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方法文章

显微解剖小鼠脉络丛中免疫细胞的分离与鉴定

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⸱

DOI：

10.3791/63487

⸱

2022年2月3日

 ,  ,  ,  , 
1Brain-Immune Communication Lab, Institut Pasteur, 2Cytometry platform, CB UTechS, Institut Pasteur

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究对分离灌注的小鼠脑脉络丛采用流式细胞术及两种不同的设门策略；该方案可鉴定出定位于此脑结构中的主要免疫细胞亚群。

摘要

大脑不再被视为孤立运作的器官；越来越多的证据表明，外周免疫系统的变化能够间接影响大脑功能。在大脑与体循环之间的交界处，构成血液-脑脊液屏障的脉络丛（choroid plexuses, CP）被认为是外周与大脑之间通讯的关键部位。CP 可产生脑脊液、神经营养因子以及信号分子，从而影响大脑稳态。CP 同时也是一个活跃的免疫微环境。与生理条件下主要由小胶质细胞构成的大脑实质不同，CP 的免疫细胞具有高度异质性，其多样性与其它外周器官相似。CP 免疫细胞的多样性和活性会随着衰老、应激和疾病状态而改变，并可调节 CP 上皮细胞的活动，从而间接影响大脑功能。本实验方案的目标是分离小鼠 CP，并鉴定其中约 90% 的主要免疫细胞亚群。该方法可用于表征 CP 免疫细胞，帮助理解其在介导外周-大脑通讯中的功能。该方案有望揭示 CP 免疫细胞在健康状态及多种疾病条件下如何间接调控大脑功能。

引言

自19世纪末保罗·埃尔利希发现血脑屏障以来th 近一个世纪以来，大脑一直被认为几乎与其他器官和血液系统相互隔离。然而，过去十年中出现了一种新概念，即大脑功能受到多种生物因素的塑造，例如肠道微生物群以及全身性的免疫细胞和信号分子。1,2,3,4与此同时，其他脑部边界结构，如脑膜和脉络丛（CP），已被确认为活跃的免疫-脑相互作用界面，而非惰性的屏障组织5,6,7,8.

脉络丛（CP ）构成血-脑脊液屏障，是分隔大脑与外周系统的重要边界之一。它们位于脑室系统的四个脑室内，即第三脑室、第四脑室以及两个侧脑室，并邻近参与神经发生的区域，如脑室下区和海马齿状回的颗粒下区3。结构上，脉络丛由一层有孔毛细血管网组成，这些毛细血管被单层上皮细胞包裹，上皮细胞之间通过紧密连接和黏附连接相互连接9,10。脉络丛上皮细胞的主要生理功能包括脑脊液的生成，后者可清除大脑中的代谢废物和蛋白质聚集体；此外，还负责多种信号分子（包括激素和神经营养因子）从血液向脑内的生成与受控转运11,12,13。脉络丛分泌的分子可调节大脑活动，例如通过调控神经发生和小胶质细胞功能14,15,16,17,18,19，这使得脉络丛在维持大脑稳态中发挥关键作用。脉络丛还参与多种免疫活动；在非病理状态下，脑实质中的主要免疫细胞类型为小胶质细胞，而脉络丛的免疫细胞群体多样性则与外周器官相当3,7，提示在脉络丛处存在多种免疫调节与信号传导通路在发挥作用。

脉络丛（CP）的内皮细胞与上皮细胞之间的空间即CP间质，主要由边界相关巨噬细胞（BAM）占据，这些细胞在炎症信号刺激下可表达促炎性细胞因子及与抗原呈递相关的分子3。另一类巨噬细胞亚型——Kolmer's epiplexus细胞，则位于CP上皮的顶侧表面20。CP间质同时也是树突状细胞、B细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、固有淋巴样细胞以及T细胞的生态位，其中T细胞多为效应记忆T细胞，能够识别中枢神经系统抗原7,21,22,23,24。此外，当机体或大脑受到干扰时，CP部位免疫细胞群体的组成和活性会发生改变，例如在衰老10,14,15,21,25、微生物群扰动7、应激26以及疾病状态27,28过程中均可见此类变化。值得注意的是，这些变化被认为会间接影响大脑功能；例如，在脑衰老过程中，CP中的CD4+ T细胞向Th2型炎症偏移，进而触发来自CP的免疫信号，可能参与调控与衰老相关的认知功能下降14,15,21,25,29。因此，阐明CP免疫细胞的特性对于深入理解其对CP上皮生理功能及分泌活动的调控作用至关重要，也将有助于解析其在健康与疾病状态下对大脑功能的间接影响。

