从微解剖小鼠脉络丛中分离和表征免疫细胞

摘要

本研究使用流式细胞术和两种不同的门控策略对分离的灌注小鼠脑脉络丛;该协议确定了填充该大脑结构的主要免疫细胞亚群。

摘要

大脑不再被视为孤立运作的器官;越来越多的证据表明，外周免疫系统的变化可以间接塑造大脑功能。在大脑和体循环之间的界面，构成血脑脊液屏障的脉络丛（CP）被强调为脑外交流的关键部位。脑脊髓质酸产生脑脊液、神经营养因子和信号分子，这些分子可以塑造大脑稳态。CP也是一个活跃的免疫学利基。与在生理条件下主要由小胶质细胞填充的脑实质相反，CP免疫细胞的异质性概括了在其他外周器官中发现的多样性。脑瘫免疫细胞的多样性和活性随衰老、应激和疾病而变化，调节脑瘫上皮的活性，从而间接塑造大脑功能。该协议的目标是分离小鼠CP并确定填充它们的主要免疫亚群的约90%。该方法是表征CP免疫细胞并了解它们在协调外围到大脑通信中的功能的工具。拟议的方案可能有助于破译CP免疫细胞如何在健康和各种疾病条件下间接调节大脑功能。

引言

自从保罗·埃尔利希（Paul Erhlich）在19^世纪末 发现血脑屏障以来，大脑一直被认为与其他器官和血液几乎分离。然而，在过去的十年中，出现了大脑功能由各种生物因素塑造的概念，例如肠道微生物群和全身免疫细胞和信号^{1，2，3，4}。与此同时，其他脑边界，如脑膜和脉络丛（CP）已被确定为活动免疫 - 脑串扰的界面，而不是惰性屏障组织^{5，6，7，8}。

脑瘫构成血脑脊液屏障，是分隔大脑和外围的边界之一。它们位于大脑的四个心室中，即第三个、第四个和两个侧心室，并且与参与神经发生的区域（例如海马体的脑室下区和粒下区^）相邻3。在结构上，CP由由单层上皮细胞包围的开窗状毛细血管网络组成，这些细胞通过紧密和粘附连接相互连接^9，10。脑瘫上皮的主要生理作用涉及脑脊液的产生，脑脊液从废物代谢物和蛋白质聚集体中冲洗大脑，以及产生和控制各种信号分子的血脑通道，包括激素和神经营养因子^11，12，13。来自CP的分泌分子通过调节神经发生和小胶质细胞功能来塑造大脑的活动^{14，15，16，17，18，19}，这使得CP对大脑稳态至关重要。CP还从事各种免疫活动;虽然在非病理条件下脑实质中的主要免疫细胞类型是小胶质细胞，但CP免疫细胞群的多样性与外周器官一样广泛^3，7，这表明免疫调节和信号传导的各种通道在CP中起作用。

内皮细胞和上皮细胞之间的空间，CP基质，主要由边界相关巨噬细胞（BAM）填充，其表达促炎细胞因子和与抗原呈递相关的分子，以响应炎症信号³。巨噬细胞的另一种亚型，Kolmer's epiplexus细胞，存在于CP上皮的顶端表面²⁰。CP基质也是树突状细胞，B细胞，肥大细胞，嗜碱性粒细胞，嗜中性粒细胞，先天淋巴细胞和T细胞的利基，这些细胞主要是能够识别中枢神经系统抗原的效应记忆T细胞^{7，21，22，23，24}。此外，CP处免疫细胞群的组成和活性会随着全身或脑部的扰动而变化，例如在衰老过程中^{10，14，15，21，25}，微生物群扰动⁷，^stress26和疾病^27，28。值得注意的是，这些变化被认为间接塑造了大脑功能，即CP CD4 ⁺ T细胞向Th2炎症的转变发生在大脑衰老中，并触发CP的免疫信号传导，可能塑造衰老相关的认知能力下降^{14，15，21，25，29}.因此，阐明CP免疫细胞的特性对于更好地了解它们对CP上皮生理和分泌的调节功能至关重要，从而破译它们在健康和疾病条件下对大脑功能的间接影响。

