显微解剖小鼠脉络丛中免疫细胞的分离与鉴定

摘要

本研究对分离灌注的小鼠脑脉络丛采用流式细胞术及两种不同的设门策略；该方案可鉴定出定位于此脑结构中的主要免疫细胞亚群。

摘要

大脑不再被视为孤立运作的器官；越来越多的证据表明，外周免疫系统的变化能够间接影响大脑功能。在大脑与体循环之间的交界处，构成血液-脑脊液屏障的脉络丛（choroid plexuses, CP）被认为是外周与大脑之间通讯的关键部位。CP 可产生脑脊液、神经营养因子以及信号分子，从而影响大脑稳态。CP 同时也是一个活跃的免疫微环境。与生理条件下主要由小胶质细胞构成的大脑实质不同，CP 的免疫细胞具有高度异质性，其多样性与其它外周器官相似。CP 免疫细胞的多样性和活性会随着衰老、应激和疾病状态而改变，并可调节 CP 上皮细胞的活动，从而间接影响大脑功能。本实验方案的目标是分离小鼠 CP，并鉴定其中约 90% 的主要免疫细胞亚群。该方法可用于表征 CP 免疫细胞，帮助理解其在介导外周-大脑通讯中的功能。该方案有望揭示 CP 免疫细胞在健康状态及多种疾病条件下如何间接调控大脑功能。

引言

自19世纪末保罗·埃尔利希发现血脑屏障以来^th 近一个世纪以来，大脑一直被认为几乎与其他器官和血液系统相互隔离。然而，过去十年中出现了一种新概念，即大脑功能受到多种生物因素的塑造，例如肠道微生物群以及全身性的免疫细胞和信号分子。^1,2,3,4与此同时，其他脑部边界结构，如脑膜和脉络丛（CP），已被确认为活跃的免疫-脑相互作用界面，而非惰性的屏障组织^5,6,7,8.

脉络丛（CP ）构成血-脑脊液屏障，是分隔大脑与外周系统的重要边界之一。它们位于脑室系统的四个脑室内，即第三脑室、第四脑室以及两个侧脑室，并邻近参与神经发生的区域，如脑室下区和海马齿状回的颗粒下区³。结构上，脉络丛由一层有孔毛细血管网组成，这些毛细血管被单层上皮细胞包裹，上皮细胞之间通过紧密连接和黏附连接相互连接

方案

所有操作均符合欧洲委员会关于实验动物管理的指导方针（指令86/609/EEC），并经伦理委员会No. 59、CETEA/CEEA No. 089批准，批准编号为dap210067，APAFIS #32382-2021070917055505 v1。

1. 材料准备

1. 将所有抗体（材料表）在 4 °C 下避光保存。
2. DAPI 储存液（1 mg/mL）：用 PBS^-/-（材料表）重悬粉末，分装后于 -20 °C 保存。
3. DAPI 工作液（0.1 mg/mL）：将 DAPI 储存液用 PBS^-/- 按 1:10 的比例稀释。
4. 磁珠激活细胞分选（MACS）缓冲液：在 PBS^-/- 中配制含 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）和 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）（材料表）的溶液。
5. IV 型胶原酶储存液（20 U/μL）：用 PBS^+/+（材料表）重悬粉末，分装后于 -20 °C 保存。
   注意：IV 型胶原酶需要 MgCl₂ 才能完全激活；请勿对 IV 型胶原酶溶液进行冻融。
6. 麻....

结果

本研究中展示的流式细胞术分析成功揭示了髓系细胞和T细胞的主要亚群（分别为图1和图2），以及每只小鼠体内这些细胞亚群的相对总数，且结果具有高度可重复性（图3）。

骨髓细胞的流式细胞术分析显示，脉络丛（CP）主要由CD11b⁺ CX₃CR1⁺ F4/80^high 的脑膜边界相关巨噬细胞（BAM）构成，占CP中CD45⁺ 免疫细胞的近80%。根据MHC-II的表达情况，这些BAM可分为两个不同亚群：其中IA-IE⁺ BAM为主要群体，占CD45⁺ 免疫细胞的72%，与既往发表的数据一致⁷；另一群为IA-IE^- BAM。此外，还鉴定出Kolmer氏脉络丛上皮巨噬细胞（epiplexus mac.......

讨论

旨在研究免疫系统对脑稳态及脑部疾病作用的研究主要集中于脑实质内驻留的细胞，而忽视了脉络丛（CP）等脑边界结构，尽管后者对脑功能具有至关重要的贡献^2,3。由于脉络丛体积小、驻留免疫细胞数量少且组织获取困难，对其进行免疫细胞群体分析具有挑战性。对全脑免疫细胞（CD45⁺）进行的流式细胞术分析无法有效鉴定脉络丛中稀有的免疫细胞群体。为了高精度地表征脉络丛的免疫组成，本研究对经PBS灌流小鼠分离的脉络丛组织进行了流式细胞术分析。该方法可排除循环中的CD45⁺细胞以及脉络丛中的CD45^-细胞（如周细胞、内皮细胞和上皮细胞）³²。通过聚焦于髓系细胞和T细胞群体的设门策略，可鉴定出脉络丛中主要的免疫细胞亚群。

当前方案的关键步骤是PBS灌注。由于脉络丛（CP）免疫细胞十分稀少，血液污染可能完全掩盖其局部异质性。常规需检查肝脏和脑组织的褪色情况作为对照，以确保血液污染降.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 CD16/CD32	BD Biosciences	553142	流式细胞术抗体
牛血清白蛋白	MP Biomedicals	160069	封闭试剂
APC 标记抗小鼠 CX3CR1	BioLegend	149008	流式细胞术抗体
APC 标记抗小鼠 TCRb	BioLegend	109212	流式细胞术抗体
APC-Cy7 标记抗小鼠 CD4	BioLegend	100414	流式细胞术抗体
APC-Cy7 标记抗小鼠 IA-IE	BioLegend	107628	流式细胞术抗体
BD FACSymphony A5 细胞分析仪	BD Biosciences		流式细胞仪分析仪
BV711 标记抗小鼠 Ly6C	BioLegend	128037	流式细胞术抗体
IV 型胶原酶	Gibco	17104-019	用于解离 CP 组织的酶
DAPI	Thermo Scientific	62248	活/死细胞标记物
EDTA			离子螯合剂
精细剪刀	FST	14058-11	解剖工具
FITC 标记抗小鼠 CD45	BioLegend	103108	流式细胞术抗体
流量控制器灌注嵌件	CareFusion	RG-3-C	血液灌注嵌件
FlowJo 软件	BD Biosciences		分析软件
镊子	FST	11018-12	解剖工具
肝素	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	抗凝剂
Imalgene	Boehringer Ingelheim		氯胺酮，麻醉剂
OneComp eBeads	Invitrogen	01-1111-42	用于实现补偿的对照微珠
PBS-/-	Gibco	14190-094	缓冲液
PBS+/+	Gibco	14040-091	缓冲液
PE 标记抗小鼠 CD8a	BioLegend	100708	流式细胞术抗体
PE 标记抗小鼠 F4/80	BioLegend	123110	流式细胞术抗体
PE-Dazzle 594 标记抗小鼠 CD11b	BioLegend	101256	流式细胞术抗体
Rompun	Bayer		赛拉嗪，麻醉剂
细镊	Dumoxel Biology	11242-40	解剖工具
Vetergesic	Ceva		丁丙诺啡，镇痛剂