研究结果²⁹，我们采用叶盘的PAM叶绿素荧光分析法，对大豆（Glycine max（G. max））的非光化学猝灭（NPQ）弛豫速率进行高通量筛选。本实验方案使用CF Imager²⁵，其性能与其他市售的闭合式PAM系统（如广泛应用的FluorCam²⁶）相当。在配备暗适应室的条件下，用户可对96孔板、培养皿以及小型植株进行成像。该方法的关键优势在于，相比对单株植物进行逐个分析，使用叶盘可显著提高通量。本文展示了代表性实验结果，并提供了针对田间生长植株的取样、测量及NPQ分析方法。

方案

1. 种子播种

1. 选择土壤肥沃、排水良好但非沙质、pH值接近6.5的田间地点。使用锄头在地表划线，标记出1.2米长的行距，行间距为0.75米。
2. 在生长季初期，当土壤温度处于25至30 °C时，沿每行以3厘米深度播种50粒/m的G. max cv. IA3023。
   注意：为了筛选遗传多样性，应种植并比较多种不同基因型。每种基因型种植2至5行，采用随机区组设计。需考虑气候条件是否适合大豆生长，包括土壤类型、温度和日照长度。

2. 从野外采集叶片样本

1. 在萌发后30天采集田间试验点的植物样品。
   注意：大豆植株在萌发30天后将进入营养生长期。采样前的萌发后天数取决于所研究的生物学问题。
2. 将24孔板的孔加液至1/3满^rd 用蒸馏水。在平板的盖子和侧面标记待取样的重复组。
3. 选择植株顶部最幼嫩且完全展开的叶片进行取样。将叶片紧贴橡胶塞固定。
4. 使用#2号Humboldt打孔器穿过叶片并旋转以切割叶盘，注意避开主脉。从同一叶片连续采集5个叶盘作为技术重复。每个样地采集的叶盘数量应比所需数量多出约30%，以应对运输或取样过程中可能造成的组织损伤。
   ​注意：生物学重复（样地或植株）的数量和技术重复（来自同一植株或样地的叶盘）的数量可根据实验设计而有所不同。
5. 用棉签将叶圆片从打孔器中推出，放入24孔板的单个孔中。检查所有叶圆片是否均浮在水面上。若未漂浮，用棉签轻轻将粘附在孔壁上的叶圆片移至漂浮状态。
6. 转移到下一个样地，重复步骤 2.3 至 2.5。用棉签将叶圆片从打孔器中推出，放入 24 孔板中的另一个独立孔内。重复此步骤以收集第三个生物学重复样本。
7. 重复步骤 2.6，直至完成整块 24 孔板的取样。盖上盖子，并用半透明、有弹性的封口膜密封。将该板置于避光处，放入袋中、盒子中或空的冷藏箱中（无需加冰）保存。 

3. 分析样品的制备

1. 采样后返回洁净的实验区域。轻敲密封培养皿的盖子，使运输过程中粘附在盖子上的叶盘脱落。揭开封膜，取下盖子。
2. 从24孔板的第一个位置取出一个叶盘，转移至一个新的96孔板中，使叶盘平整地朝下放置于孔底。
3. 将一个鼻吸器滤膜剪成两半。将其中一半浸入水中约一半深度，然后在纸巾上轻拍以去除多余液体。将该滤膜插入含有叶盘的孔中，以维持湿度。
4. 从24孔板的第一个位置取出第二个叶盘，同样朝下放置于96孔板的下一个可用孔位中。将步骤3.3中剩余的另一半鼻吸器滤膜浸入水中，取出后在纸巾上轻拍去除多余水分，再插入该孔中与第二个叶盘一同放置。
5. 对来自24孔板第一个位置的第三个叶盘重复步骤3.3至3.4。
6. 转至24孔板的第二个位置，并重复步骤3.3至3.5。
7. 当所有孔中均已放入叶盘和鼻吸器滤膜后，盖上培养皿盖子。用胶带固定右上角，以便在黑暗条件下成像时确定培养皿方向。
8. 使用半透明、柔性的封膜密封培养皿，并用铝箔纸包裹整个培养皿。在铝箔纸上标注地块编号和培养皿编号。
9. 将培养皿置于暗箱或暗柜中至少30分钟，以允许NPQ的前两个相（qE、qT、qZ）充分弛豫。若需研究NPQ的长期相，则应在成像前进行更长时间的暗孵育（1小时）。
10. 准备一个额外的空白对照培养皿，用于分析过程中的聚焦操作。具体做法为：在一个新的96孔板的四个角孔及中心孔各放置一个叶盘，并使用鼻吸器滤膜固定叶盘，操作方式与前述培养皿相同。密封该培养皿后，在室温（24 °C）、相对湿度约50%的条件下于暗处孵育。

