本方案可用于对自交型Caenorhabditis线虫进行大规模生态学调查。该方法的主要优势在于能够高效地整理和分析从自然界采集的线虫所关联的生态学与分子数据。
本文内容
摘要
摘要
Caenorhabditis elegans 是生物学中的主要模式生物之一，但直到最近，研究人员才开始关注其自然生态。关于 C. elegans 在自然环境中的信息相对匮乏，这主要是由于在野外识别这种小型线虫存在诸多挑战。尽管如此，随着对 C. elegans 生态学研究的日益重视，人们已获得了大量有关其在实验室外生存的新信息。对自然界中 C. elegans 的深入搜寻不仅促成了许多新的 Caenorhabditis 物种的发现，还揭示了同属线虫在野外常常共存，并以腐烂植物材料相关的微生物大量繁殖为食。新物种的鉴定还表明，由雄虫和自体受精的雌雄同体组成的雄雌同体交配系统在 Caenorhabditis 属中已独立演化了三次。另外两种自交物种 C. briggsae 和 C. tropicalis 与 C. elegans 一样具有实验研究的优势，使得科学家能够开展比较研究，以探究包括自体受精在内的关键性状的分子机制。尽管取得了这些进展，关于这些重要物种的生态学及其自然多样性，仍有许多未知之处。例如，我们对其众多基因的功能仍缺乏了解，而这些信息可能只有通过理解其自然生态才能获得。为了促进对自交型 Caenorhabditis 线虫的生态学研究，我们开发了一种高度可扩展的方法，用于从野外采集线虫。该方法利用移动数据采集平台、基于云的数据库以及 R 软件环境，增强研究人员从野外采集线虫、记录相关生态数据，并利用分子条形码鉴定野生线虫的能力。
引言
近二十年来，人们对Caenorhabditis属线虫的生态学兴趣日益增加。这些研究表明，自由生活的Caenorhabditis物种可从温带和热带地区短暂存在的微生境中分离得到，它们以腐烂植物材料相关的微生物大量繁殖为食，有时与其他物种同域分布1,2,3,4,5,6,7,8。我们还了解到，自体受精在该属中经历了三次趋同进化，且是C. briggsae、C. elegans和C. tropicalis的主要繁殖方式9,10。在这些自交物种中，C. elegans是地球上研究最广泛的动物之一，研究人员已利用它在生物学领域取得了诸多关键性进展。重要的是，其他自交的Caenorhabditis物种与C. elegans共享许多实验优势，正迅速推动该属内的比较研究。然而，这些线虫在自然环境中的隐秘特性使其生态学和自然多样性研究变得困难，而这些研究对于理解其基因的生物学功能以及进化如何塑造物种间的遗传多样性至关重要10,11。
研究野生环境中自交型 Caenorhabditis 线虫生态学的最大挑战在于其体型微小；成年线虫的体长通常仅为1 mm或更短。这一挑战要求研究人员必须从野外采集基质样本，并在无法直接观察野外个体的情况下，在实验室中尝试将目标线虫从基质中分离出来。由于即便是受过专业训练的专家，也难以在显微镜下将自交型 Caenorhabditis 线虫与其他自由生活的线虫区分开来，因此通常的做法是先将线虫从基质中取出，进行分离培养，使其增殖，再通过已建立的分子条形码技术，依据序列一致性进行鉴定3,12,13,14。以这种方式处理每条线虫所需的时间和精力带来了组织管理上的难题，因为研究人员必须能够将实验室中分离得到的每条线虫准确追溯至野外采样的具体基质及其相关的生态数据。本文中，我们描述了一种逐步操作流程，可高效地从野外采集并鉴定自交型 Caenorhabditis 线虫，并在大规模条件下可靠地将这些分离株与其对应的空间信息和生态数据关联起来。
该采集方法通过使用移动数据采集平台、基于云的数据库以及 R 软件环境，提高了生态调查的规模和准确性。Fulcrum 是一个可定制的数据采集平台，兼容大多数移动设备，允许用户构建自定义应用程序以收集和组织基于地理位置的数据（https://www.fulcrumapp.com）。本实验方案详细说明了如何使用定制的数据采集应用程序在野外整理具有明确空间信息的生态数据，并将这些数据与实验室中分离的线虫种类准确关联。本方案还介绍了如何利用已建立的分子条形码高效鉴定自交 Caenorhabditis 线虫。通过配套的 R 软件包 easyFulcrum15，可对这些方法获得的数据进行简单且可重复的处理，以研究自然状态下 Caenorhabditis 种群的生态学特征和遗传多样性。
方案
1. 样本收集准备
- 确定调查Caenorhabditis属线虫的采样地点。
注意：在大多数温带地区，C. elegans和C. briggsae可轻松从与人类活动相关的生境中分离，例如农田、乡村和城市花园1。在亚热带和热带地区，C. briggsae、C. elegans和C. tropicalis均可在上述与人类活动相关的生境中发现，有时彼此相邻共存。然而，在热带生境中，C. elegans似乎更偏好比其他物种更凉爽、更干燥的环境7,8。这些物种也可从非人类活动相关的野生生境中分离，但此类生境的采样频率较低。 - 创建一个Fulcrum项目，以使用移动数据采集应用程序组织采集和分离数据。
- 通过免费的教育协议在线注册Fulcrum账户16。点击ADD APP按钮，将Nematode Field Sampling应用程序添加至Fulcrum账户中17。
- 点击ADD APP按钮，将Nematode Isolation应用程序添加至账户中18。
注意：建议将每次前往某地的采样行程作为一个独立的采集项目进行组织，命名格式为“年月地点”，例如2020FebruaryAustralia。
- 向Fulcrum账户中添加用户，以授予其对采集项目的访问权限。确保每位用户均已下载Fulcrum移动应用程序，以便参与项目。
- 打印一组二维码标签，用于通过移动应用程序跟踪样本采集（C标签）和线虫分离（S标签）。将C标签贴在自封塑料袋上，将贴好标签的袋子每25个卷成一捆，并用橡皮筋捆扎以便收纳。S标签则保留在实验室中使用。
注意：在本实验方案中，采集样本（来自野外的基质材料）存放于袋子或培养皿中，并使用C标签标记；分离得到的线虫则使用S标签标记。C标签用于标识唯一的采集样本，S标签用于标识唯一的线虫分离株。这两种标签用于在Fulcrum数据库中建立特定采集样本（C标签）与其所分离出的线虫（S标签）之间的关联。每个采集项目应打印的S标签数量应为C标签数量的两倍，因为平均每个采集样本可分离出两条线虫。若后续需要，可再补充打印更多S标签。补充材料中提供了2,500个唯一的C标签（补充文件1）和5,000个唯一的S标签（补充文件2）。 - 准备用于样本采集的10 cm NGMA平板以及用于线虫分离的3.5 cm NGMA平板。每个采集样本需准备1个10 cm平板和至少2个3.5 cm平板21。这些平板需按照既定方案接种大肠杆菌Escherichia coli菌株OP50。使用前将平板储存于4 °C，储存时间不超过1个月。
2. 野外采集
注意：Caenorhabditis 属线虫通常从腐烂的植物材料中分离获得，包括水果、坚果、种子、豆荚、花朵、茎秆、植物残体和堆肥1,5,6,8。最佳的基质是已高度腐烂、几乎无法辨认出原为水果或花朵的样品；应避免过于干燥或过湿的基质（图1）。在野外采集时，两人协作的方式最为高效。其中一人使用非接触式红外温度计选择待采集的基质并进行取样，另一人则使用 Fulcrum 平台中的线虫野外采样应用程序记录采集数据。两名采集人员重复此过程，直至获得所需数量的样本。野外工作所需材料清单见（补充表1）。
