方法文章

利用连续切片电子显微镜对肝细胞中细胞器间接触位点进行三维表征

DOI：

10.3791/63496

⸱

2022年6月9日

 ,  ,  , 
1MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 2NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre, University College London

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一种简单且全面的方案，用于获取肝脏肝细胞或其他组织细胞中细胞器之间膜接触位点的三维细节。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

透射电子显微镜长期以来被认为是观察细胞超微结构的金标准。然而，分析通常局限于二维层面，限制了对细胞器三维（3D）超微结构及其功能关系的全面描述。体积电子显微镜（vEM）是一类技术的统称，能够以介观、微观和纳米级分辨率对细胞超微结构进行三维解析。

本方案提供了一种简便且可靠的获取体积电子显微镜（vEM）数据的方法，采用连续切片透射电子显微镜（TEM），涵盖从样品处理到数字化三维重建的全部技术环节，整个流程单一且直观。为展示该技术的应用价值，本文呈现了肝细胞中内质网与线粒体之间的三维超微结构关系及其接触位点。细胞器间的接触在离子、脂质、营养物质及其他小分子的转运过程中发挥着关键作用。然而，尽管这些接触位点最初是在肝细胞中被发现的，但关于其物理特征、动态行为及功能，仍有许多未知有待探索。

细胞器之间的接触可呈现多种形态，其特征在于两个细胞器彼此之间的接近程度（通常约为 ~10–30 nm）以及接触区域的范围（从点状接触至较大的类似囊腔的三维结构接触）。对这些紧密接触的观察需要高分辨率成像，而连续切片透射电镜（TEM）非常适合用于可视化肝细胞分化过程中细胞器间接触的三维超微结构，以及与代谢性疾病相关的肝细胞结构改变。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

自20世纪30年代发明以来，电子显微镜使研究人员能够观察细胞和组织的结构组分1,2。大多数研究提供的是二维信息，因为构建三维模型需要 painstaking 的连续切片收集、手动摄影、底片处理、手工描记，以及从玻璃、塑料或泡沫塑料板上创建和组装三维模型3,4。近70年后的今天，该过程的诸多方面已取得显著进展，包括显微镜性能、连续切片收集、自动数字成像，以及用于三维重建、可视化和分析的先进软件与硬件，同时还发展出多种替代方法，这些方法如今统称为体积电子显微镜技术（volume EM, vEM）。这些vEM技术通常被认为可在微米尺度范围内以纳米级分辨率提供三维超微结构信息，涵盖透射电子显微镜（TEM）和较新的扫描电子显微镜（SEM）技术；参见相关综述5,6,7,8。

例如，聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM）利用扫描电镜（SEM）内的聚焦离子束，在对样品表面进行连续SEM成像扫描之间逐次铣削去除样品表面材料，从而实现对样品的重复自动化铣削与成像，进而构建用于三维重建的3D数据集9,10。相比之下，连续块面扫描电镜（SBF-SEM）则在SEM腔体内使用超薄切片机，在每次成像前去除样品块表面的材料11,12；而阵列断层成像是一种非破坏性过程，需先将连续超薄切片收集到盖玻片、晶圆或胶带上，然后建立自动化工作流程，在SEM中对各连续切片中的目标区域依次成像，以生成3D数据集13。与阵列断层成像类似，连续切片透射电镜（ssTEM）也需要在成像前预先收集物理切片；但这些切片需收集在透射电镜（TEM）载网上，并在TEM中进行成像14,15,16。ssTEM还可通过执行倾斜断层成像进一步扩展其应用17,18,19。连续倾斜断层成像在x、y和z方向均能提供最佳分辨率，尽管已被用于完整细胞的三维重建20，但其操作相对复杂且具有挑战性。本实验方案重点关注ssTEM的实际操作方面，因其是目前许多电子显微镜实验室最容易实现的三维电镜（vEM）技术，尤其适用于那些尚无专用切片设备或vEM专用仪器，但仍希望获得三维vEM数据的研究团队。

