利用连续切片电子显微镜对肝细胞中细胞器间接触位点进行三维表征

摘要

一种简单且全面的方案，用于获取肝脏肝细胞或其他组织细胞中细胞器之间膜接触位点的三维细节。

摘要

透射电子显微镜长期以来被认为是观察细胞超微结构的金标准。然而，分析通常局限于二维层面，限制了对细胞器三维（3D）超微结构及其功能关系的全面描述。体积电子显微镜（vEM）是一类技术的统称，能够以介观、微观和纳米级分辨率对细胞超微结构进行三维解析。

本方案提供了一种简便且可靠的获取体积电子显微镜（vEM）数据的方法，采用连续切片透射电子显微镜（TEM），涵盖从样品处理到数字化三维重建的全部技术环节，整个流程单一且直观。为展示该技术的应用价值，本文呈现了肝细胞中内质网与线粒体之间的三维超微结构关系及其接触位点。细胞器间的接触在离子、脂质、营养物质及其他小分子的转运过程中发挥着关键作用。然而，尽管这些接触位点最初是在肝细胞中被发现的，但关于其物理特征、动态行为及功能，仍有许多未知有待探索。

细胞器之间的接触可呈现多种形态，其特征在于两个细胞器彼此之间的接近程度（通常约为 ~10–30 nm）以及接触区域的范围（从点状接触至较大的类似囊腔的三维结构接触）。对这些紧密接触的观察需要高分辨率成像，而连续切片透射电镜（TEM）非常适合用于可视化肝细胞分化过程中细胞器间接触的三维超微结构，以及与代谢性疾病相关的肝细胞结构改变。

引言

自20世纪30年代发明以来，电子显微镜使研究人员能够观察细胞和组织的结构组分^1,2。大多数研究提供的是二维信息，因为构建三维模型需要 painstaking 的连续切片收集、手动摄影、底片处理、手工描记，以及从玻璃、塑料或泡沫塑料板上创建和组装三维模型^3,4。近70年后的今天，该过程的诸多方面已取得显著进展，包括显微镜性能、连续切片收集、自动数字成像，以及用于三维重建、可视化和分析的先进软件与硬件，同时还发展出多种替代方法，这些方法如今统称为体积电子显微镜技术（volume EM, vEM）。这些vEM技术通常被认为可在微米尺度范围内以纳米级分辨率提供三维超微结构信息，涵盖透射电子显微镜（TEM）和较新的扫描电子显微镜（SEM）技术；参见相关综述^5,6,7,8。

例如，聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM）利用扫描电镜（SEM）内的聚焦离子束，在对样品表面进行连续SEM成像扫描之间逐次铣削去除....

方案

所有动物的饲养均遵循英国政府内政部指南，组织采集操作均依照英国《1986年动物（科学程序）法案》进行。

1. 标本固定与制备

1. 将肝组织解剖成适当大小的组织块，约 8 mm × 8 mm × 3 mm，并将组织块置于预热的磷酸盐缓冲液（PBS，37 °C）中。
2. 向肝组织块中注射室温（20–25 °C）固定液（含 1.5% 戊二醛和 1% 蔗糖的 0.1 M 马来酸钠缓冲液），并将组织块从 PBS 转移至固定液中，在室温下固定不超过 20 分钟。操作过程中应始终确保组织完全浸没在溶液中，避免干燥。
   注意：醛类物质具有刺激性，具腐蚀性且可能致癌。马来酸钠若被吞咽或吸入有毒。所有固定液操作均需佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱内进行。良好的固定效果会使组织变硬。
3. 准备振动切片机，安装刀片，配备冰浴及盛有冷 PBS 的缓冲液托盘。用氰基丙烯酸酯胶水将第一块固定后的肝组织固定在样品托上，并将样品块转移至振动切片机。
4. 按照仪器制造商的建议，调整切片位置，将固定后的肝组织切成 100 µm 厚的切片。
5. 使用刮铲或天然毛刷收集切片，并将其转移至含有冰上预冷固定液（1.5% 戊二醛，0.1 M 马来酸钠缓冲液）的 12 孔或 24 孔板中，置于冰上。待所有样品切片完成并准备进入下一步处理前，始终保持切片处于冰上。
6. 选择包含目标区域....

结果

对于该技术，根据生物学研究目的在包埋组织修块和切片前预先选定感兴趣的区域。同样，切面的大小可能由具体的研究问题决定；本实验中，将样品修块至切面尺寸约为 0.3 mm × 0.15 mm（图 4A）。此尺寸可制备两个网格，每个网格包含 9 张连续切片，共获得 18 张连续切片，涵盖约 62 µm³（316 µm × 150 µm × 1.3 µm）体积的肝组织。该体积足以实现肝组织中单个线粒体的完整三维重建。

图 4：分割与三维重建分析.......

讨论

本方案描述了一种可及的vEM技术，用于在三维空间中可视化细胞器结构及其相互作用。本文以肝细胞中细胞器间接触的形态学特征作为案例进行展示。然而，该方法也已应用于研究多种其他样本和研究领域，包括外周神经中施万细胞与内皮细胞的相互作用⁴⁵、内皮细胞中魏贝尔-帕拉德小体的生物发生⁴⁶、肾细胞中的物质分泌⁴⁷，以及海马神经元突触的形态学⁴⁸。为了更深入地理解肝脏生物学，该方法可用于研究二维肝细胞培养、三维肝类器官模型系统⁴⁹以及肝脏组织中的肝细胞形态。这一稳健且灵活的方法适用于许多具备常规120 kV透射电子显微镜和超薄切片机的实验室，无需昂贵的样品制备技术。

尽管本方案具有较好的可操作性，但需要注意的是，尚有其他vEM技术可供选择，这些技术可能根据具体的研究问题为研究者提供某些优势；详见 表1 综述

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 注射器滤器	Sarstedt	83.1826.001
铝制托盘	Agar Scientific	AGG3912
Amira v6	ThermoFisher		https://www.thermofisher.com
氯仿	Fisher	C/4960/PB08
DDSA/十二烯基琥珀酸酐	TAAB	T027	Epon 组分
金刚石刀	DiaTOME	ultra 45°
DMP-30/2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚	TAAB	D032	Epon 组分
Dumont 镊子 N5	Agar Scientific	AGT5293
Fiji			https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 插件			https://imagej.net/
36% 甲醛溶液	TAAB	F003
Formvar 包被的载网	自制		替代品：EMS diasum (FF2010-Cu)
带涂布棒的玻璃瓶	Medisca	6258
玻璃小瓶	Fisher Scientific	15364769
25% 戊二醛溶液	TAAB	G011
MNA/甲基纳迪克酸酐	TAAB	M011	Epon 组分
2% 四氧化锇溶液	TAAB	O005
铁氰化钾	Sigma-Aldrich	P-8131
环氧丙烷	Fisher Scientific	E/0050/PB08
可重复使用粘合剂	Blue Tack
Reynolds 柠檬酸铅	TAAB	L037	切片染色
二甲胂酸钠	Sigma-Aldrich	C-0250	用于配制 0.1 M 二甲胂酸盐缓冲液
超级胶水	RS Components	918-6872	氰基丙烯酸酯胶，步骤 1.3
TAAB 812 树脂	TAAB	T023	Epon 组分
单宁酸	TAAB	T046
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
双组分环氧树脂	RS Components	132-605	替代品：步骤 2.13
超薄切片机	Leica	UC7
振动切片机	Leica		切片厚度 100 µm，切割速度 0.16 mm/s，振幅 1 mm。
Weldwood 原装接触胶	DAP	107	接触型粘合剂：步骤 3.1.4