- 打开 Fulcrum 移动应用程序，选择 线虫野外采样 从下拉菜单中选择。按下 + 在项目中创建新记录（图2A)。拍摄底物的照片。
- 单击顶部中央的方框，选择在步骤 1.2 中创建的正确收藏项目。图2B）。轻触 C-标签 在采集记录的底部字段，当提示出现时选择“Scan”。 扫描 使用移动设备摄像头扫描采集袋上的条形码，然后点击 完成 屏幕右上方。
- 点击 底物 字段并从下拉菜单中选择底物类型。通过点击添加有关底物的备注 底物说明 野外调查并手动输入记录。
- 从下拉菜单中选择一个景观类型。选择最能代表采样地点的景观。
- 选择天空视野。选择天空视野时，描述采样点的天空可见情况（例如，无树木或其他结构遮挡的完整天空视野 = 完全）。
- 使用非接触式温度计测量基底的表面温度，并将数值记录在基底温度字段中。
注意：记录温度时，非接触式温度计与基底的距离不得超过14英寸。 - 使用手持设备测量环境温度和湿度，并将这些数据记录在相应的字段中。
注意：检查环境温度和湿度设备是否已关闭 保持测量单位将在松开按钮后改变。请将设备放在外侧口袋中，以避免读数异常。 - 通过点击保存记录到Fulcrum中 保存 屏幕左上方。
- 收集约一汤匙不含树枝或其他硬质碎片的基质，将采集袋翻转以用作 "手套" 用镊子夹取底物，然后密封袋子。如果样品特别潮湿，可在袋内放入一张纸巾。
注意：在炎热气候下，应将袋子放入带有冰袋的软式冷藏箱中，以保持样本低温。 - 当天所有样本采集完成后，清洁采集设备，取出探头中的电池，对电池进行充电，并重新冷冻冷冻包。通过点击 Fulcrum 应用左上角的“同步”按钮，同步采集数据。 线虫野外采样 应用
注意：在蜂窝网络连接较弱的情况下，上传可能需要几分钟时间，因此最好等待接入 Wi-Fi。数据将保留在移动设备上，并同步至云端。 - 将样本放入隔夜运输箱中，寄送至所属机构。为尽量减少样本暴露于低于11 °C或高于25 °C环境的时间，应选择货物运输日进行包裹寄送。
注意：大多数货运公司在偏远地区周末不提供隔夜货运服务。
3. 在实验室中对野外采集样本进行平板接种
注意：本节详细介绍如何将样本从已标记的采集袋转移至已标记的孔板。样本可能通过隔夜快递送达，或直接来自野外现场。
- 接收采集样本的运输包裹，并检查是否有破损的袋子或其他损坏迹象。若发现袋子破损，应丢弃其中材料，并用70%乙醇清洁未破损的采集袋；注意避免将乙醇接触到袋子上的C标签，以免标签褪色而难以辨认。
- 对于每个自封袋，记录袋上的C标签信息，并在已接种OP50细菌的10 cm培养皿盖上贴上对应的C标签。
注：在本实验方案的后续步骤中，这些带有标签的10 cm培养皿称为“C培养皿”。最简便的样品管理方式是将采集袋放置于实验台面上，并将对应的C培养皿置于其上方（图3）。 - 针对每份采集样本，使用洁净的塑料勺取约一汤匙样品，从采集袋转移至对应的C培养皿中。将样品以月牙形或环形方式添加在细菌菌苔周围，切勿完全覆盖细菌菌苔（图4）。
注：不使用时，将汤匙置于盛有95%乙醇的烧杯中以保持清洁。在转移下一份样品前，用纸巾将汤匙擦干。 - 记录采集样本从采集袋转移至C培养皿的时间，并在室温（RT）下放置至少24小时，然后再进行第4节中的线虫分离操作。
4. 从样品中分离线虫
- 在移动设备上打开 Fulcrum 应用程序，从应用菜单中选择 线虫分离 （图 5A）。通过点击右下角的 + 图标创建一个新的分离记录（图 5B）。
- 在新的分离记录界面中，检查屏幕顶部中央框中显示的项目名称，确认选择了正确的采集项目。如果显示的项目错误，请点击项目名称以切换至正确的项目（图 5C）。
- 点击 C标签 字段下方的 选择 按钮，查找与正在分离线虫的样本相对应的C标签（图 5D）。点击 搜索 图标，然后点击 扫描 图标 ，使用设备摄像头扫描C板上的C标签二维码。扫描成功后，C标签记录将显示在 C标签 字段中。
- 点击 照片 字段中的 相机 图标，打开设备摄像头，拍摄C板上样本的照片，并确保二维码清晰可见（图 5E）。点击 完成 返回到分离记录界面。
注意：这些分离记录照片可用于后续进一步分析基质的特定特征。 - 使用解剖显微镜在C板上查找线虫。点击 样本上有虫 字段，记录样本上是否存在线虫（图 5F）。如果C板上存在线虫，则点击 是；若无线虫，则点击 否。
- 如果仅观察到线虫移动轨迹而未见虫体，点击 轨迹 。若确认无任何线虫存在，用Parafilm密封C板，并将其丢弃至生物危害废物桶中。
注意：将C板倒置在生物危害废物桶上方，轻轻敲击板背面，使所有采样基质脱落。此步骤有助于发现并分离可能藏于C板基质下方的线虫。 - 若存在线虫，从C板上分离最多五条线虫。分离时，使用铂金丝挑取器将一条线虫从C板转移至S板。尽可能分离健康且带有卵的成虫；若未发现成虫，也可分离其他发育阶段的个体。
注意：分离完成后，最多将有五个S板，每板含一条线虫。请将来自同一C板的S板有序叠放在一起，并与其他S板分开存放，直至录入Fulcrum系统。 - 点击 S标签板 字段，输入本次分离所用的S板。点击右下角的 +，然后点击 S标签 ，再点击 扫描 以启动设备摄像头。使用摄像头扫描S板上的S标签二维码。
注意：请确保扫描到的S标签代码与板上实际代码一致。若一致，点击 完成；若不一致，点击 取消 并重新扫描，直至匹配后再点击 完成。有时可能会误扫邻近板的二维码。 - 每录入一个S板后，点击右上角的 保存 按钮保存条目，否则条目将丢失。如有需要，点击右下角的 + 继续添加更多S标签板，直到录入从该C板分离的所有线虫。完成所有S标签板的录入后，点击左上角的 < 按钮返回分离记录界面。
注意：若因无法修正错误需取消整个分离记录，请点击左上角的 取消 ，系统将弹出对话框询问是否放弃未保存的记录。如确认放弃，请点击 是，放弃。 - 当分离记录中所有信息均已正确填写后，点击右上角的 保存 按钮。随后用Parafilm密封带有分离线虫的S板，并将其放置于指定存放带线虫S板的区域。
- 用Parafilm密封C板，并将其丢弃至生物危害废物桶中。点击 同步 图标，将所有数据上传至Fulcrum系统。
- 将所有S板按字母数字顺序排列，然后放入纸板箱中。确保S板盖子朝下并已用Parafilm密封。每个箱位最多可堆叠四个S板，并在纸板箱上标注项目名称、日期、时间及唯一的箱号。
- 将标记好的箱子在室温下储存。这些分离株将在48小时检查增殖情况，必要时在168小时再次检查。
5. 从 Fulcrum 导出 S-平板
注意：本节详细介绍如何从 Fulcrum 项目数据库中导出在分离过程中使用的 S 标签。这些 S 标签将用于在第 6 至第 9 节通过序列一致性鉴定增殖的同雌系时进行追踪。
- 登录 Fulcrum 网站，选择 Nematode Isolation 应用程序。点击屏幕左侧的 Exporter。选择目标项目，并勾选 Nematode Isolation 复选框。点击 Next 下载包含“nematode_isolation_s_labeled_plates.csv”文件的 .zip 文件。
- 打开“nematode_isolation_s_labeled_plates.csv”文件，按“S-label”列升序排序（最小的 S-label 显示在最上方）。选中所有 S-label 并从电子表格中复制。
- 使用网络浏览器访问野生分离株基因分型模板 Google 表格（wild_isolate_genotyping_template）19。
- 通过右键点击 Genotyping Template 标签页，选择 Copy to New Spreadsheet 选项，创建此 Google 表格的副本。选择 Open Spreadsheet 以查看新的 Google 表格。