用于三维重建的连续超薄切片技术过去一直被认为具有挑战性。要切出厚度均匀且平直的切片条带，并将其按正确顺序排列并拾取到载网上，同时确保支撑充分，又不因载网栅条遮挡感兴趣区域，最重要的是避免切片丢失（因为不完整的系列可能导致无法完成完整的三维重建），这些操作都十分困难21。然而，近年来商用超薄切片机、金刚石切割刀与修块刀22,23、载网上的电子透明支持膜21,24，以及有助于切片黏附和条带保存的黏合剂13,21等方面的逐步改进，使该技术在许多实验室中已趋于常规化。一旦收集完成连续切片，在透射电子显微镜（TEM）中进行连续成像就相对简单，可获得在 x 和 y 方向上像素尺寸达亚纳米级的电镜图像，从而实现对亚细胞结构的高分辨率观察——这对许多研究问题而言可能是必要的。本文展示的案例研究，演示了连续切片透射电镜（ssTEM）与三维重建技术在肝细胞内质网（ER）-细胞器接触研究中的应用，其中 ER-细胞器接触最初即在此类细胞中被观察到25,26。

内质网虽与核膜相连，但也与多种其他细胞器形成紧密接触，包括溶酶体、线粒体、脂滴以及质膜27。内质网与其他细胞器之间的接触参与调控脂质代谢28、磷脂酰肌醇和钙信号传导29、自噬调控以及应激反应30,31。这些内质网-细胞器接触以及其他细胞器间接触是高度动态的结构，能够响应细胞代谢需求和胞外信号刺激。研究表明，它们在形态上表现出大小、形状以及细胞器膜间距等方面的差异32,33。这些超微结构的差异可能反映了其不同的蛋白质/脂质组成及功能34,35。然而，目前仍难以准确定义细胞器间的接触并对其进行分析36。因此，亟需一种可靠且简便的实验方案，用于进一步研究和表征细胞器间的接触结构。

由于内质网（ER）与细胞器之间的膜接触间距通常在10至30 nm之间，因此长期以来，透射电子显微镜（TEM）一直是识别此类结构的金标准。薄切片TEM技术已揭示出定位于特定膜接触位点的内质网驻留蛋白具有明确的亚区域定位37。传统上，该方法能够以纳米级分辨率揭示内质网与细胞器之间的接触，但通常仅提供这些相互作用的二维视图。然而，体积电子显微镜（vEM）技术可在三维空间中呈现这些接触位点的超微结构形态及其周围环境，从而实现对接触结构的完整重建，并更准确地分类（如点状、管状或类似扁囊状）和定量分析38,39。除了是最早观察到内质网-细胞器接触的细胞类型之一25,26，肝细胞还拥有广泛的其他细胞器间接触系统，这些接触在其细胞结构和生理功能中发挥着至关重要的作用28,40。然而，目前对肝细胞中内质网-细胞器及其他细胞器间接触的系统性形态学表征仍然不足。因此，细胞器间接触在肝细胞再生与修复过程中如何形成和重塑，对于理解肝细胞生物学及肝脏功能具有特别重要的意义。

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方案

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所有动物的饲养均遵循英国政府内政部指南，组织采集操作均依照英国《1986年动物（科学程序）法案》进行。

