从微解剖小鼠脉络丛中分离和表征免疫细胞

摘要

本研究使用流式细胞术和两种不同的门控策略对分离的灌注小鼠脑脉络丛;该协议确定了填充该大脑结构的主要免疫细胞亚群。

摘要

大脑不再被视为孤立运作的器官;越来越多的证据表明，外周免疫系统的变化可以间接塑造大脑功能。在大脑和体循环之间的界面，构成血脑脊液屏障的脉络丛（CP）被强调为脑外交流的关键部位。脑脊髓质酸产生脑脊液、神经营养因子和信号分子，这些分子可以塑造大脑稳态。CP也是一个活跃的免疫学利基。与在生理条件下主要由小胶质细胞填充的脑实质相反，CP免疫细胞的异质性概括了在其他外周器官中发现的多样性。脑瘫免疫细胞的多样性和活性随衰老、应激和疾病而变化，调节脑瘫上皮的活性，从而间接塑造大脑功能。该协议的目标是分离小鼠CP并确定填充它们的主要免疫亚群的约90%。该方法是表征CP免疫细胞并了解它们在协调外围到大脑通信中的功能的工具。拟议的方案可能有助于破译CP免疫细胞如何在健康和各种疾病条件下间接调节大脑功能。

引言

自从保罗·埃尔利希（Paul Erhlich）在19^世纪末 发现血脑屏障以来，大脑一直被认为与其他器官和血液几乎分离。然而，在过去的十年中，出现了大脑功能由各种生物因素塑造的概念，例如肠道微生物群和全身免疫细胞和信号^{1，2，3，4}。与此同时，其他脑边界，如脑膜和脉络丛（CP）已被确定为活动免疫 - 脑串扰的界面，而不是惰性屏障组织^{5，6，7，8}。

脑瘫构成血脑脊液屏障，是分隔大脑和外围的边界之一。它们位于大脑的四个心室中，即第三个、第四个和两个侧心室，并且与参与神经发生的区域（例如海马体的脑室下区和粒下区^）相邻3。在结构上，CP由由单层上皮细胞包围的开窗状毛细血管网络组成，这些细胞通过紧密和粘附连接相互连接^9，

方案

所有程序均符合欧盟委员会关于处理实验动物的指南，指令86/609/EEC。它们由第59号伦理委员会批准，由CETEA / CEEA第089号批准，编号为dap210067和APAFIS #32382-2021070917055505 v1。

1. 材料的准备

1. 将所有抗体（材料表）储存在4°C，避免光照。
2. DAPI储备溶液（1mg / mL）:将粉末重悬于PBS^-/- （材料表），等分试样，并储存在-20°C。
3. DAPI工作溶液（0.1 mg / mL）:以1:10的比例用PBS^-/- 稀释DAPI储备溶液。
4. 磁活化细胞分选（MACS）缓冲液:在PBS^-/-中制备2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和0.5%牛血清白蛋白（BSA）（材料表）。
5. 胶原酶IV储备溶液（20 U / μL）:将粉末重悬于PBS ^{+ / +} （材料表），等分试样，并储存在-20°C。
   注意:胶原酶IV需要_MgCl2 完全活跃;不要冻融胶原蛋白酶IV溶液。
6. 麻醉镇痛液:将150μL氯胺酮（150mg / kg）....

结果

这里介绍的流式细胞术分析以高度可重复的方式成功地揭示了髓细胞和T细胞的主要亚群（分别为图1和图2），以及它们每只小鼠的相对总数（图3）。

对骨髓细胞的流式细胞术分析表明，CP由CD11b ⁺ _CX3CR1 ⁺ F4 / ^80high BAM填充，占CP处CD45 ⁺免疫细胞的近80%。这些BAM根据其MHC-II的表达分为两个不同的群体:构成主要组的IA-IE ⁺ BAM（CD45 ⁺免疫细胞的72%），与先前发表的数据⁷一致，以及IA-IE-BAM。还鉴定了科尔默双神经丛巨噬细胞的CD11bhigh F4/80^中介体_{CX3CR1<.......}

讨论

旨在了解对大脑稳态和疾病的免疫学贡献的研究主要集中在脑实质内的细胞上，而忽略了脑边界，如CP，但这些边界仍然是大脑功能的关键贡献者^2，3。由于CP的小尺寸，驻留免疫细胞的数量少以及访问这种组织的复杂，CP免疫细胞群的分析具有挑战性。对全脑免疫细胞（CD45 ⁺）进行的流式细胞术不允许表征驻留在CP中的罕见免疫群体。为了高精度地表征CP的免疫组成，对从PBS灌注的小鼠中解剖的CP进行了流式细胞术分析。这种方法允许排除循环CD45 ⁺ 细胞和CP CD45^- 细胞，例如周细胞，内皮细胞和上皮细胞³²。专注于骨髓和T细胞群的门控策略确定了主要的CP免疫亚群。

当前方案的关键步骤是PBS灌注。由于CP免疫细胞很少见，血液污染可以完全掩盖其局部异质性。肝脏和大脑变色总是被检查作为控制，因此血液污染是最小的。一致而言，CD11b ⁺ F4 / .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 CD16/CD32	BD Biosciences 553142		流式细胞术抗体
白蛋白、牛	MP Biomedicals	160069	封闭试剂
APC 抗小鼠 CX3CR1	BioLegend	149008	流式细胞术抗体
APC 抗小鼠 TCRb	BioLegend	109212	流式细胞术抗体
APC-Cy7 抗小鼠 CD4	BioLegend	100414	流式细胞术抗体
APC-Cy7 抗小鼠 IA-IE	BioLegend	107628	流式细胞术抗体
BD FACSymphony A5 细胞分析仪	BD Biosciences		流式细胞仪
BV711 抗小鼠 Ly6C	BioLegend	128037	流式细胞术抗体
胶原酶 IV	Gibco	17104-019	酶解离 CP 组织
DAPI	Thermo Scientific	62248	活/死标记
EDTA			离子螯合剂
细剪刀	FST	14058-11	解剖工具
FITC 抗小鼠 CD45	BioLegend	103108	流式细胞术抗体
流量控制器输液插入	CareFusion	RG-3-C	血液灌注插图
FlowJo 软件	BD Biosciences		分析软件
镊子	FST	11018-12	解剖工具
肝素	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	抗凝剂
Imalgene	Boehringer Ingelheim		氯胺酮，麻醉剂
OneComp eBeads	Invitrogen	01-1111-42	对照珠子实现补偿
PBS-/-	Gibco	14190-094	缓冲液
PBS+/+	Gibco	14040-091	缓冲液
PE 抗小鼠 CD8a	BioLegend	100708	流式细胞术抗体
PE 抗小鼠 F4/80	BioLegend	123110	流式细胞术抗体
PE-Dazzle 594 抗小鼠 CD11b	BioLegend	101256	流式细胞术抗体
Rompun	Bayer		甲苯噻嗪，麻醉
细镊子	Dumoxel Biology	11242-40	解剖工具
Vetergesic	Ceva		Buprenorphin，镇痛药