- 将此新表格命名为 Fulcrum 项目名称后接“wild_isolate_genotyping”，例如“2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping”。
注意：本方案后续部分将此表格称为“基因分型表”。
- 将从“nematode_isolation_s_labeled_plates.csv”文件的“s_label”列复制的 S-label 粘贴至基因分型表中标题为“s_label”的列。检查“s_label_repeat_error”列中的“1”。该列中出现“1”表示基因分型表中存在重复的 S-label。若发现重复，请先调查并纠正后再继续操作。
- 填写基因分型表中所有 S-label 对应的“isolation_box_number”列。
6. 在S型培养皿上检测增殖情况
- 在分离后48小时检查S平板上是否有增殖的线虫（根据步骤4.11中盒子上记录的最后一次分离日期和时间来确定检查时间）。
注意：增殖的线虫特征为S平板上出现后代。 - 如果某个S平板出现增殖，在基因分型记录表的“proliferation_48”列中输入“1”，然后将该S平板转移至标记为“48 h proliferation, box 1”的盒子中。每个增殖盒中最多放置88个S平板，装满后开始使用标记为“48 h proliferation, box 2”的新盒子。确保S标签在48小时增殖盒中按字母数字顺序排列。
注意：不要丢弃未增殖的S平板；这些平板将在分离后168小时再次检查。如有需要，可将这些S平板按数字顺序整合到标记为“48 h non-proliferating, box X”的盒子中，但需记住在新盒子上记录168小时检查的时间。 - 在48小时确认所有增殖的S标签后，进入第7节，处理在48小时出现增殖的S平板。
- 在分离后168小时，再次检查在分离后48小时未增殖的S平板。
- 如果某个S平板此时出现增殖，在基因分型记录表的“proliferation_168”列中输入“1”，然后将该S平板转移至标记为“168 h proliferation, box 1”的盒子中。
- 每个增殖盒中最多放置88个S平板，装满后开始使用标记为“168 h proliferation, box 2”的新盒子。确保S标签在168小时增殖盒中按字母数字顺序排列。
- 丢弃在168小时后仍未增殖的S平板。对于在168小时出现增殖的S平板，进入第7节继续操作。
7. 单雌系的裂解
注意：此步骤将使用 Google 表格中的数据筛选工具，以帮助打印增殖盒中 S-板的裂解工作表。裂解工作表的用途是为实验人员提供在实验台操作时，S 标签在裂解条带管中的正确位置信息。
- 打开目标项目的基因分型表格，通过输入 Cmd+A 选择所有单元格。点击 数据 > 创建筛选器，为每一列标题添加筛选按钮。使用 筛选 按钮仅显示将要进行基因分型的 S-板。例如，若需裂解所有在 48 小时具有增殖现象的 S-板：点击“proliferation_48”列中的筛选按钮，并选择“1”。
- 在完成基因分型 Google 表格的筛选后，检查所显示的 S-标签列表，确保其为需要打印在裂解工作表上的 S-标签。
- 在基因分型 Google 表格的“strip_tube_number”列中，每隔 11 行输入一个唯一的编号。
- 为一个项目分配连续递增且不重复的条带管编号，从 1 开始。在“strip_tube_position”列中，为每个条带管编号依次输入 2 至 12。
注意：使用 12 孔条带管进行裂解。第一个位置（strip_tube_position 1）用于对照，但对照不添加到裂解工作表中（仅添加条带管位置 2–12）。在裂解时，阳性对照菌株“N2”将被加入每个偶数编号条带管的第 1 位作为阳性对照；每个奇数编号条带管的第 1 位不加任何线虫，作为阴性对照。
- 进一步筛选基因分型 Google 表格，仅包含一个增殖盒中需要裂解的 S-标签，然后选择从“s_label”到“lysis_notes”的各列。为每一个需要裂解的增殖盒打印一份裂解工作表。
- 点击 打印 字段的下拉菜单，选择 选定单元格。点击右上角的 下一步，并通过对话框打印该增殖盒的裂解工作表。
- 重复步骤 7.3–7.5，为每个需要裂解的增殖盒打印裂解工作表。
注意：每个增殖盒最多容纳 88 个 S-板，对应八个 12 孔条带管。 - 为所有将要裂解的样品准备 12 孔条带管。使用裂解工作表中指定的唯一“strip_tube_number”标记条带管。该编号必须同时写在管盖条和条带管本体上，以防两者分离后混淆。偶数编号的条带管在第 1 位含有阳性对照（N2 线虫），奇数编号的条带管在第 1 位含有阴性对照（无虫）。
- 配制足量的裂解缓冲液（100 mM KCl，20 mM Tris pH 8.2，5 mM MgCl2，0.9% IGEPAL，0.9% Tween 20，0.02% 明胶，加入蛋白酶 K 至终浓度为 0.4 mg/mL），覆盖所有样品，并额外增加 5% 以补偿移液误差。根据需要按比例放大配制。
注意：最佳配制方法是将除蛋白酶 K 外的所有组分混合，分装为 10–50 mL 等份，于 -20 °C 冻存。使用前取出等份样品，在 4 °C 解冻；使用前立即加入蛋白酶 K 并充分混匀。操作过程中应将裂解缓冲液置于冰上。 - 根据打印的裂解工作表，按顺序排列特定条带管对应的 S-板。
- 打开一个条带管，使用重复移液器向每个管盖中加入 8 µL 裂解缓冲液。每次仅向一组管盖中加液，因为裂解缓冲液在室温下敞口放置时会蒸发。从源板（S-板或用于阳性对照的 N2 库存板）中挑取 3–5 只动物，放入裂解工作表上指定的相应管盖位置。若某 S-板挑取的线虫少于 5 只，需在裂解工作表的“lysis_notes”部分记录备注。
- 将线虫加载至条带管的各个孔位后，将管盖条重新盖回条带管上。确保标记的管盖（位置 1）与标记的管体（位置 1）对齐。盖好后，短暂离心条带管，使线虫沉降至管底。
- 将条带管放入 -80 °C 冰箱中冷冻至完全凝固（至少 10 分钟）。重复步骤 7.9 至 7.11，直至所有条带管均完成线虫添加并用于裂解。将条带管按编号顺序整理排列。
- 取出成组的条带管，在热循环仪中运行裂解程序：60 °C 1 小时，95 °C 15 分钟，保持在 12 °C。程序结束后，在室温下以 300 × g 离心 15 秒，随后将裂解产物于 -80 °C 保存，最长可保存 1 周。
- 使用 96 孔板架按编号顺序整理条带管，并附上标签，标明增殖盒编号、条带管编号范围、日期及研究人员姓名缩写。根据裂解工作表中的信息，更新基因分型表格中的“lysis_date”和“lysis_notes”列。
8. SSU 和 ITS2 序列的 PCR
注意：本节将提供针对每个裂解后的 S-板进行两次独立 PCR 的操作说明。第一对引物扩增 18S rDNA 小亚基基因（SSU）的 500-bp 片段；oECA1271 = 正向引物 TACAATGGAAGGCAGCAGGC，oECA1272 = 反向引物 CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA12。该 PCR 用于检测模板 DNA 的质量。该反应可扩增几乎所有线虫物种的 SSU 区域。若 SSU PCR 扩增失败，则表明裂解质量不佳，需对该 S-板重新进行裂解。第二对引物扩增位于 5.8S 与 28S rDNA 基因之间的内转录间隔区（ITS2）的 2,000-bp 片段；oECA1687 = 正向引物 CTGCGTTACTTACCACGAATTGCARAC，oECA202 = 反向引物 GCGGTATTTGCTACTACCAYYAMGATCTGC3。ITS2 PCR 产物进行 Sanger 测序，通过序列相似性比对，可将Caenorhabditis属的线虫鉴定至物种水平。