1. 标本固定与制备

  1. 将肝组织解剖成适当大小的组织块，约 8 mm × 8 mm × 3 mm，并将组织块置于预热的磷酸盐缓冲液（PBS，37 °C）中。
  2. 向肝组织块中注射室温（20–25 °C）固定液（含 1% 蔗糖和 1.5% 戊二醛的 0.1 M 马来酸钠缓冲液），并将组织块从 PBS 转移至固定液中，在室温下固定不超过 20 分钟。操作过程中应始终保持组织浸没在溶液中，以防干燥。
    注意：醛类物质具有刺激性，具腐蚀性且可能致癌。马来酸钠若被吞咽或吸入有毒。所有固定液操作均需佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱内进行实验。良好的固定效果会使组织变得更坚实。
  3. 准备振动切片机，安装刀片，配备冰浴及盛有冷 PBS 的缓冲液托盘。用氰基丙烯酸酯胶水将第一块固定后的肝组织固定在样品托上，并将样品块转移至振动切片机。
  4. 按照仪器制造商的建议，调整刀片接近组织，将固定后的肝组织切成 100 µm 厚的切片。
  5. 使用刮铲或天然毛刷收集切片，并将其转移至含有冰上预冷固定液（1.5% 戊二醛，0.1 M 马来酸钠缓冲液）的 12 孔或 24 孔板中，置于冰上。待所有样本切片完成并准备进入下一步处理前，始终保持切片处于冰上。
  6. 选择包含目标区域的切片用于后续处理，并进行轻柔振荡清洗。在 12 孔或 24 孔板中，使用室温的 0.1 M 马来酸钠缓冲液清洗三次，每次 5 分钟，确保切片有足够的缓冲液体积以自由移动。
    注意：通常根据研究的生物学问题相关的解剖学特征来选择目标区域，并优先选择在整系列切片中均可能存在的区域（例如，不在切片边缘处）且保存良好的区域。
  7. 在通风橱内，将 0.1 M 马来酸钠缓冲液替换为新配制的 1% 四氧化锇/1.5% 铁氰化钾溶液。将 12 孔或 24 孔板放入密封容器中，置于危险化学品专用冰箱中反应 1 小时。
    注意：四氧化锇在摄入、吸入或皮肤接触时具有极高毒性。铁氰化钾为刺激性物质，吸入或皮肤接触有害。操作时必须佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱内进行实验。
  8. 在通风橱内，将四氧化锇/铁氰化钾溶液移至专用的四氧化锇废液瓶中，随后用 0.1 M 马来酸钠缓冲液清洗样品三次，每次 5 分钟。将样品置于密封容器中，于 4 °C 过夜保存。
    注意：此为潜在的暂停点。样品可在含 0.1 M 马来酸钠缓冲液的密封容器中于 4 °C 保存数周，对组织保存质量影响较小。请确保缓冲液充足，防止组织干燥。
  9. 在避光条件下，室温下用新配制的 0.05 M 马来酸钠缓冲液中的 1% 单宁酸溶液孵育样品 45 分钟。
    注意：单宁酸具有刺激性，可能导致眼部损伤。请佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱内进行实验。
  10. 脱水与包埋前，用 ddH2O 清洗三次，每次 5 分钟。