脉络丛（CP）是仅包含少量免疫细胞的小型结构。其分离需要在灌注预处理后进行显微解剖，否则血液中的免疫细胞将造成严重污染。本方案旨在通过流式细胞术对脉络丛中的髓系细胞和T细胞亚群进行表征。该方法可鉴定在非炎症条件下小鼠脉络丛中约90%的免疫细胞群体，与近期采用其他方法解析脉络丛免疫异质性的研究结果一致7,10,28。本方案可用于在体内（in vivo）研究疾病及其他实验范式下脉络丛免疫细胞区室的变化。

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方案

所有操作均符合欧洲委员会关于实验动物管理的指导方针（指令86/609/EEC），并经伦理委员会No. 59、CETEA/CEEA No. 089批准，批准编号为dap210067，APAFIS #32382-2021070917055505 v1。

1. 材料准备

  1. 将所有抗体（材料表）在 4 °C 下避光保存。
  2. DAPI 储存液（1 mg/mL）：用 PBS-/-（材料表）重悬粉末，分装后于 -20 °C 保存。
  3. DAPI 工作液（0.1 mg/mL）：将 DAPI 储存液用 PBS-/- 按 1:10 的比例稀释。
  4. 磁珠激活细胞分选（MACS）缓冲液：在 PBS-/- 中配制含 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）和 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）（材料表）的溶液。
  5. IV 型胶原酶储存液（20 U/μL）：用 PBS+/+（材料表）重悬粉末，分装后于 -20 °C 保存。
    注意：IV 型胶原酶需要 MgCl2 才能完全激活；请勿对 IV 型胶原酶溶液进行冻融。
  6. 麻醉镇痛溶液：将 150 μL 氯胺酮（150 mg/kg）、25 μL 赛拉嗪（5 mg/kg）和 330 μL 布托啡诺（0.1 mg/kg）溶于 1 mL 的 PBS-/- 中混合。
    注意：麻醉镇痛溶液需现用现配，且存放时间不得超过一天。
  7. 肝素溶液（100 U/mL）：用 PBS-/- 重悬粉末。
  8. 准备灌注插入系统，将一根导管连接至装有 PBS-/- 的锥形烧瓶。在灌注管末端连接一根 23 G 针头。打开灌注系统，让 PBS 流动直至导管内无气泡。
  9. 准备配备光源的双目放大镜。

C57BL/6 小鼠的饲养

  1. 用于分析CP髓系细胞或T细胞时，每种细胞使用四只小鼠，并合并四只小鼠的CP组织（每侧脑室各两个，第三脑室和第四脑室） 脑室脉络丛（每只小鼠独立处理，共八只）；不合并脉络丛样本可能导致因稀有免疫细胞群体丰度极低而无法检测到这些细胞。
  2. 让小鼠在任何实验开始前至少适应环境7天。将小鼠饲养在恒定温湿度的无病原体环境中，光照周期为12小时光照/12小时黑暗或14小时光照/10小时黑暗，自由饮水并提供标准颗粒饲料 随意摄取.