- 使用基因分型表格中的筛选工具，仅查看将用于 PCR 的 S 标签。
- 更新基因分型表格中的 pcr_plate_number 和 pcr_well 列。为防止裂解材料降解，SSU 和 ITS2 PCR 需同时进行。
- 尽管 ITS2 和 SSU PCR 是在不同的 PCR 板上进行的独立反应，仍使用相同的 pcr_plate_number。它们将通过标注“SSU”或“ITS2”加以区分。
- 为八支或更少的条形管分配一个 pcr_plate_number（每排 96 孔 PCR 板对应一支条形管，按升序排列，例如编号最小的条形管置于最上方）。然后为条形管中的每个 S 标签分配一个 pcr_plate_well。
注意：条形管按升序排列，编号最小的条形管分配给 A 行，编号最大的分配给 H 行。所有条形管的第 1 位均对应第 1 列。因此，条形管编号 1 的第 1 位将分配至 PCR 板编号 1 的 A01 孔。 - 标记 96 孔 PCR 板，以容纳将用于 PCR 的样本。每块 PCR 板需标注以下信息：项目名称、PCR 类型、PCR 板编号和 PCR 日期（例如 2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304）。同时，在板上标注将装入每行的条形管编号。
- 从 -80 °C 冰箱中取出裂解材料，并将含有裂解材料的条形管置于冰上解冻。在裂解材料解冻的同时，在冰上分别配制 ITS2 和 SSU 的主混合液。SSU 和 ITS2 PCR 的配方见补充表 2。
注意：为每块 96 孔板准备 100 个反应的 PCR 主混合液，以补偿移液误差。若需使用较大体积，可用 15 mL 或 50 mL 锥形管盛装主混合液。 - 轻轻涡旋主混合液，使 Taq 酶均匀分布。混合后，将 38 µL 主混合液分装至冰上的 PCR 板相应孔中。使用无菌一次性 V 型槽和 12 道多通道移液器将主混合液转移至 PCR 板。
- 短暂离心已解冻的裂解条形管，使管盖上的裂解物沉至管底。小心打开将要装入第一块 PCR 板的所有条形管盖子。使用低容量多通道移液器（12 道或 8 道）向 PCR 板的相应孔中加入 2 µL 裂解液。在吸取 2 µL 前，轻柔地吹打裂解液一次。
注意：转移前检查吸头，确保其含有裂解液。记得在不同行或列之间更换吸头。 - 用 PCR 自粘封膜覆盖 PCR 板，并使用滚轮压紧密封。封膜后，将 PCR 板在离心机中短暂离心。在准备放入热循环仪前，保持 PCR 板置于冰上。
- 使用相应的热循环程序运行 PCR。SSU 和 ITS2 PCR 程序的详细信息见补充表 2。
- 重复步骤 8.4–8.8，直至所有 PCR 完成。
- 在 PCR 反应进行的同时，制备 100 mL 的 1.5% 琼脂糖凝胶。每块凝胶可容纳一个 PCR 板的样本。
- 将 1.5 g 琼脂糖加入 500 mL 三角瓶中，再加入 100 mL 1x TAE 缓冲液（补充表 3），轻轻摇匀。微波加热至溶解并冷却。
- 溶液冷却后，加入 5 µL 10 mg/mL 溴化乙锭溶液，混匀。将溶液倒入带有四个 25 孔梳子的制胶模具中，使凝胶能够容纳 96 个样本及每行的 DNA 标准分子量标记。
注意：溴化乙锭为强效诱变剂。操作时应穿戴实验服、耐化学手套和化学防护眼镜。
- 在 PCR 即将结束前，将 6x 上样染料加入一次性槽中，使用多通道移液器向新的 96 孔 PCR 板的每个孔中加入 2 µL 6x 上样染料。该板将用于将样本上样至凝胶。根据样本总数制备足够数量的此类板。
- PCR 完成后，取出 PCR 板并在室温下以 300 x g 短暂离心 15 秒。在 PCR 产物进行凝胶电泳前，将 PCR 板保存在冰上。
- 进行凝胶电泳时，使用 12 道多通道移液器将每个样本的 5 µL 加入含有 2 µL 6x 上样染料的 96 孔板的相应孔中。
- 然后将 6 µL 该混合物加入新制备的凝胶的每个孔中。在凝胶每行的第一个孔中加入 6 µL 1 KB Plus DNA 标准分子量标记。
注意：为填满凝胶孔，可能需要将 PCR 板的 A 行和 B 行样本交替加入凝胶的第一行。为避免混淆，应在基因分型表格中记录每个 PCR 样本的 gel_number 和 gel_position。
- 在剩余的 PCR 板上加盖新的封膜，并于 4 °C 保存。这些反应产物将在步骤 9 中用于测序。
- 以 120 V 电压将 PCR 产物在凝胶上电泳 20 分钟。 成像凝胶，并在基因分型表格的 'pcr_product_its2' 和 'prc_product_ssu' 列中记录哪些 S 标签产生了 ITS2 和/或 SSU PCR 产物。有条带记为“1”；无条带记为“0”。
9. 使用桑格测序和序列比对（BLAST）鉴定线虫
注意：本部分提供对 S 标签中的 ITS2 扩增子进行测序、利用 BLAST 算法将这些序列比对至美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库，以及解析 BLAST 结果以鉴定 S 平板上线虫的操作说明。
- 对于每个ITS2阳性的样本，使用剩余的ITS2 PCR产物，采用正向引物oECA306（CACTTTCAAGCAACCCGAC）进行Sanger测序。通过在基因分型表中记录每个S标签的“sequencing_plate”和“sequencing_well”列，确保测序输出文件能够方便地与S标签关联。
- 从测序平台获取每个S标签的.seq输出文件。将一个项目的全部.seq文件整理至单一主目录中，每批测序的文件分别存放在各自的子目录下。
- 打开命令行接口工具，输入命令：cd <path_to_directory>，进入包含.seq文件的主目录。如果尚不存在，通过输入以下命令创建一个合并的FASTA文件：for dir in */; do cd $dir; for file in *.seq; do echo ">"$file; cat $file; done >>../all_seqs.fa; cd ..; done。
注：此代码将从项目目录中的所有.seq文件生成一个名为“all_seqs.fa”的合并FASTA文件。该文件可用于NCBI在线核苷酸BLAST工具，以快速将每个S标签的ITS2序列比对至NCBI的序列数据库。 - 在网页浏览器中访问NCBI BLAST网站20 ，点击Choose File按钮。选择刚刚创建的all_seqs.fa文件，然后点击Somewhat Similar Sequences (BLASTn)按钮。点击页面底部的BLAST按钮，开始BLAST搜索。
- 根据每个S标签的BLAST结果更新基因分型表。使用筛选工具以简化基因分型Google表格的更新操作。点击Data > Create a Filter，为每列标题添加筛选按钮。筛选“sequencing_plate”列，选择需要更新BLAST结果的测序板。
- 使用NCBI BLAST结果页面的下拉菜单，查看每个S板ITS2序列的比对结果（图6）。