4. 使用叶绿素荧光成像仪测量非光化学淬灭

1. 打开成像仪并启动成像软件。点击 设置 > 实验方案 以打开 PAM 实验方案步骤输入窗口。该仪器的技术参数如下所示 补充表3.
2. 将程序设置为以饱和脉冲开始，以测量暗适应光合作用的最大量子效率：在“延迟时间”框中输入 20 s。点击该框 施加脉冲 并输入数字 1 到“次数”框中。
3. 将脉冲PPFD设为6152，脉冲时长设为800 ms，并勾选复选框 取 F' & 所有脉冲的 Fm' 图像. 点击 插入至之后 向实验方案中添加第二个步骤。
4. 在“延迟”框中输入 30 s。选择该选项 改变激发光 在“光化光量子通量密度（Actinic PPFD）”输入框中输入50，将腔室内的光照强度设定为50 PPFD。
5. 点击 插入至之后 添加新步骤到实验方案。在“延迟时间”输入框中输入 150 s，选择 施加脉冲 并在输入框中输入 4：在 50 PPFD 的光化光强度下，每隔 150 秒施加一次测量脉冲，连续重复 4 次。
6. 本方案的完整信息见于 表1，使用步骤 4.2 和 4.3 调整光强，使用步骤 4.4 和 4.5 设置饱和脉冲循环。根据所提供的数值，调整每一步的延迟时间和光强。 表1将您的实验方案保存为 .pcl 文件，并存放在已知位置。
7. 关闭光源，将假板放置在样品台上，并调节样品台高度，使叶盘位于仪器底座上方140 mm处。使用假板是因为在对焦过程中光线会反复闪烁照射到板面上；若直接使用待测样品，将需要反复进行暗适应，且可能造成光损伤。
8. 点击 连接/断开成像相机与硬件 单击摄像头图标以启动摄像头。单击 焦点（荧光） 由一个红色双头箭头图标表示，图标底部有两条绿色线条。调整镜头和曝光，使平板进入焦点。
9. 点击 焦点（荧光） 再次点击图标以关闭闪烁的灯光。在黑暗中，将空白板替换为待分析的样品板。
10. 点击 地图图像 相机图标。通过打开或关闭光圈调整图像曝光，直至弹出窗口中的指示条位于绿色区域。
11. 点击 再试一次 每次调整光圈后，点击按钮，直至曝光正确调整，仪器完成成像。右键点击图像并选择 应用图像分离 以消除背景信号。聚焦的叶片区域将显示为灰色，背景显示为蓝色。
12. 通过右键单击图像，从“修改图像”下拉菜单中调整直方图和伽马值，选择感兴趣的区域/像素，仅包含叶圆片。
13. 右键单击图像并选择 删除高低裁剪（颜色图） 删除浅蓝色高亮区域。右键单击图像并选择 删除杂散（重度） 去除所有未与至少三个其他像素接触的像素。
    注意：图像中显示为孤立区域的部分将被单独分析，并包含在最终的数据输出中。通过图像分离和去除散在像素，可获得清晰且易于理解的数据。
14. 点击 运行实验方案 程序启动后，屏幕底部将出现一个计时器，提示您该实验方案剩余的运行时间。
15. 等待协议完成，然后单击 文件 > 另存为并将数据保存为 .igr 文件。在开始运行下一个样品板之前，单击窗口右上角的红色叉号关闭窗口。
16. 通过选择为下一个样本打开一个新文件 文件 > 新 重复步骤 4.10 至 4.15，直至所有培养板均完成测量。
    ​注意：建议在4小时或更短时间内完成对培养板的测量，以尽量减少昼夜节律调控对结果的潜在影响