2. 样品脱水、Epon 树脂包埋和切片

  1. 根据以下重量比例制备Epon树脂（见步骤2.2）。将一个含有搅拌子的100 mL一次性塑料烧杯置于天平上归零。剪去5支一次性塑料巴斯德吸管的尖端，用其将黏稠的树脂组分转移至烧杯中。
  2. 依次将19.2 g树脂-812、7.6 g DDSA、13.2 g MNA和0.8 g DMP-30促进剂加入烧杯中。使用第五支洁净的塑料巴斯德吸管手动充分混合树脂组分。
    注意：避免引入气泡，但需充分混合底部树脂与上层树脂，以实现颜色变化及组分层的初步混合。所有树脂组分均具有刺激性，吸入或皮肤接触有害。DMP-30 具有腐蚀性，可导致皮肤腐蚀。操作时应穿戴适当的个人防护装备。
  3. 将烧杯置于磁力搅拌器上，保持低速搅拌，并定期手动混匀树脂。
  4. 用70%乙醇轻轻振荡洗涤样本5分钟；重复一次。
  5. 用90%乙醇轻轻振荡洗涤样品5分钟；重复一次。
  6. 用100%乙醇轻轻振荡洗涤样本5分钟；重复一次。
  7. 在样品于通风橱中用100%乙醇洗涤的同时，于带耐丙烯酸氧化物（PO）塑料盖的玻璃小瓶中配制50:50（v/v）丙烯酸氧化物（PO）：Epon混合液。小心但牢固地盖紧玻璃小瓶盖，手持小瓶和瓶盖，振荡或涡旋混匀。
    注意：环氧丙烷为急性有毒、易燃的刺激性物质，可溶解某些塑料。操作时应佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱中进行实验。
  8. 步骤2.6之后，将样品置于耐PO容器（例如., 铝制托盘或玻璃小瓶）中，在通风橱内轻轻摇动/搅拌。
  9. 在通风橱中，将样品转移至100% Epon中。在通风橱内，室温下以摇动/旋转/振荡方式孵育2小时。将PO:Epon混合物转移至专用的玻璃Epon废液瓶中。
  10. 重复步骤 2.9 一次。
  11. 将样品进行包埋固定。根据切片的大小和目标区域，可直接将切片贴附于预聚合的树脂载片上，或进行平面包埋，以便后续解剖并再次包埋。
    注意：对于平面包埋，可使用“铸模载玻片”一次性包埋多个切片。剩余树脂可用于填充梁式胶囊，经烘烤制成预聚合的包埋 stub，或冷冻以备后续使用。
  12. 将样本装片并用足量树脂填充“cast-a-slide”腔体后，在60 °C烘箱中过夜烘烤。
    注意：可选暂停点。样品可在室温下保存数年。
  13. 对于重新包埋，在平铺包埋的组织切片中确定目标区域。使用珠宝锯切割出适当大小（1 mm）的组织块。2 至 4 毫米2）并将步骤2.2中制备的树脂置于预聚合块顶部，重新包埋，于60 °C烘箱中过夜烘烤。
    注意：也可使用双组分环氧树脂将组织块粘附于载物台或载物针上，室温下静置过夜使其固化。此步骤可作为潜在的暂停点。

3. 包埋样品的修块与连续切片

注意：切片是一项需要掌握的技能；在尝试连续切片之前，操作者应已熟练掌握超薄切片技术。由于不同制造商的超薄切片机控制方式各不相同，请遵循相应制造商的操作说明和指南。

  1. 将样品固定在修块适配器中后，使用剃刀刀片小心地修整树脂包埋的组织，以满足以下标准（参见 图1A，B):
    1. 确保有一个平坦的上表面，暴露出目标区域周围的组织。
    2. 确保呈梯形，顶部和底部边缘整齐且相互平行。
    3. 确保总体尺寸在200-500 µm范围内 x，100-500 µm y
    4. 确保形成不对称的块面，例如., 右上角约为90°，左上角为钝角，左下角为锐角。
      注意：修整用低温切片刀可作为剃刀刀片的替代工具。其他建议旨在方便用户在成像时有序收集切片。可选步骤：若切片难以形成稳定的带状，可在包埋块表面的前缘涂抹接触胶以辅助带状切片的形成。剃刀刀片非常锋利；操作时应小心持握，避免意外滑脱造成人身伤害。