3. PBS 灌注与脑组织解剖

  1. 称量每只小鼠的体重，并按10 μL/g剂量腹腔注射麻醉-镇痛混合溶液（步骤1.6）。
  2. 等待约30分钟以确保充分镇痛（通过轻捏小鼠脚趾检查麻醉深度）。
  3. 将麻醉的小鼠仰卧于解剖支架上，并用胶带固定其掌部至解剖支架。
  4. 用镊子夹住动物皮肤，剪开腹部、横膈膜和胸腔，暴露心脏。
    注意：打开胸腔后，脑组织将处于缺氧状态，操作必须准确迅速 并迅速进入灌注的下一步操作。
  5. 向左心室直接注射 20 μL 浓度为 100 U/mL 的肝素溶液。
  6. 用精细剪刀在右心房做一处至少3 mm的切口，以使血液流出体外。
  7. 紧接着，将连接在灌注管末端的23 G针头插入左心室顶端。
  8. 以最大流速打开灌注系统并等待灌注完成：使用23 G针头，以约6 mL/min的流速，灌注在3分钟内完成。
    注意：肝脏等器官均匀变色表明灌注有效。
  9. 关闭灌注系统，并将针头从心脏心室中取出。
  10. 移除小鼠掌部的胶带，将小鼠置于腹位。
  11. 用镊子夹住动物的皮肤，配合剪刀，从眼睛至耳朵处去除头部顶部的皮肤。
  12. 使用剪刀，先从两眼之间开始剪开颅骨，然后从每只眼睛外侧沿咬肌上方剪向脊髓。操作时应使用剪刀尖端，动作轻柔，避免剪刀损伤脑组织。
  13. 用镊子夹住两眼之间的颅骨末端，打开颅骨。
  14. 使用剪刀剪断脊髓，用镊子夹取脑组织，将镊子的两个尖端置于脑组织外侧，倾斜脑组织并将其放入盛有冰冻PBS的培养皿中+/+随后立即收集CP。
    注意：检查脑组织是否出现变色，以验证灌注效果。

4. 从脑组织中分离脉络丛

  1. 将脑组织背侧朝上置于培养皿中，并位于双目放大镜的物镜下方。
  2. 用镊子固定脑组织，同时将另一把镊子的两端沿大脑半球之间的中线插入。
  3. 使用镊子将同侧的皮层、胼胝体和海马从隔区拉开，暴露侧脑室及部分第三脑室。
  4. 侧脑室脉络丛（lateral CP）呈长条状薄膜结构，沿侧脑室分布，两端展开。用细镊子的尖端夹住侧脑室脉络丛。注意收集可能被海马后褶遮挡的三角形后部区域。
  5. 将对侧半球的皮层、胼胝体和海马从隔区拉开，以充分暴露整个第三脑室及对侧侧脑室。
  6. 用精细镊子收集第三脑室脉络丛（third CP），其为一短小结构，表面呈颗粒状。
  7. 收集另一侧的侧脑室脉络丛。
  8. 将镊子的两端插入小脑与中脑之间，分离小脑与脑桥及延髓，以暴露第四脑室。
  9. 第四脑室脉络丛（fourth CP）为一长条状球形结构，表面呈颗粒状，沿第四脑室分布，位于小脑与延髓之间，从右侧外侧端延伸至左侧端。使用精细镊子将其完整取出。
    注意：镊子表面的硅烷涂层可防止脉络丛黏附于镊子上。
  10. 对其余七只小鼠重复步骤 3.1–4.9。在此期间，已收集的脉络丛可暂时保存在置于冰上的离心管中。

