使用场效应生物传感技术探索分子伴侣Hsp90与其客户蛋白激酶Cdc37之间的生物分子相互作用

摘要

场效应生物传感（FEB）是一种用于检测生物分子相互作用的无标记技术。它测量通过石墨烯生物传感器的电流，结合目标被固定到该传感器。FEB技术用于评估Hsp90和Cdc37之间的生物分子相互作用，并检测到两种蛋白质之间的强相互作用。

摘要

生物分子相互作用通过调节和协调功能相关的生物事件，在众多细胞过程中发挥多种作用。蛋白质，碳水化合物，维生素，脂肪酸，核酸和酶等生物分子是生物的基本组成部分;它们组装成生物系统中的复杂网络，以同步无数的生活事件。蛋白质通常利用复杂的相互作用组网络来执行其功能;因此，必须评估这种相互作用，以揭示它们在细胞和生物体水平上在细胞中的重要性。为了实现这一目标，我们引入了一种快速新兴的技术，场效应生物传感（FEB），以确定特定的生物分子相互作用。FEB是一种台式，无标记且可靠的生物分子检测技术，用于确定特定的相互作用，并使用高质量的电子生物传感器。FEB技术可以监测纳米摩尔范围内的相互作用，因为其生物传感器表面使用了生物相容性纳米材料。作为概念验证，阐明了热休克蛋白90（Hsp90）和细胞分裂周期37（Cdc37）之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）。Hsp90是一种ATP依赖性分子伴侣，在许多蛋白质的折叠，稳定性，成熟和质量控制中起着至关重要的作用，从而调节多种重要的细胞功能。Cdc37被认为是一种蛋白激酶特异性分子伴侣，因为它特异性识别并招募蛋白激酶到Hsp90以调节其下游信号转导途径。因此，Cdc37被认为是Hsp90的共同伴侣。伴侣激酶途径（Hsp90 / Cdc37复合物）在促进细胞生长的多种恶性肿瘤中被过度激活;因此，它是癌症治疗的潜在靶点。本研究证明了使用Hsp90/Cdc37模型系统的FEB技术的有效性。FEB检测到两种蛋白质之间的PPI很强（在三个独立实验中K_D 值为0.014μM，0.053μM和0.072μM）。总之，FEB是一个无标签且具有成本效益的PPI检测平台，可提供快速准确的测量。

引言

生物分子相互作用:
蛋白质是生物体的重要组成部分，参与许多分子途径，如细胞代谢，细胞结构，细胞信号传导，免疫反应，细胞粘附等。虽然一些蛋白质独立执行其功能，但大多数蛋白质使用结合界面与其他蛋白质相互作用以协调适当的生物活性¹。

生物分子相互作用可以主要根据所涉及的蛋白质²的独特结构和功能特征进行分类，例如，基于蛋白质表面的复合物稳定性或相互作用的持久性³。鉴定必需蛋白质及其在生物分子相互作用中的作用对于在分子水平⁴上理解生化机制至关重要。目前，有各种方法来检测这些相互作用⁵:体外⁶， 计算机⁷，活细胞⁸，离体⁹和 体内¹⁰，每种方法都有自己的优点和缺点。

使用整个动物作为实验工具¹¹进行

方案

注意:本研究中使用的重组蛋白Hsp90和Cdc37是商业获得的（见 材料表）。

1. 芯片激活

注:实验中使用的所有材料都列在 材料表中。通过无菌的0.2μm过滤器过滤所有准备好的溶液。

1. 通过在15 mL管中加入2mg EDC到2.5mL 1 M 2-（N-吗啉基）乙烷磺酸（MES）缓冲液（pH = 6.0）中，制备1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）溶液。通过在单独的15 mL管中加入6mg磺基NHS到2.5mL的1M MES缓冲液（pH = 6.0）中来制备N-羟基磺基琥珀酰亚胺（磺基NHS）溶液。
2. 通过上下移液（不涡旋）混合等体积的EDC砂磺-NHS溶液（50μLEDC + 50μL磺基NHS）。
   注意:EDC /磺基-NHS的混合溶液必须在30分钟内使用，以保持有效的交联，以实现适当的芯片功能化。
3. 将公司提供的生物传感器芯片（5.7 cm x 2.4 cm;见 材料表）放在装有盖子的玻璃培养皿中。建议芯片激活中涉及的所有功能化步骤都在培养皿内完成。将50μL1M MES缓冲液（pH = 6.0）施加到生物传感器芯片上，在室温下孵育1分钟，然后吸出缓冲液。
4. 立即将50μLEDC ....