脑瘫是仅包含少数免疫细胞的小结构。它们的隔离需要在灌注的初步步骤后进行显微解剖;否则，血液中的免疫细胞将构成主要污染物。该协议旨在使用流式细胞术表征CP的髓细胞和T细胞亚群。该方法鉴定了在非炎性条件下构成小鼠CP的约90%的免疫细胞群，根据最近发表的使用其他方法解剖免疫CP异质性的工作^7，10，28。该方案可用于表征CP免疫细胞区室中疾病的变化以及 体内其他实验范式。

方案

所有程序均符合欧盟委员会关于处理实验动物的指南，指令86/609/EEC。它们由第59号伦理委员会批准，由CETEA / CEEA第089号批准，编号为dap210067和APAFIS #32382-2021070917055505 v1。

1. 材料的准备

1. 将所有抗体（材料表）储存在4°C，避免光照。
2. DAPI储备溶液（1mg / mL）:将粉末重悬于PBS^-/- （材料表），等分试样，并储存在-20°C。
3. DAPI工作溶液（0.1 mg / mL）:以1:10的比例用PBS^-/- 稀释DAPI储备溶液。
4. 磁活化细胞分选（MACS）缓冲液:在PBS^-/-中制备2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和0.5%牛血清白蛋白（BSA）（材料表）。
5. 胶原酶IV储备溶液（20 U / μL）:将粉末重悬于PBS ^{+ / +} （材料表），等分试样，并储存在-20°C。
   注意:胶原酶IV需要_MgCl2 完全活跃;不要冻融胶原蛋白酶IV溶液。
6. 麻醉镇痛液:将150μL氯胺酮（150mg / kg），25μl木拉嗪（5mg / kg）和330μl丁前耳（0.1mg / kg）混合在1mL PBS^-/-中。
   注意:立即准备麻醉镇痛液，不要保存超过一天。
7. 肝素溶液（100 U / mL）:将粉末重悬于PBS^-/-中。
8. 准备输液插入系统，将管子连接到装有PBS^-/-的卧螺离心机。将23 G针连接到输液管的末端。打开输液器，让PBS运行，直到管子里没有气泡。
9. 准备装有灯的双目放大镜。

2. C57BL/6小鼠的外壳

1. 对于CP髓样CP或T细胞的分析，每个使用四只小鼠，并将四只CP（每个侧脑室，第三脑室和第四脑室CP中的两只;总共八只小鼠）。不汇集CP会带来由于其丰度低而无法检测到CP中罕见免疫群体的风险。
2. 在任何实验之前，让小鼠适应至少7天。将小鼠保持在无病原体的条件下，在恒温恒湿，12/12小时或14/10小时的光/暗循环中，用水和标准颗粒食物随意。