透射电镜工作流程图：包埋、修块、切片、捞片、成像、图像对齐、三维重建。
图1：连续切片透射电镜工作流程。（A）样品在树脂块中的示意图。（B）修整树脂块，形成适合连续切片的梯形结构，并具有不对称的块面以确保方向明确。（C）示意图显示连续切片形成的片带漂浮在金刚石刀槽的水面上。（D）示意图显示片带和切片在直径为3 mm的透射电镜载网方孔上的排列方式，用于确定切片顺序。（E）透射电镜成像与导航。显示片带和切片的顺序，并在显示器上使用“黄色星形标签”进行屏幕定位，以确保在后续切片中可重新成像同一目标区域。（F）图像对齐与裁剪。（G）分割、三维重建与可视化。缩写：TEM = transmission electron microscopy。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 修剪完毕后，将标本弧连同卡盘和样品一起转移至切片机的标本臂上，使标本弧的运动范围自上而下；固定标本弧。
  2. 将金刚石刀安装并固定在刀架上，确保刀具的切割角度设置适当。将刀架牢固地锁定在载物台上。
  3. 打开透射光源，推进刀具，同时持续观察组织块切面与刀刃之间的相对位置。小心地将刀具向样本推进，通过调节相应旋钮，不断调整刀具的侧向角度、样本倾斜度和样本旋转角度，直至组织块与刀刃对齐。
  4. 关闭载物台上方照明，打开载物台下方照明；设定样品臂切削窗口的顶部和底部位置，使样品恰好位于刀刃下方。
  5. 用干净的 ddH₂O 注满刀舟2O，并确保水面与刀刃齐平且略微下凹。
  6. 可选：将睫毛浸入0.1% Triton X-100，随后浸入刀舟水中，以降低水的表面张力，便于氯仿处理和切片带的拾取。
  7. 准备工作站，包括睫毛（将睫毛粘附在吸管棒上）、涂有火棉胶的载网、标记好的交叉镊子、氯仿、0.1% Triton X-100 溶液、蒸馏水、滤纸以及装有载网盒记录单的载网盒。
  8. 将切片速度设为1 mm/s，初始切片厚度设为100 nm，然后启动切片循环。
  9. 第一个切片完成后，将切片参数更改为切片速度0.8 mm/s，切片厚度70 nm，继续切片，使切片在充满水的刀槽表面形成连续的切片带并向下移动图1C).
    注意：在制备树脂切片时，应注意切片的颜色，因为颜色通常是判断切片厚度更为准确的指标。银色切片的厚度通常约为70 nm，灰色切片较薄，而金色切片则较厚。
  10. 让切片机继续切片，使切片带逐渐延长。
    注意：必须避免室内产生强烈振动或物理干扰。气流可能导致切片在刀槽水面移动，而物理振动可能使切片机切割不均匀。
  11. 当收集到足够数量的切片，且切片带尚未到达舟状槽末端时，停止切片（在样品刚通过刀刃后即停止）。
    注意：所需切片的数量取决于切块表面的大小以及待采集数据集的大小。因此，在切片脱离切块时，了解切块大小与槽位网格之间的关系非常有用。
  12. 用每只手各持一根睫毛，轻柔地将条带分割成更小的片段，使其能够适配槽孔网格的长度，同时注意记录这些片段在样品中的相对位置。
    注意：如果多个带状物的总宽度适合，可将它们轻轻并排放置，并用一个狭缝网格同时拾取。若在同一个狭缝网格上拾取多个带状物，需注意带状物的顺序及其相对位置。例如, 始终将新带状物放置在已有带状物右侧的样本内部图1D).
  13. 可选：使用玻璃涂布棒，将一滴氯仿悬于切片上方，以展平组织。
    注意：氯仿具有毒性且为刺激性物质。切勿使氯仿接触水面或切片。若不慎接触，需移除水分并清洗刀片后方可继续切片。氯仿可能损伤切片，并降解用于将金刚石固定于刀槽中的胶质。
  14. 使用第一把编号的镊子夹起第一个空载网（位于槽右侧，聚乙烯醇缩醛膜面朝下），轻轻浸入 Triton X-100 中，随后在蒸馏水中浸洗两次，再用滤纸擦去镊子边缘多余的水分。
  15. 一手持睫毛，另一手持镊子，轻轻放下约三分之二部分rd 将覆有Formvar膜的载网槽口网格放入刀舟的水中（远离切片），使Formvar膜面朝下，槽口的右侧长边位于水面，并与水边平行。
  16. 轻轻晃动载网，使水流带动切片向带状排列的切片移动，当回程时，切片随之漂向载网。继续以越来越小的幅度晃动，直至切片带的右边缘与槽孔的右边缘对齐。然后，在最后一次晃动时，轻柔地将载网上提，使切片进入槽孔网格中。
  17. 将载网留在镊子上晾干，然后收存于载网盒中，并在载网盒参考表上做好相应标注。
  18. 重复步骤 3.16，直至收集完所有切片带，并确保切片带的顺序保持不变。
  19. 如果需要获取更多切片，将刀具回撤约150 nm，检查载物槽中的水位，必要时添加更多水。然后按照步骤3.11–3.18重新开始切片过程。
  20. 收集完所有切片后，确保刀刃无切片残留物，将刀具从块面收回，并取下刀具进行清洁。