5. 流式细胞术分析样品的制备

  1. 将所有已解剖的脉络丛（CP）组织放入离心管中，并用 PBS+/+ 补充至终体积 750 μL。
    注意：使用细镊子将解剖后的脉络丛转移至离心管时会带入少量 PBS+/+。建议直接将现有液体体积补充至 750 μL，而非弃去后重新加入 750 μL 新鲜 PBS+/+，以避免可能的脉络丛组织损失。
  2. 加入 15 μL 浓度为 20 U/μL 的 IV 型胶原酶储备液（见步骤 1.5），使终浓度为 400 U/mL。
    注意：可添加 DNAse I（150 μg/mL）以防止细胞过度聚集。
  3. 将脉络丛与 IV 型胶原酶在 37 °C、轻度振荡（300 RPM）条件下孵育 45 分钟。
  4. 轻轻吹打约 10 次，以完成脉络丛的解离。
  5. 用 MACS 缓冲液（见配方步骤 1.4）将脉络丛离心管补至 1.5 mL，以终止 IV 型胶原酶活性。
    注意：IV 型胶原酶的活性在低温下停止，并可被血清白蛋白抑制。
  6. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，并用 1.5 mL MACS 缓冲液重悬细胞进行洗涤。
  7. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 再次离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于 220 μL MACS 缓冲液中。
  8. 从细胞悬液中分装出 10 μL 作为未染色对照（见后续步骤 5.18）。
  9. 从细胞悬液中另取 10 μL 作为 DAPI 单染对照（见后续步骤 5.12）。
  10. 将剩余的 200 μL 细胞悬液与抗小鼠 CD16/CD32 封闭抗体（1:100）在 4 °C 预孵育 20 分钟，以阻断非特异性 Fc 受体介导的结合。
  11. 将细胞均分为两份，每份 100 μL，分别装入两个离心管中（一管用于髓系细胞分析，另一管用于 T 细胞分析）（见后续步骤 5.14）。
  12. 取步骤 5.9 中保留的含 10 μL 细胞的 DAPI 单染对照样本，用 MACS 缓冲液补至 100 μL（见后续步骤 5.14）。
  13. 准备十一支新离心管，每管加入 100 μL MACS 缓冲液，用于抗体单染（步骤 5.14.4）和全染对照（步骤 5.14.5），并向每管中加入一滴补偿微珠。
    注意：补偿对照将用于设定荧光检测激光的电压，并评估各荧光染料在其他检测通道中的非特异性信号，以便在后续进行补偿校正。
  14. 样本的抗体孵育：
    1. 髓系细胞样本：加入 0.1 mg/mL DAPI（1:100）（见步骤 1.3）、FITC 标记的抗小鼠 CD45 抗体（1:100）、PE-Dazzle 594 标记的抗小鼠 CD11b 抗体（1:100）、APC 标记的抗小鼠 CX3CR1 抗体（1:100）、BV711 标记的抗小鼠 Ly6C 抗体（1:100）、PE 标记的抗小鼠 F4/80 抗体（1:100）以及 APC-Cy7 标记的抗小鼠 IA-IE 抗体（1:100）。
    2. T 细胞样本：加入 0.1 mg/mL DAPI（1:100）、FITC 标记的抗小鼠 CD45 抗体（1:100）、PE-Dazzle 594 标记的抗小鼠 CD11b 抗体（1:100）、APC 标记的抗小鼠 TCRβ 抗体（1:100）、PE 标记的抗小鼠 CD8a 抗体（1:100）以及 APC-Cy7 标记的抗小鼠 CD4 抗体（1:50）。
    3. DAPI 单染对照（来自步骤 5.12）：加入 0.1 mg/mL DAPI（1:100）。
    4. 抗体单染补偿微珠：将之前用于髓系细胞和 T 细胞样本的九种抗体（相同稀释比例）分别单独加入含有微珠的九支离心管中（每种抗体对应一管）。
      注意：单染补偿对照将在补偿步骤中用于确定每种荧光标记物的阳性荧光峰。分析仪将这些信号与未染色对照 CP 细胞中的阴性信号进行比较。
    5. 抗体全染补偿微珠：将所有用于髓系细胞染色的抗体加入一支微珠管中，将所有用于 T 细胞染色的抗体加入另一支微珠管中。
      注意：全染补偿对照将用于设定各荧光激光检测通道的电压，并评估荧光染料在其他通道中的潜在非特异性信号。
    6. 在冰上避光孵育 30–45 分钟。
  15. 用 MACS 缓冲液将所有离心管补至 1.5 mL。在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞和补偿微珠。
  16. 弃去上清液，并用 1.5 mL MACS 缓冲液洗涤细胞和补偿微珠。
  17. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 再次离心 5 分钟，弃去上清液。
  18. 将细胞和补偿微珠重悬于 500 μL MACS 缓冲液中。将未染色对照（步骤 5.8）用 MACS 缓冲液补至 500 μL。
  19. 将含有 CP 细胞的各管样本（未染色 CP、DAPI 单染对照、髓系细胞和 T 细胞样本）通过 70 μm 细胞筛进行过滤。