- 检查无BLAST比对结果的情况。下拉菜单中序列ID前带有*号的表示无BLAST比对结果。对于这些S标签，在基因分型表的manual_blast_notes列中填写“no hit <当前日期>”。
- 检查可能为新Caenorhabditis物种的情况。点击最高比对结果的链接以查看比对情况（图6）。若最高比对结果满足以下条件：(1) 属于Caenorhabditis属物种；(2) 比对序列中心区域存在超过五个错配；(3) 查询序列覆盖度大于50%，则提示该分离株可能为一种新的Caenorhabditis物种（图7）。对于这些S板，在“species_id”列中填入最高BLAST比对结果的物种名称，在“possible_new_caeno_sp”列中填入1，并在“manual_blast_notes”列中填入“possible new Caeno sp.”及序列相似性百分比（例如，“possible new Caeno sp. 89% identity”）。
- 对于ITS2序列BLAST比对至Caenorhabditis属物种的S板，在“species_id”列中填入最高比对结果的完整属种名称。例如，“Caenorhabditis elegans”。
- 对于ITS2序列BLAST比对至非Caenorhabditis属物种的S板，在“species_id”列中仅填入最高比对结果的属名，后接“sp.”。该记法表示该分离株为该属中一个未知物种。例如，“Oscheius sp.”。
注：ITS2序列无法可靠地将Caenorhabditis属以外的分离株鉴定至物种水平3,13。 - 若“species_id”为“Caenorhabditis elegans”、“Caenorhabditis briggsae”或“Caenorhabditis tropicalis”，或“possible_new_caeno_sp”为1，则在基因分型表的“make_strain_name”列中填入1。
- 根据Caenorhabditis命名规范为菌株命名，即采用由2–3个大写字母后接数字组成的唯一实验室编号23。将菌株名称填入“strain_name”列。
- 菌株命名完成后，可依据既定方案进行冷冻保藏24。
10. 使用 R 中的 easyFulcrum 包处理采集数据
注意：此步骤介绍如何使用 easyFulcrum R 软件包将采集数据（C 标签）与线虫分离数据（S 标签）关联起来。该软件包含若干函数，可进一步将 Fulcrum 数据与基因分型工作表中的基因分型数据进行整合，从而使 S 标签对应的物种鉴定结果和菌株名称被整合至同一个数据框中。
- 创建一个以采集项目命名的新目录。根据 R 软件包 easyFulcrum15 中描述的要求，在该目录内安排文件夹结构。
- 访问 Fulcrum 网站并登录。使用 Fulcrum 网站左侧的数据导出工具导出原始项目数据，并选中以下复选框：project（项目）、include photos（包含照片）、include GPS data（包含 GPS 数据）、field sampling（野外采样）和 isolation（分离）。
注意：项目的 Fulcrum 数据将被导出为五个逗号分隔值（.csv）文件。完整的项目数据将在 R 中通过 easyFulcrum 软件包合并为一个单一的数据框。 - 按照 easyFulcrum 使用指南21中的说明，将从 Fulcrum 导出的五个 .csv 文件移至第 10.1 步创建的项目目录中。
- 启动 Rstudio 会话，并在 R 控制台中输入以下命令以安装 easyfulcrum 软件包：'install.packages("devtools")' 和 'devtools::install_github("AndersenLab/easyfulcrum")'。
- 新建一个 R 脚本，并按照 easyfulcrum 使用指南中的说明处理采集数据21。
结果
该方案已用于从多个地点（包括夏威夷和加利福尼亚）采集Caenorhabditis属线虫。Caenorhabditis属线虫的分离成功率因采集地点、气候、采样经验以及所采样的基质类型而异。该方案已在夏威夷群岛进行了广泛采样，多年来在不同季节共开展了九次采集项目。对于自交繁殖的Caenorhabditis物种，其分离成功率在C. briggsae（4,506份样本中获得162份，3.6%）和C. elegans（4,506份样本中获得163份，3.6%）之间几乎相同，而C. tropicalis的分离成功率则低得多（4,506份样本中获得26份，0.58%）8。每种自交物种在腐烂果实和花朵基质上的丰度均高于其他类型的基质。若研究人员旨在提高分离成功率而非研究基质偏好性，则应优先采样腐烂的果实和花朵基质。然而，分离成功率与所选基质的质量密切相关。例如，在果实和花朵基质中，过于干燥、过湿或过于新鲜的样本通常难以获得Caenorhabditis属线虫。
该采集方案的可扩展性体现在单个研究人员团队从野外能够采集的样本数量上。例如，在2018年10月，一对研究人员使用本采集方案在7天内从夏威夷两个岛屿的多个地点共采集了超过1,000份样本。该野外团队将样本连夜寄送至实验室，随后由八名研究人员组成的团队在样本到达后陆续从中分离出超过2,000条线虫。本方案的一个关键优势在于，通过减少野外工作所需的设备和人员，显著降低了在偏远地区采样的成本。采用该方案后，小型野外团队可专注于采样工作，而分离团队则可在其所属机构利用解剖显微镜和琼脂平板等易碎且笨重的设备进行样本处理。此外，移动数据采集应用程序的使用使得所有与样本相关的野外数据可直接与C标签关联，从而使分离团队在处理样本时能够独立于野外团队开展工作。
使用该采集方案的研究人员必须在开展采集项目前，充分考虑分离线虫所需投入的工作量。分离与鉴定步骤是限制性环节，较小的采集团队可能迅速产生大量样本，从而超出分离人员的处理能力。此外，处理大量样本所需的实验空间可能会影响正在进行的其他研究工作。图3）。此外，一些分离得到的线虫在基因分型时需要额外的操作。例如，约有 2% 的样本在首次裂解后使用 SSU PCR 引物组无法扩增，必须重新裂解，以确保裂解产物适用于 ITS2 引物组的扩增图8）。此外，约有3%的分离株在初次进行Sanger测序后无法获得高质量的序列。对于这些分离株，通常需要再次进行裂解、ITS2 PCR扩增及Sanger测序，这可能会增加分离团队的操作时间。重要的是，仅凭序列一致性不足以作为确立新种的充分证据 秀丽隐杆线虫 物种图7）。为合理地将一个分离株提升为新种 秀丽隐杆线虫 物种，必须额外开展交配实验并建立模式标本13. 也建议对已分类的标本进行正式的形态学描述，但非强制要求3综上所述，这些因素提示研究人员在开展采集项目之前，应先对分离与鉴定步骤进行试验性测试，以确保资源得到合理分配。尤为重要的是，即使规模较小的采集项目也能从该方案中获益，因为该流程具有高度可重复性，且所产生的数据便于在不同实验团队之间进行质量控制审查。
图1：底物示例。（A）图像中央显示一个理想的腐烂果实（1），其形态已几乎无法辨认；附近显示腐烂程度较轻的果实，应避免采集刚落下的新鲜果实（2）。（B）顶部显示一个理想分解状态的花朵（3），应避免采集刚落下的新鲜花朵（4）。（C）在干燥落叶表层下方的深色枯枝落叶，是采集自交型Caenorhabditis线虫的理想采样材料（5）；应避免采集干燥的枯枝落叶（6）。请点击此处查看本图的高清版本。