结果

实验 1 的结果:
如上所述，将目标蛋白Hsp90（500 nM）固定到芯片上。对于第一个实验，根据文献中可用的数据制备了10种浓度的分析物蛋白Cdc37，范围从25 nM到5，000 nM（见 表1）。

通过跟踪I响应中发生的变化，可以实时监测实验的步骤（图3A）。人们可以想象方案中包含的每个步骤如何影响整个实验中的I-Response。例如，在校准期间，I-响应接近于零，并且在关联步骤中，I-响应随着分析物（Cdc37）浓度的增加而逐渐增加。查看该实验的数据（图3A），在低分析物浓度（25nM时为50 BU）中观察到I-响应的突然增加。在低分析物浓度下，预计I-响应较低，随着浓度的增加，I-Response将逐渐增加。这种突然增加表明，应该设计一个包含较低分析物浓度点的实验。

按照上面讨论的协议步骤，在提供的自动分析软件中分析数据，.......

讨论

本研究评估了使用FEB技术（一种实时动力学表征方法）的可行性，以确定Hsp90和Cdc37之间的生物分子相互作用。最初的探索性实验（第一个实验）表明，选择适当的分析物浓度是实验的关键部分，并且实验的设计应包括高于和低于K_D 值的浓度点，这些浓度点是根据文献中可用的数据预测的。

然而，如果没有关于相互作用的初步信息，我们建议设计一个初步实验，在较低的（0.08 nM，0.16 nM，0.4 nM，2 nM）和更高的（1，000 nM，2，500 nM，5，000 nM）范围内包括广泛的浓度点。初步实验提供了K_D 值的粗略估计，并能够使用正确的浓度范围计划后续实验，以获得准确的K_D 值。FEB系统提供编辑协议功能，用户可以自由选择实验的浓度点数。

根据我们的经验，FEB协议涉及的最关键步骤如下。目标蛋白和分析物缓冲液应与校准缓冲液相同。即使是很小的缓冲区不匹配也可能导致I-Response的波动，并给出不可靠的结果。因此，我们建议通过适当的缓冲液交换进行隔夜透析。在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动分析软件	Agile plus 软件，Cardea （Nanomed）	NA CAS 号：NA	在文中称为仪器随附的自动分析软件。生成自动分析。
COOH-BPU（生物传感处理单元）	Agile plus 软件，Cardea （Nanomed）	NA CAS 编号：NA	生物传感器芯片
数据审查软件	Datalign 1.0，Cardea （Nanomed）	NA CAS 编号：NA	在文中称为提供的数据审查软件。随仪器提供，允许查看和导出信息数据点。
透析袋	CelluSep， 膜过滤产品	T2-10-15 CAS 编号：NA	T2 管（6,000-8,000 MWCO），（10 mm fw，6.4mm Ø，0.32ml/cm，15m）
EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺）	Cardea（纳米）	EDC160322-02 CAS 号：25952-53-8	白色粉末
ITC（等温滴定量热法）系统	Microcal-PEAQ-ITC（英国马尔文）	NA CAS 号：
MES（2-（N-吗啉代）乙烷磺酸）缓冲液	Merck	M3671-50G CAS号：4432-31-9	白色粉末
NHS（N-羟基磺基琥珀酰亚胺）芯片	Cardea （Nanomed）	NA CAS号：NA	石墨烯基芯片
PBS（磷酸盐缓冲盐水）X 10	Bio-Lab	001623237500  CAS 号：7758-11-4	液体透明溶液
Pipete	Thermo Scientific	11855231 CAS 号：NA	Finnpipette F3 5-50 µL，黄色
淬火 1（3.9 mM 氨基-PEG5-醇溶于 1 X PBS）	Cardea（纳米药物）	0105-001-002-001 CAS 编号：NA	液体，透明溶液
淬火 2（1 M 乙醇胺 （pH=8.5））	Cardea（纳米药物）	0105-001-003-001 CAS 编号：NA	液体，透明溶液
重组蛋白 Cdc37	Abcam	ab256157 CAS 编号：NA
重组蛋白 Hsp90 beta	Abcam	ab80033 CAS 编号：NA
电子表格	Excel，Microsoft办公室	NA CAS 编号：NA
统计软件	GraphPad，棱镜	NA CAS 编号：NA	简称其他统计软件。也可以使用 Sigma 图、phyton 或其他统计程序
Sulfo-NHS	Cardea （Nanomed）	NHS160321-07 CAS 号：106627-54-7	白色粉末
尖端	Alex 红色	LC 1093-800-000 CAS 号：NA	尖端 1-200 µl，散装，1,000 个