利用脉冲振幅调制叶绿素荧光测定法对作物非光化学淬灭进行高通量分析

摘要

该方案介绍了一种利用脉冲振幅调制叶绿素荧光测定法高通量测量非光化学淬灭弛豫过程的方法。该方法已应用于大田种植的Glycine max，并可适用于其他物种，用于筛选遗传多样性或育种群体。

摘要

现代作物品种的光合作用并未达到最优状态，因此存在改进空间。加快非光化学猝灭（NPQ）的恢复速度已被证明是提高光合性能的有效策略。然而，由于对田间种植作物植株进行取样和数据采集存在局限性，目前尚缺乏通过育种手段改良NPQ的潜力以及对NPQ恢复遗传基础的全面理解。在先前研究基础上，本文介绍了一种利用脉冲振幅调制（PAM）叶绿素荧光测定法对大豆（Glycine max）NPQ恢复速率进行高通量分析的实验方法。从田间种植的大豆植株上采集叶片圆片，运输至实验室后，在封闭式PAM荧光仪中测定NPQ的恢复过程。通过将双指数函数拟合到由高光转为低光后测得的NPQ数值，计算出NPQ恢复参数。利用该方法，可在一天内检测数百个基因型。该流程可用于筛选突变体库和遗传多样性群体中NPQ恢复的变异，因此可应用于基础研究和应用研究中的多种科学问题。

引言

光合作用包括光吸收、初级电子传递、能量稳定以及光合产物的合成与运输¹。理解每一步骤对于指导提高作物光合效率的努力至关重要。光照影响光合作用速率，需要将光子形式的能量供应与还原当量的需求相平衡。当供应超过需求时，例如在强光条件下或由于气孔关闭导致CO₂固定减少时，还原力的积累会增加活性氧物种形成的概率，从而可能损伤光合机构并阻碍电子传递。因此，为防止损伤，植物已进化出多种光保护机制，包括活性氧物种的解毒以及叶绿素激发态的非光化学猝灭（NPQ）²。

在田间环境中维持较高的光合作用速率具有挑战性。季节性和昼夜变化，以及风引起的叶片运动和短暂的云层覆盖等环境波动，会导致植物进行光合作用所接收的光照量和光强发生变化³。非光化学猝灭（NPQ）能够耗散多余的光能，有助于防止强光下的光损伤，同时维持较高的光合作用速率⁴。然而，在由高光强转为低光强的过程中，NPQ若持续时间过长，会继续耗散本可用于碳还原的能量⁵。因此，加快NPQ的弛豫过程可提高光合作用效率⁶，使NPQ弛豫成为作物改良的一个理想靶点。

脉冲振幅调制叶绿素荧光（PAM）分....

方案

1. 种子播种

1. 选择土壤肥沃、排水良好但非沙质、pH值接近6.5的田间地点。使用锄头在地表划线，标记出1.2米长的行距，行间距为0.75米。
2. 在生长季初期，当土壤温度处于25至30 °C时，沿每行以3厘米深度播种50粒/m的G. max cv. IA3023。
   注意：为了筛选遗传多样性，应种植并比较多种不同基因型。每种基因型种植2至5行，采用随机区组设计。需考虑气候条件是否适合大豆生长，包括土壤类型、温度和日照长度。

2. 从野外采集叶片样本

1. 在萌发后30天采集田间试验点的植物样品。
   注意：大豆植株在萌发30天后将进入营养生长期。采样前的萌发后天数取决于所研究的生物学问题。
2. 将24孔板的孔加液至1/3满^rd 用蒸馏水。在平板的盖子和侧面标记待取样的重复组。
3. 选择植株顶部最幼嫩且完全展开的叶片进行取样。将叶片紧贴橡胶塞固定。
4. 使用#2号Humboldt打孔器穿过叶片并旋转以切割叶盘，注意避开主脉。从同一叶片连续采集5个叶盘作为技术重复。每个样地采集的叶盘数量应比所需数量多出约30%，以应对运输或取样过程中可能造成的组织损伤。
   ​注意：生物学重复（样地或植株）的数量和技术重复（来自....

结果

图1A展示了在田间种植的大豆中NPQ的典型测量结果。植物于2021年夏季种植于美国伊利诺伊州厄巴纳（纬度40.084604°，经度-88.227952°），种子播种日期为2021年6月5日。播种30天后采集叶片圆片，并按照所提供的方案进行测量（表1）。每个叶片圆片的F_v/F_m和NPQ值均被计算（补充表4），并通过拟合双指数函数计算NPQ的弛豫参数（表2）。首先施加一个饱和脉冲光以测定F_v/F_m，随后将叶片圆片暴露于低光强（50 µmol m⁻²s⁻¹）条件下，测得的NPQ值< 1（图1A）。当转入高光强（2000 µmol m⁻²s⁻¹）时，NPQ迅速上升，并在15分钟后达到最大值4。重新返回低光强后，NPQ出现快速的初始下降阶段.......

讨论

仔细选择和处理叶圆片对于获得可靠的非光化学淬灭（NPQ）测量结果至关重要。首先，组织损伤（例如使用镊子粗暴操作）会引入胁迫，导致光合作用最大量子效率的测量值偏低。未受胁迫的植物通常具有 F_v/F_m 约 0.83 的值¹⁸，显著下降表明光合作用性能降低⁹然而，在田间条件下生长的植物通常经历轻度胁迫，因此需设定一个阈值 F_vF_m > 0.75 被设定为纳入标准，依据是先前研究将此值作为光合作用开始下降的界限³⁰鼻腔吸液器滤膜用于固定叶圆片，其操作不当是另一个常见的问题来源。若鼻腔吸液器滤膜过度饱和，多余的水分将对叶片生理状态产生负面影响，导致量子效率降低；实验过程中必须使用同一品牌滤膜，因为不同品牌的滤膜持水量可能存在差异。第三，田间种植的植株处于不断变化的环境中，降雨量、温度、湿度以及昆虫压力均存在差异。植株的生长阶段也会影响叶绿素.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔组织培养板	Fisher Scientific	FB012929	原产国：美国
96孔组织培养板	Fisher Scientific	FB012931	原产国：美国
铝箔	Antylia Scientific	61018-56	原产国：美国
黑色记号笔	Sharpie	SAN30001	原产国：美国
CF成像仪	Technologica Ltd.	N/A	叶绿素荧光成像仪 原产国：英国
打孔器，7 mm	Humboldt Mfg Co	H9665	原产国：美国
FluorImager V2.305 软件	Technologica Ltd.	N/A	成像软件 原产国：英国
iHank-Nose 高级鼻吸器卫生过滤器 100片装	亚马逊	B07P6XCTGV	原产国：美国
标记桩	John Henry Company	KN0151	原产国：美国
纸张剪刀	VWR	82027-596	原产国：美国
Parafilm封口膜	Bemis Company Inc.	S3-594-6	半透明柔性薄膜 原产国：美国
实心橡胶塞	Fisher Scientific	14-130M	原产国：美国