图 2：线虫野外采样移动应用程序。（A）在 Fulcrum 平台的 Apple 设备上打开线虫野外采样应用程序后的初始界面。右下角的红色箭头指向用于创建新采集记录的+按钮。（B）在 Apple 设备上显示的新采集记录示例。红色箭头指向采集记录界面顶部的“项目”字段。野外采样时务必选择正确的项目。在创建后续采集记录时，项目字段将默认为上次使用的项目。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：接种前收集袋与收集平板的摆放情况。 本图显示左侧为装有样本的含C标记的收集袋，每个收集袋上方均对应放置一个带有相同C标记的10 cm培养皿。右侧为10 cm收集平板，其中已装入从收集袋转移而来的样本材料。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：已成功转移样品的收集板（C-板）。 一个直径为 10 cm 的 C-板，其边缘放置了正在分解的水果，位于细菌菌苔上。C-标签已贴在培养皿盖上。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：线虫分离移动应用程序。（A）Fulcrum 移动应用程序中的应用程序选择界面。红色箭头指向线虫分离应用程序。（B）在 Fulcrum 中于 Apple 设备上打开线虫分离应用程序后的初始界面。右下角的红色箭头指向用于创建新分离记录的+按钮。（C）在 Apple 设备上显示的新分离记录示例。红色箭头指向分离记录界面顶部的“项目”字段。进行分离操作时，务必选择正确的项目。在创建后续分离记录时，项目字段将默认为上次使用的项目。（D）点击 C 标签下方的选择字段后，用户将点击搜索按钮（红色箭头），以查找其正在分离线虫的 C 标签。（E）选择 C 标签后，用户将使用设备摄像头拍摄 C 平板的照片。（F）随后，用户需输入 C 平板上是否存在线虫。若存在需分离的线虫，则将 S 标签添加至分离记录中。请点击此处查看此图的放大版本。
图 6：NCBI BLAST 结果页面。 （1）用于查看所有序列 BLAST 结果的下拉菜单。（2）从下拉菜单中选择的当前序列的描述信息。此处显示的是 S-05554 样品标签（S-label）的结果。（3）S-05554 的最佳 BLAST 比对结果。紫色文字表示已点击链接以可视化该比对结果。请务必通过肉眼检查比对结果，以识别可能的新的 Caenorhabditis 物种，参见上文步骤 9.8。请点击此处查看此图的放大版本。
图7：NCBI BLAST比对可视化示例。（A）一个分离株ITS2查询序列与C. kamaaina参考序列比对的示例。（1）比对的序列一致性百分比（89%），该值作为BLAST最佳匹配结果而言偏低。（2）查询序列与参考序列之间的一个错配位点（G到A）。（3）比对算法在参考序列中引入的一个4个碱基对的空缺；查询序列或参考序列中的空缺提示比对质量较差。（4）比对中心区域存在一个包含多个错配和空缺的广义区域。此类区域提示该查询序列可能来源于一个新的Caenorhabditis物种。图中展示的是2017年发现的一个新物种C. oiwi的实际比对示例。（B）一个分离株ITS2查询序列与参考序列良好比对的示例。（5）比对的序列一致性百分比（99%），通常表明该查询序列来源于与参考序列相同物种的分离株。（6）比对中心区域具有完全一致的序列。此类区域提示该查询分离株很可能与参考序列属于同一物种。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：SSU和ITS2 PCR产物。 上方凝胶显示使用SSU引物组扩增的12个代表性样本的PCR产物。左侧包含DNA分子量标记作为参照。Caenorhabditis线虫的SSU PCR产物长度约为500 bp。样本2至12使用SSU引物组成功扩增，但样本1未扩增出条带。样本1缺乏500 bp的SSU扩增子表明裂解材料质量较差，需重新进行裂解处理。下方凝胶显示使用ITS2引物组对与上方凝胶相同的12个样本进行扩增所得到的PCR产物。两个凝胶中的分子量标记和样本排列方向一致。12个样本中有6个未能使用ITS2引物组扩增出产物。具有SSU和ITS2条带的样本将通过Sanger测序，并利用NCBI BLAST算法比对序列相似性进行鉴定。请点击此处查看该图的放大版本。
补充文件 1：C 标签。 一个包含 2500 个独特 C 标签的 PDF 文件。请点击此处下载该文件。
补充文件 2：S-标签。 一个包含 5000 个独特 S-标签的 PDF 文件。请点击此处下载该文件。
补充表1：野外材料。 用于野外采集线虫的材料清单。 请点击此处下载该表格。
补充表 2：PCR 反应体系与PCR仪反应条件。 包含 ITS2 和 SSU PCR 反应体系及PCR仪反应条件的表格。请点击此处下载该表格。
补充表 3：电泳缓冲液配方。 0.5 M pH 8.0 乙二胺四乙酸溶液（EDTA）以及三羟甲基氨基甲烷-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液的配制方法。请点击此处下载该表格。
讨论
本方案包含若干必须谨慎执行的关键步骤。例如，野外采样和实验室分离线虫时，野外团队和分离团队必须仔细确保在应用程序中选择了正确的采集项目。如果选错了采集项目，最好通过 Fulcrum 数据库的在线记录编辑工具来修正错误的数据记录。当存在大量记录位置错误时，这一修正过程可能较为繁琐。然而，数据库会保留所有记录的修改痕迹，从而实现对采集和分离记录的完整审计。本方案中的其他关键步骤涉及野外样品及其分离线虫的处理。为确保Caenorhabditis属线虫在采样和运输过程中存活，样品温度应维持在 4 °C 至 25 °C 之间。温度超过 25 °C 可能导致C. elegans14出现不育现象。应尽可能在五天内将样品从采样袋转移至采集平板，以最大限度减少线虫损失。在线虫分离后，必须在它们死亡前完成基因分型并进行冷冻保存。由于真菌和细菌污染可能使 S-平板环境变得不适宜生存，因此很难在存放超过两到三周的 S-平板上找到存活的线虫。
该方案可轻松修改，以适应研究人员在野外希望收集的不同类型数据。例如，可使用 Fulcrum 的在线图形用户界面（GUI）编辑应用程序，轻松地为“线虫野外采样”应用程序添加新的数据输入字段。此外，数据分析包 easyFulcrum 在处理新数据时也能兼容这些修改15。用户可能感兴趣的另一项修改是在野外采用不同的采样方法。研究人员可能希望采样包含多种基质类型的较大区域，而非离散的基质样本。这些较大的样本在实验室中使用贝尔曼漏斗法或托盘提取法处理效果最佳13。重要的是，C标签和S标签仍适用于这些技术，因此与移动应用程序兼容。
本方案的主要局限性与线虫在实验室分离前的处理时间有关。首先，样本采集与线虫分离之间的时间延迟使得无法记录采集时刻特定样本上线虫的发育阶段。其次，雄性个体在自然界中的出现频率以及异交行为是关于自交型 Caenorhabditis 线虫的关键进化问题10。该方法并不适合回答这些问题，因为线虫在被分离前可能已经历了多个世代。延迟分离意味着无法获得自然界中雄性频率的直接证据。此外，在基因分型步骤中存在的多世代延迟会导致异交的基因组证据（杂合性）在对线虫品系进行测序前即被稀释。为了识别自然界中的杂合性，通常采用直接从自然环境中分离的单个线虫所产的后代进行测序2。本方案的另一个潜在局限性在于其倾向于鉴定出自交型 Caenorhabditis 线虫。这是因为自交型物种的分离个体比专性异交型个体更有可能增殖，后者只有在分离到已受精的雌性个体时才能实现增殖。