3. PBS灌注和脑部解剖

1. 称量每只小鼠，腹腔内注射10μL/ g麻醉 - 镇痛混合溶液（步骤1.6）。
2. 等待约30分钟以进行有效的镇痛（通过捏住小鼠的手指检查麻醉深度）。
3. 将麻醉的小鼠平放在其背部，解剖支架上，并将其手掌贴在解剖支架上。
4. 用镊子捏住动物的皮肤，用剪刀，打开腹部，横膈膜和胸部以暴露心脏。
   注意:当胸部打开时，大脑会缺氧。人们必须精确而迅速地进行灌注的下一步。
5. 将20μL100 U / mL肝素溶液直接注射到左心室中。
6. 用细剪刀，在右心房做一个至少3毫米的切口，让血液流出体外。
7. 之后，立即将放置在输液管末端的23G针头插入左心室的尖端。
8. 最大限度打开输注系统并等待完全灌注:使用23G针头，流速约为6mL / min，灌注在3分钟内完成。
   注意:肝脏等器官的均匀变色证明了灌注功效。
9. 关闭输液系统，将针头从心室取出。
10. 从鼠标的手掌上取下胶带。将鼠标置于腹侧位置。
11. 用镊子捏住动物的皮肤，用剪刀，从眼睛到耳朵去除头顶的皮肤。
12. 在剪刀的帮助下，首先在眼睛之间切下颅骨，然后从每只眼睛横向切到咬肌上方的脊髓。为此，请使用剪刀的四肢并轻轻进行，以避免用剪刀损坏大脑。
13. 用镊子从眼睛之间的四肢捏开头骨。
14. 用剪刀剪断脊髓，用镊子拔出大脑，将两个点放在大脑的外侧倾斜，并将其放入装满冰冷PBS ^{+ / +}的培养皿中。然后立即收集CP。
    注意:检查大脑变色以验证灌注功效。

4. 从大脑中解剖脉络丛

1. 将脑背侧朝上放置在培养皿中，位于双目放大镜的物镜下方。
2. 在镊子的帮助下将大脑保持在适当的位置，将另一个镊子的两端向下插入半球之间的中线。
3. 使用镊子将带有胼胝体和海马体的皮层从隔膜上拉开，暴露外侧心室和第三脑室的一部分。
4. 将侧脑瘫确定为两端耀斑的侧脑室的长面纱。使用薄镊子的两端捕捉侧CP.小心收集可能被海马体后褶皱隐藏的三角形后部。
5. 将带有对侧半球胼胝体和海马体的皮层从隔膜上拉开，以暴露整个第三脑室和对侧心室。
6. 用细镊子收集第三个CP，可以识别为具有颗粒表面的短结构。
7. 收集另一个侧向 CP。
8. 将镊子的两端向下插入小脑和中脑之间。将小脑与脑桥和髓质分离，露出第四心室。
9. 将第四个脑室识别为具有颗粒状表面的长球状结构，该表面面从小脑和髓质之间的外侧右端到左端排列第四脑室。用细镊子收集第四个CP。
   注:镊子的硅烷基涂层可防止镊子上CP的粘性。
10. 对其他七只小鼠中的每只小鼠重复步骤3.1-4.9。同时，收集的CP可以暂时保存在放置在冰上的管中。