5. 叶绿素荧光数据处理

1. 在成像软件中打开 .igr 文件。点击 文件 > 导出到文件夹 导出数据，以创建一个包含所有必要文件的新文件夹。
2. 将以下三个 MATLAB 文件复制到生成的文件夹中：MapAndLabelDiscs.m（补充文件 1）、ProcessFoFm.m（补充文件 2）和 ProcessNPQdata.m（补充文件 3），以及 R 文件：create_file_to_process.R（补充文件 4）。
3. 在 MATLAB 中打开 MapAndLabelDiscs.m（补充文件 1）并运行。将弹出窗口中生成的编号叶片圆盘图保存为 .png 文件，以便后续核对叶片圆盘编号。
4. 在 MATLAB 中打开文件 ProcessFoFm.m（补充文件 2）并运行，以计算每个叶片圆盘的 F_o 和 F_m 值。运行 ProcessNPQdata.m（补充文件 3）以计算每个时间点的 NPQ 值。
5. 在 Rstudio 中打开文件 create_file_to_process.R（补充文件 4），并将日期添加到第 5 行的代码中。将培养板编号添加到 create_file_to_process.R 的第 8 行。
6. 运行 create_file_to_process.R，将 F_v/F_m 值和 NPQ 数据整合到一个文件中，该文件以数据命名，并带有后缀 -cf-summary.csv。使用第 5.3 步生成的 .png 文件核对第 5.5 步中 cf-summary 文件的叶片圆盘编号，并补充添加与样地编号和材料编号相关的信息。
7. 打开 R 脚本 CF-data-processing_2.R（补充文件 5），并将第 13 行修改为工作目录路径。将 CF-data-processing_2.R 中的第 16 行修改为第 5.5 步生成的文件名。
8. 将 CF-data-processing_2.R 中的第 48 行修改为输出文件的名称。运行脚本 CF-data-processing_2.R，以重新格式化数据用于曲线拟合。
9. 在 MATLAB 中打开脚本 MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m（补充文件 6），并将第 5 行修改为第 5.8 步输出文件的名称。将 MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m 中的第 85 行修改为新的输出文件名。运行脚本 MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m，以计算 NPQ 驰豫参数。

结果

图1A展示了在田间种植的大豆中NPQ的典型测量结果。植物于2021年夏季种植于美国伊利诺伊州厄巴纳（纬度40.084604°，经度-88.227952°），种子播种日期为2021年6月5日。播种30天后采集叶片圆片，并按照所提供的方案进行测量（表1）。每个叶片圆片的F_v/F_m和NPQ值均被计算（补充表4），并通过拟合双指数函数计算NPQ的弛豫参数（表2）。首先施加一个饱和脉冲光以测定F_v/F_m，随后将叶片圆片暴露于低光强（50 µmol m⁻²s⁻¹）条件下，测得的NPQ值< 1（图1A）。当转入高光强（2000 µmol m⁻²s⁻¹）时，NPQ迅速上升，并在15分钟后达到最大值4。重新返回低光强后，NPQ出现快速的初始下降阶段...

讨论

仔细选择和处理叶圆片对于获得可靠的非光化学淬灭（NPQ）测量结果至关重要。首先，组织损伤（例如使用镊子粗暴操作）会引入胁迫，导致光合作用最大量子效率的测量值偏低。未受胁迫的植物通常具有 F_v/F_m 约 0.83 的值¹⁸，显著下降表明光合作用性能降低⁹然而，在田间条件下生长的植物通常经历轻度胁迫，因此需设定一个阈值 F_vF_m > 0.75 被设定为纳入标准，依据是先前研究将此值作为光合作用开始下降的界限³⁰鼻腔吸液器滤膜用于固定叶圆片，其操作不当是另一个常见的问题来源。若鼻腔吸液器滤膜过度饱和，多余的水分将对叶片生理状态产生负面影响，导致量子效率降低；实验过程中必须使用同一品牌滤膜，因为不同品牌的滤膜持水量可能存在差异。第三，田间种植的植株处于不断变化的环境中，降雨量、温度、湿度以及昆虫压力均存在差异。植株的生长阶段也会影响叶绿素...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔组织培养板	Fisher Scientific	FB012929	原产国：美国
96孔组织培养板	Fisher Scientific	FB012931	原产国：美国
铝箔	Antylia Scientific	61018-56	原产国：美国
黑色记号笔	Sharpie	SAN30001	原产国：美国
CF成像仪	Technologica Ltd.	N/A	叶绿素荧光成像仪 原产国：英国
打孔器，7 mm	Humboldt Mfg Co	H9665	原产国：美国
FluorImager V2.305 软件	Technologica Ltd.	N/A	成像软件 原产国：英国
iHank-Nose 高级鼻吸器卫生过滤器 100片装	亚马逊	B07P6XCTGV	原产国：美国
标记桩	John Henry Company	KN0151	原产国：美国
纸张剪刀	VWR	82027-596	原产国：美国
Parafilm封口膜	Bemis Company Inc.	S3-594-6	半透明柔性薄膜 原产国：美国
实心橡胶塞	Fisher Scientific	14-130M	原产国：美国