6. 流式细胞术

注意：本方案中使用的流式细胞仪配备以下5种激光器：355 nm紫外激光器、405 nm紫激光器、488 nm蓝激光器、561 nm黄绿激光器和637 nm红激光器。

  1. 使用细胞仪设置、追踪（CST）界面以及CST质控微球，对细胞仪执行每日质量控制检查，以确保分析之间的一致性、仪器性能稳定以及目标荧光强度的可重复性。
  2. 设置流式细胞术实验时，创建包含双变量图和直方图的新实验。确保包含前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）图，以及每种荧光颜色的直方图，用于监控数据采集过程。
  3. 通过未染色对照CP细胞设定FSC-A和SSC-A参数的光电倍增管（PMT）电压，以定义细胞形态学特征。
  4. 通过在未染色对照CP细胞上设定荧光染料的阴性峰，并利用经所有抗体染色的补偿微球确定各荧光标记的阳性峰，设定每种荧光标记的电压，同时确保检测信号未超出量程，且在其他通道中无过强的交叉信号干扰。
  5. 创建补偿矩阵以分析每种单色补偿对照。在FSC-A/SSC-A图上圈选适当的细胞群后，通过直方图检查单染对照样本并记录补偿对照数据。在记录完所有单染样本后，计算补偿矩阵。
  6. 记录髓系细胞和T细胞群体中检测到的所有事件。

7. CP 髓系细胞门控

  1. 选择 FSC-A 与 SSC-A 并根据细胞大小设门。
  2. 使用 FSC-A 与前向散射高度（FSC-H）创建单细胞的子门。
  3. 使用 DAPI 与 FSC-A 创建活细胞的子门，排除 DAPI+ 细胞。
  4. 使用 CD45 与 FSC-A 创建 CD45+ 免疫细胞的子门。
  5. 在 CD45+ 细胞基础上创建子门，并选择 CD11b 与 F4/80，鉴定以下两个群体：CD11b+ F4/80+ 和 CD11b+ F4/80- 群体（见下一步 7.8）。
  6. 创建 CD11b+ F4/80+ 细胞的子门，并选择 CX3CR1 与 IA-IE，鉴定出 CX3CR1+ IA-IE+ BAM 群体，进一步命名为 CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM，以及 CX3CR1+ IA-IE- 巨噬细胞。
  7. 创建 CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- 巨噬细胞的子门，并选择 F4/80 与 CD11b，鉴定出 CD11bhigh F4/80intermediate 和 CD11b+ F4/80high 两个群体，分别进一步称为 CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmer's epiplexus 巨噬细胞和 CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- BAM。
    注：CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- 与 CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- 细胞在 F4/80intermediate 至 F4/80high 和 CD11bhigh 至 CD11b+ 水平之间略有混合。
  8. 从 CD11b+ F4/80- 群体（步骤 7.5）设门分析 Ly6C 与 IA-IE，选择 IA-IE+ Ly6C- 群体和主要对应于单核细胞/中性粒细胞的 IA-IE- Ly6C+ 细胞。
    注：IA-IE- Ly6C+ 细胞大量存在可能反映在无炎症状态下动物灌注效率存在问题；其丰度应较低。
  9. 为 CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- 群体创建子门，并选择 CD11b 与 CX3CR1，鉴定出 CD11bhigh CX3CR1low 和 CD11b+ CX3CR1- 两个群体。

8. CP T 细胞门控

  1. 选择 FSC-A 与 SSC-A 并根据细胞大小设门。
  2. 使用 FSC-A 与前向散射高度（FSC-H）创建单细胞的子门。
  3. 使用 DAPI 与 FSC-A 创建活细胞的子门，排除 DAPI+ 细胞。
  4. 使用 CD45 与 FSC-A 创建 CD45+ 免疫细胞的子门。
  5. 在 CD45+ 细胞中创建子门，并选择 TCRβ 与 CD11b，排除 CD11b+ 髓系细胞，圈选 TCRβ+ CD11b- T 细胞群体。
  6. 对 TCRβ+ CD11b- 群体创建子门，并选择 CD4 与 CD8a，鉴定 CD8- CD4+ T 细胞和 CD8+ CD4- T 细胞。