5. 制备用于流式细胞术分析的样品

1. 将包含所有解剖的CP的管子填充至750μLPBS ^{+ / +}。
   注意:用薄镊子在管中沉积解剖的CP会带来少量的PBS ^{+ / +}。宁愿将现有体积完成至750μL，而不是取出并用新鲜的750μLPBS ^{+ / +} 替换它，以避免CP组织的可能损失。
2. 加入15μL20 U / μL胶原酶IV储备溶液（见步骤1.5），以获得400 U / mL最终浓度。
   注意:DNAse I（150μg/ mL）可以防止细胞过度聚集。
3. 在37°C轻度搅拌（300RPM）下将CP与胶原酶IV孵育45分钟。
4. 轻轻地上下移液约10次，以完成CP解离。
5. 用MACS缓冲液将CP管填充至1.5mL（参见食谱步骤1.4）以停止胶原酶IV活性。
   注意:胶原酶IV活性在低温下停止并被血清白蛋白抑制。
6. 在4°C下以500× g离心细胞5分钟。 弃去上清液并用1.5mL MACS缓冲液洗涤细胞。
7. 在4°C下以500× g 离心细胞5分钟。 弃去上清液并将细胞重悬于220μLMACS缓冲液中。
8. 从细胞悬浮液中分离出10μL等分试样，用作未染色的对照（下一步5.18）。
9. 从细胞悬浮液中分离出10μL等分试样，用作DAPI单色对照（下一步5.12）。
10. 用抗小鼠CD16 / CD32阻断抗体（1:100）在4°C下预孵育剩余的200μL20分钟，以阻断非特异性Fc介导的相互作用。
11. 将细胞分成两个100μL管（一个用于骨髓细胞分析，另一个用于T细胞分析）（下一步5.14）。
12. 取样品中含有10μL细胞进行DAPI单色染色对照（步骤5.9），并用MACS缓冲液填充至100μL（下一步5.14）。
13. 为抗体单染色（步骤5.14.4）和全染色对照（步骤5.14.5）准备11个含有100μLMACS的新管，并在每个中加入一滴补偿微球。
    注意:补偿控制将允许设置荧光检测激光器的电压，并评估荧光染料在其他通道中潜在的非特异性信号检测，这些通道将被进一步补偿。
14. 样品的抗体孵育:
    1. 骨髓样本:加入0.1 mg/mL DAPI （1:100）（参见步骤1.3）、FITC抗小鼠CD45（1:100）、PE-Dazzle 594抗小鼠CD11b（1:100）、APC抗小鼠_CX3CR1（1:100）、BV711抗小鼠Ly6C（1:100）、PE抗小鼠F4/80（1:100）和APC-Cy7抗小鼠IA-IE（1:100）。
    2. T细胞样品:加入0.1 mg / mL DAPI（1:100），FITC抗小鼠CD45（1:100），PE-Dazzle 594抗小鼠CD11b（1:100），APC抗小鼠TCRβ（1:100），PE抗小鼠CD8a（1:100）和APC-Cy7抗小鼠CD4（1:50）。
    3. DAPI单色对照（从步骤5.12开始）:加入0.1 mg / mL DAPI（1:100）。
    4. 抗体单染色补偿微球:将先前用于骨髓和T细胞样品的九种抗体中的每一种（相同的稀释度）分别（每管一个）加入含有微球的九个管中。
       注:单色补偿对照将允许在补偿步骤期间确定每个所用荧光标记物的正荧光峰。分析仪会将它们与在未染色的对照CP细胞中观察到的负信号进行比较。
    5. 抗体全染色补偿珠:将所有用于骨髓染色的抗体加入一个管中，将用于T细胞染色的抗体添加到另一个管中。
       注:全染色补偿控制将允许设置每个荧光激光检测的电压，并评估荧光染料在其他通道中的潜在非特异性信号检测。
    6. 在冰上孵育30-45分钟，避免光照。
15. 用MACS缓冲液填充所有管子，最大1.5 mL。在4°C下以500× g离心细胞和补偿珠5分钟。
16. 弃去上清液，将细胞和补偿微球在1.5mLMACS缓冲液中洗涤。
17. 在4°C下以500× g离心细胞和补偿珠5分钟。 丢弃上清液。
18. 将细胞和补偿微球重悬于500μLMACS缓冲液中。用MACS缓冲液填充至500 μL的未染色对照（步骤5.8）。
19. 通过70μm过滤器（未染色的CP，DAPI单染色对照以及髓样和T细胞样品）过滤每个带有CP细胞的管。

6. 流式细胞术

注:本方案中使用的流式细胞仪配备以下5种激光器:355 nm紫外激光器、405 nm紫外激光器、488 nm蓝色激光器、561 nm黄绿色激光器和637 nm红色激光器。

1. 使用细胞仪设置、跟踪 （CST） 接口和 CST 控制微球对细胞仪执行日常质量控制检查，以确保分析、仪器质量和一致目标荧光强度之间的一致性。
2. 要设置流式细胞术实验，请使用二元图和直方图创建新实验。确保包含前向散射区域 （FSC-A） 和侧散射区域 （SSC-A） 图以及每种颜色的直方图，以监控采集情况。
3. 通过在未染色的对照CP细胞上设置FSC-A和SSC-A参数的PMT电压来定义细胞形态。
4. 通过使用用所有抗体染色的补偿珠设置未染色的对照CP细胞上荧光染料的负峰和荧光染料的正峰，并确保检测器信号不会超出尺度并且不会在其他通道中交叉检测，从而定义每个荧光标记物的电压。
5. 创建补偿矩阵以分析每个单色补偿控件。在对适当的FSC-A/SSC-A群体进行门控后，检查直方图上的单染色对照并记录补偿对照。记录所有单染色样品后，计算补偿基质。
6. 记录骨髓和T细胞群检测到的所有事件。