该收集方法基于现有的收集方案13,14该技术的主要进步在于利用移动技术和定制软件，以促进大规模采集项目所产生的大量生态学和分子数据的组织管理。通过本采集方案获得的生态学数据可用于解答自然种群中的重要科学问题 秀丽隐杆线虫 物种。例如，利用该方法生成的数据已被用于揭示这些物种在夏威夷群岛间的生态位偏好。此外，通过对冷冻保存的线虫进行基因组测序，研究人员能够探究遗传变异模式与生态数据之间的关联。此类研究可揭示局部适应的遗传信号 秀丽隐杆线虫 种群，并为自然条件下遗传变异的相关性提供重要见解8. 为了获得对许多基因功能的理解 秀丽隐杆线虫 线虫，可能需要进行生态学研究11即使对于 秀丽隐杆线虫 大量基因缺乏功能注释，尽管它是首个完成测序的多细胞动物，也是地球上研究最为深入的动物之一。本采集方案旨在通过促进野生样本的收集，帮助弥补这一知识空白 秀丽隐杆线虫 线虫及其生态学与自然遗传多样性的研究
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到了西北大学的启动资金以及美国国家科学基金会CAREER奖（IOS-1751035）的支持，两项资助均授予E.C.A.。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 粘性标签 | Avery | 61533 | 打印C标签和S标签 |
| 琼脂糖 | Thomas Scientific | C748D75 | 琼脂糖凝胶制备 |
| 背包 | 每位团队成员配备一个背包，用于携带当天所需的设备、样品、食物和水 | ||
| 纸板箱 | Fisher Scientific | AS261 | S平板储存 |
| 离心机 | NA | NA | 线虫裂解、SSU和ITS2 PCR |
| 采集袋 | 自封袋 | NA | 基质样品采集 |
| 数字温湿度计 | Preciva | HT-86 | 环境温度和湿度测量 |
| 解剖显微镜 | NA | NA | 线虫分离、裂解 |
| 一次性储液槽 | USA Scientific | 1306-1010 | 分装PCR预混液和上样染料 |
| DNA分子量标准（1 KB plus） | Thermo Scientific | SM0243 | SSU和ITS2 PCR产物的可视化 |
| dNTPs | Thomas Scientific | CB4430-2 | PCR预混液组分 |
| easyFulcrum R软件包 | NA | NA | 用于处理采集数据的R软件包 http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html |
| EDTA溶液（0.5 M，pH 8.0） | NA | NA | 配方见补充表3 |
| 乙醇（95%） | NA | NA | 样品涂布、勺子灭菌 |
| 溴化乙锭溶液（10 mg/mL） | VWR | 97064-602 | SSU和ITS2 PCR产物的可视化 |
| 移动设备外接充电器 | NA | NA | 适用于iPhone或Android设备的外接充电器及充电线缆 |
| 锥形瓶（500 mL） | Fisher Scientific | FB501500 | 琼脂糖凝胶制备 |
| 食物 | NA | NA | 根据需要准备 |
| 凝胶电泳装置 | Thermo Scientific | B2 | SSU和ITS2 PCR产物的可视化 |
| 凝胶电泳电源 | BioRad | 1645050 | SSU和ITS2 PCR产物的可视化 |
| 上样染料（6×） | NEB | B7022S | SSU和ITS2 PCR产物的可视化 |
| ITS2引物组 | NA | NA | oECA1687 = 正向引物 CTGCGTTACTTACCACGAATTG CARAC，oECA202 = 反向引物 GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM GATCTGC |
| ITS2测序引物 | NA | NA | oECA306 = 正向引物 CACTTTCAAGCAACCCGAC |
| 裂解缓冲液 | NA | NA | 线虫裂解，配方见实验方案 |
| 微波炉 | NA | NA | 琼脂糖凝胶制备 |
| 移动设备 | NA | NA | 充满电并处于飞行模式的手机。Fulcrum应用程序的GPS定位精度低于从照片中提取的GPS位置。此设置可确保更低的功耗并获得更精确的GPS测量结果。 |
| NGMA平板（10 cm） | Fisher Scientific | FB0875713 | C平板，NGMA平板制备方法参见Andersen等（2014） |
| NGMA平板（3.5 cm） | Greiner Bio-One | 5662-7102Q | S平板，NGMA平板制备方法参见Andersen等（2014） |
| 非接触式红外测温仪 | Etekcity | B00837ZGRY | 基质温度测量 |
| 纸巾 | NA | NA | 用于吸收封装样品中多余水分的纸巾 |
| 封口膜 | Fisher Scientific | 13-374-12 | 平板密封 |
| PCR封口膜 | VWR | 60941-126 | PCR封口膜 |
| PCR缓冲液（10×） | Thomas Scientific | CB3702-7 | PCR预混液组分 |
| PCR板（96孔） | Thomas Scientific | 1149K04 | SSU和ITS2 PCR |
| 铅笔 | NA | NA | |
| 塑料勺 | NA | NA | 样品涂布 |
| 铂金接种针 | NA | NA | 线虫分离、裂解 |
| 预贴标签的自封采集袋 | NA | NA | 成捆的、预先贴有C标签条形码的自封塑料袋。每捆应包含25个带条形码的袋子，并用橡皮筋捆扎。 |
| 蛋白酶K | Sigma | 3115879001 | 线虫裂解，在使用前立即加入裂解缓冲液中 |
| R软件 | NA | NA | R软件：用于统计计算的语言和环境 https://www.R-project.org/ |
| 软质保温袋和冰袋 | NA | NA | 采集用保温箱和冷却包，当环境温度高于25 °C时用于保持样品低温 |
| 备用电池 | NA | NA | 采样设备的额外电池 |
| SSU引物组 | NA | NA | oECA1271 = 正向引物 TACAATGGAAGGCAGCAGGC，oECA1272 = 反向引物 CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA |
| 条状管盖（12孔） | Thomas Scientific | 1159V29 | 线虫裂解 |
| 条状管（12孔） | Thomas Scientific | 1159V31 | 线虫裂解 |
| TAE缓冲液（1×） | NA | NA | SSU和ITS2 PCR产物的可视化。配方见补充表3 |
| Taq DNA聚合酶 | Thomas Scientific | C775Y45 | PCR预混液组分 |
| PCR仪 | NA | NA | 线虫裂解、SSU和ITS2 PCR |
| 水 | NA | NA | 根据需要准备 |
参考文献
- Frézal, L., Félix, M. -A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849(2015).