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结果

本研究中展示的流式细胞术分析成功揭示了髓系细胞和T细胞的主要亚群（分别为图1和图2），以及每只小鼠体内这些细胞亚群的相对总数，且结果具有高度可重复性（图3）。

骨髓细胞的流式细胞术分析显示，脉络丛（CP）主要由CD11b+ CX3CR1+ F4/80high 的脑膜边界相关巨噬细胞（BAM）构成，占CP中CD45+ 免疫细胞的近80%。根据MHC-II的表达情况，这些BAM可分为两个不同亚群：其中IA-IE+ BAM为主要群体，占CD45+ 免疫细胞的72%，与既往发表的数据一致7；另一群为IA-IE- BAM。此外，还鉴定出Kolmer氏脉络丛上皮巨噬细胞（epiplexus mac...

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讨论

旨在研究免疫系统对脑稳态及脑部疾病作用的研究主要集中于脑实质内驻留的细胞，而忽视了脉络丛（CP）等脑边界结构，尽管后者对脑功能具有至关重要的贡献2,3。由于脉络丛体积小、驻留免疫细胞数量少且组织获取困难，对其进行免疫细胞群体分析具有挑战性。对全脑免疫细胞（CD45+）进行的流式细胞术分析无法有效鉴定脉络丛中稀有的免疫细胞群体。为了高精度地表征脉络丛的免疫组成，本研究对经PBS灌流小鼠分离的脉络丛组织进行了流式细胞术分析。该方法可排除循环中的CD45+细胞以及脉络丛中的CD45-细胞（如周细胞、内皮细胞和上皮细胞）32。通过聚焦于髓系细胞和T细胞群体的设门策略，可鉴定出脉络丛中主要的免疫细胞亚群。

当前方案的关键步骤是PBS灌注。由于脉络丛（CP）免疫细胞十分稀少，血液污染可能完全掩盖其局部异质性。常规需检查肝脏和脑组织的褪色情况作为对照，以确保血液污染降...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

感谢巴斯德研究所动物饲养中心和CB-UTechS设施成员提供的帮助。本工作得到巴斯德研究所的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗小鼠 CD16/CD32BD Biosciences553142流式细胞术抗体
牛血清白蛋白MP Biomedicals160069封闭试剂
APC 标记抗小鼠 CX3CR1BioLegend149008流式细胞术抗体
APC 标记抗小鼠 TCRbBioLegend109212流式细胞术抗体
APC-Cy7 标记抗小鼠 CD4BioLegend100414流式细胞术抗体
APC-Cy7 标记抗小鼠 IA-IEBioLegend107628流式细胞术抗体
BD FACSymphony A5 细胞分析仪BD Biosciences流式细胞仪分析仪
BV711 标记抗小鼠 Ly6CBioLegend128037流式细胞术抗体
IV 型胶原酶Gibco17104-019用于解离 CP 组织的酶
DAPIThermo Scientific62248活/死细胞标记物
EDTA离子螯合剂
精细剪刀FST14058-11解剖工具
FITC 标记抗小鼠 CD45BioLegend103108流式细胞术抗体
流量控制器灌注嵌件CareFusionRG-3-C血液灌注嵌件
FlowJo 软件BD Biosciences分析软件
镊子FST11018-12解剖工具
肝素Sigma-AldrichH3149-10KU抗凝剂
ImalgeneBoehringer Ingelheim氯胺酮，麻醉剂
OneComp eBeadsInvitrogen01-1111-42用于实现补偿的对照微珠
PBS-/-Gibco14190-094缓冲液
PBS+/+Gibco14040-091缓冲液
PE 标记抗小鼠 CD8aBioLegend100708流式细胞术抗体
PE 标记抗小鼠 F4/80BioLegend123110流式细胞术抗体
PE-Dazzle 594 标记抗小鼠 CD11bBioLegend101256流式细胞术抗体
RompunBayer赛拉嗪，麻醉剂
细镊Dumoxel Biology11242-40解剖工具
VetergesicCeva丁丙诺啡，镇痛剂

参考文献

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