7. 脑卒中型脑脊髓细胞门控

1. 选择 FSC-A 与 SSC-A 和细胞门（基于大小）。
2. 为具有 FSC-A 与正向散射高度 （FSC-H） 的单细胞创建子门。
3. 使用 DAPI 与 FSC-A 为活细胞创建子门，以排除 DAPI⁺ 细胞。
4. 用CD45与FSC-A为CD45 ⁺ 免疫细胞创建子门。
5. 从CD45 ⁺ 细胞创建子门并选择CD11b与F4 / 80，确定以下两组:CD11b ⁺ F4 / 80 ⁺ 和CD11b ⁺ F4 / 80^- 群体（下一步7.8）。
6. 为 CD11b⁺ F4/80⁺ 细胞创建子门，然后选择 _CX3CR1 与 IA-IE。识别 _CX3CR1⁺ IA-IE⁺ BAM，进一步计价为 CD11b⁺ F4/^80high _CX3CR1⁺ IA-IE⁺ BAM 和 _CX3CR1⁺ IA-IE^- 巨噬细胞。
7. 为 CD11b⁺ F4/80⁺ _CX3CR1⁺ IA-IE^-巨噬细胞创建子门，然后选择 F4/80 与 CD11b。识别 CD11bhigh F4/80 ^中介和 CD11b⁺ F4/80 ^高群体，这些群体进一步称为 CD11bhigh F4/80 ^中介 _CX3CR1⁺ IA-IE^- Kolmer 顿悟丛巨噬细胞和 CD11b⁺ F4/^80high _CX3CR1⁺ IA-IE-BAM，分别。
   注意:CD11bhigh F4/80^中介_CX3CR1⁺ IA-IE^-和CD11b⁺ F4/^80high _CX3CR1⁺ IA-IE^-细胞在F4/80^中介F4/^80high和CD11bhigh-CD11b⁺水平之间出现混合。
8. 从CD11b ⁺ F4 / 80^-群体（步骤7.5）中，Ly6C与IA-IE的门。选择主要对应于单核细胞/嗜中性粒细胞的IA-IE⁺ Ly6C^{-群体和IA-IE-Ly6C}+细胞。
   注意:IA-IE-Ly6C ⁺细胞的高存在可能反映了没有炎症的动物的灌注功效问题;它们的丰度应该很低。
9. 为 CD11b⁺ F4/80^- IA-IE⁺ Ly6C^- 群体创建一个子门，并选择 CD11b 与 _CX3CR1，识别 CD11bhigh _CX3CR1low 和 CD11b⁺ _CX3CR1^- 群体。

8. CP T细胞门控

1. 选择 FSC-A 与 SSC-A 和细胞门（基于大小）。
2. 为具有 FSC-A 与正向散射高度 （FSC-H） 的单细胞创建子门。
3. 使用 DAPI 与 FSC-A 为活细胞创建子门，以排除 DAPI⁺ 细胞。
4. 用CD45与FSC-A为CD45 ⁺ 免疫细胞创建子门。
5. 从CD45 ⁺细胞创建子门并选择TCRβ与CD11b.排除CD11b ⁺髓系细胞并选择TCRβ ⁺ CD11b-T细胞群。
6. 为TCRβ ⁺ CD11b^- 群体创建子门，然后选择CD4与CD8a。鉴定CD8^- CD4 ⁺ T细胞和CD8 ⁺ CD4^- T细胞。