- Sivasundar, A., Hey, J. Sampling from natural populations with RNAI reveals high outcrossing and population structure in Caenorhabditis elegans. Current Biology: CB. 15 (17), 1598-1602 (2005).
- Kiontke, K. C., et al. A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits. BMC Evolutionary Biology. 11, 339(2011).
- Petersen, C., et al. Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations. Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).
- Richaud, A., Zhang, G., Lee, D., Lee, J., Félix, M. -A. The local coexistence pattern of selfing genotypes in Caenorhabditis elegans natural metapopulations. Genetics. 208 (2), 807-821 (2018).
- Ferrari, C., Salle, R., Callemeyn-Torre, N., Jovelin, R., Cutter, A. D., Braendle, C. Ephemeral-habitat colonization and neotropical species richness of Caenorhabditis nematodes. BMC Ecology. 17 (1), 43(2017).
- Crombie, T. A., et al. Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations. eLife. 8, 50465(2019).
- Crombie, T. A., et al. Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands. bioRxiv. , (2021).
- Noble, L. M., et al. Selfing is the safest sex for Caenorhabditis tropicalis. eLife. 10, 62587(2021).
- Cutter, A. D., Morran, L. T., Phillips, P. C. Males, Outcrossing, and Sexual Selection in Caenorhabditis Nematodes. Genetics. 213 (1), 27-57 (2019).
- Petersen, C., Dirksen, P., Schulenburg, H. Why we need more ecology for genetic models such as C. elegans. Trends in Genetics: TIG. 31 (3), 120-127 (2015).
- Haber, M., Schüngel, M., Putz, A., Müller, S., Hasert, B., Schulenburg, H. Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding. Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2005).
- Barrière, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans and Related Nematodes. WormBook. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19764/ (2018).
- Poullet, N., Braendle, C. Sampling and isolation of C. elegans from the natural habitat. Methods in Molecular Biology. 1327, 221-229 (2015).
- Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application. PloS one. 16 (10), 0254293(2021).
- Mobile data collection & workflow automation in NCAP. , Available from: https://www.fulcrumapp.com/ (2021).
- Nematode Isolation Application. , Available from: https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation (2021).
- Nematode Field Sampling Application. , Available from: https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling (2021).
- JOVE wild_isolate-genotyping-template. , Available from: https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit (2021).
- Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query. , Available from: https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch (2021).
- easyFulcrum. , Available from: http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html (2021).
- Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. A variant in the neuropeptide receptor npr-1 is a major determinant of Caenorhabditis elegans growth and physiology. PLoS Genetics. 10 (2), 1004156(2014).
- Tuli, M. A., Daul, A., Schedl, T. WormBook: Caenorhabditis Nomenclature. WormBook. , (2018).
- Stiernagle, T. WormBook: Maintenance of C. Elegant. WormBook. , (2006).
重印与许可