结果

这里介绍的流式细胞术分析以高度可重复的方式成功地揭示了髓细胞和T细胞的主要亚群（分别为图1和图2），以及它们每只小鼠的相对总数（图3）。

对骨髓细胞的流式细胞术分析表明，CP由CD11b ⁺ _CX3CR1 ⁺ F4 / ^80high BAM填充，占CP处CD45 ⁺免疫细胞的近80%。这些BAM根据其MHC-II的表达分为两个不同的群体:构成主要组的IA-IE ⁺ BAM（CD45 ⁺免疫细胞的72%），与先前发表的数据⁷一致，以及IA-IE-BAM。还鉴定了科尔默双神经丛巨噬细胞的CD11bhigh F4/80^中介体_CX3CR1<...

讨论

旨在了解对大脑稳态和疾病的免疫学贡献的研究主要集中在脑实质内的细胞上，而忽略了脑边界，如CP，但这些边界仍然是大脑功能的关键贡献者^2，3。由于CP的小尺寸，驻留免疫细胞的数量少以及访问这种组织的复杂，CP免疫细胞群的分析具有挑战性。对全脑免疫细胞（CD45 ⁺）进行的流式细胞术不允许表征驻留在CP中的罕见免疫群体。为了高精度地表征CP的免疫组成，对从PBS灌注的小鼠中解剖的CP进行了流式细胞术分析。这种方法允许排除循环CD45 ⁺ 细胞和CP CD45^- 细胞，例如周细胞，内皮细胞和上皮细胞³²。专注于骨髓和T细胞群的门控策略确定了主要的CP免疫亚群。

当前方案的关键步骤是PBS灌注。由于CP免疫细胞很少见，血液污染可以完全掩盖其局部异质性。肝脏和大脑变色总是被检查作为控制，因此血液污染是最小的。一致而言，CD11b ⁺ F4 / ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 CD16/CD32	BD Biosciences 553142		流式细胞术抗体
白蛋白、牛	MP Biomedicals	160069	封闭试剂
APC 抗小鼠 CX3CR1	BioLegend	149008	流式细胞术抗体
APC 抗小鼠 TCRb	BioLegend	109212	流式细胞术抗体
APC-Cy7 抗小鼠 CD4	BioLegend	100414	流式细胞术抗体
APC-Cy7 抗小鼠 IA-IE	BioLegend	107628	流式细胞术抗体
BD FACSymphony A5 细胞分析仪	BD Biosciences		流式细胞仪
BV711 抗小鼠 Ly6C	BioLegend	128037	流式细胞术抗体
胶原酶 IV	Gibco	17104-019	酶解离 CP 组织
DAPI	Thermo Scientific	62248	活/死标记
EDTA			离子螯合剂
细剪刀	FST	14058-11	解剖工具
FITC 抗小鼠 CD45	BioLegend	103108	流式细胞术抗体
流量控制器输液插入	CareFusion	RG-3-C	血液灌注插图
FlowJo 软件	BD Biosciences		分析软件
镊子	FST	11018-12	解剖工具
肝素	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	抗凝剂
Imalgene	Boehringer Ingelheim		氯胺酮，麻醉剂
OneComp eBeads	Invitrogen	01-1111-42	对照珠子实现补偿
PBS-/-	Gibco	14190-094	缓冲液
PBS+/+	Gibco	14040-091	缓冲液
PE 抗小鼠 CD8a	BioLegend	100708	流式细胞术抗体
PE 抗小鼠 F4/80	BioLegend	123110	流式细胞术抗体
PE-Dazzle 594 抗小鼠 CD11b	BioLegend	101256	流式细胞术抗体
Rompun	Bayer		甲苯噻嗪，麻醉
细镊子	Dumoxel Biology	11242-40	解剖工具
Vetergesic	Ceva		Buprenorphin，镇痛药