4. 网格染色

  1. 干燥后，将切片置于载玻片上的帕拉菲膜上或培养皿中，用雷诺氏柠檬酸铅染色。在培养皿盖下方放置数粒氢氧化钠颗粒，以提供无二氧化碳的环境。然后，小心避开颗粒，在帕拉菲膜上每网格滴加40 µL雷诺氏柠檬酸铅溶液，每网格一滴。
    注意：不要同时染色过多网格；例如.，最大值不应超过6。尽量避免直接向染色皿呼气，因为二氧化碳会与柠檬酸铅反应，导致载网上产生不必要的沉淀。
  2. 将每张载网（切面朝下）倒置在柠檬酸铅液滴上，置于培养皿盖下避光孵育7至10分钟。在载网染色期间，于实验台面上另取一块较大的石蜡膜，为每张载网准备五个300 µL的蒸馏水液滴。
  3. 柠檬酸铅孵育结束后，将每张载网转移至一滴蒸馏水中，洗涤1分钟，避免直接向载网上呼气。
  4. 重复步骤 4.3，共五次。
  5. 使用编号的交叉镊子夹取第一张载网，将载网边缘接触滤纸以吸去大部分水分，然后让其在镊子中自然干燥（至少20分钟）。每张载网均重复此操作。

5. 透射电子显微镜成像采集

注意：由于透射电子显微镜（TEM）的具体控制设置因制造商而异，应遵循制造商提供的操作说明和指南。以下步骤应由已熟练掌握透射电子显微镜使用者执行。

  1. 成像前执行常规检查，例如光束对中、增益参考及样品正焦位置校准。
  2. 小心将第一张连续切片网格装入样品 holder 中，注意将槽口（从而切片）与显微镜载物台的垂直轴对齐。
    注意：此步骤的精确度并非至关重要，但可节省后续数据采集与处理的时间。插入网格时（切片面朝下或朝上），需注意所有网格均以相同方向成像。
  3. 在低倍率下观察连续切片的顺序、位置与排列（图1E），并导航至网格上的中间切片。
    注意：根据具体研究目的，成像策略可能有所不同；但以下步骤可作为有效的起点。切片的形状以及条带之间的关系（如步骤3.14中拾取时所记录）可判断网格上首个与末个切片的位置。
  4. 浏览样品并确定感兴趣区域。在目标倍率下观察样品，并考虑以略低的倍率进行系列成像，因为切片通常并非完全对齐，后续图像可能需要裁剪。
  5. 在较低倍率下采集参考图像，以了解感兴趣区域的上下文背景、其在不同倍率下相对于切片边界的粗略位置，以及样品内部的标志性结构特征。利用这些图像在其他切片中定位同一感兴趣区域。
  6. 可选：为便于屏幕参照，可在屏幕上使用可重复使用的粘土、贴纸或一片透明投影胶片（OHP纸）并用胶带固定，作为临时标记，以便在整个数据集中重复将感兴趣区域的相同特征居中成像（见图1E中的黄色星标）。
  7. 利用参考图像，导航至网格上第一张切片的感兴趣区域，并在目标倍率下采集图像。
    注意：保存图像时，记录该系列第一张图像的文件名，并采用连续命名方式，使所有图像文件名与连续切片的顺序一致。
  8. 导航至下一张切片，并重复步骤5.7，直至该感兴趣区域的所有切片均完成成像。

6. 图像导出与连续切片对齐配准

  1. 将属于同一图像堆栈的图像文件导出到单个文件夹中。确保该文件夹按文件名排序。
    注意：图像文件最好具有相同的根名称，并按照采集顺序排列。
  2. 打开 Fiji，点击 文件 | 导入 | 图像序列。
  3. 点击文件夹中的第一张图像，然后点击 打开。等待 序列选项 的弹出窗口出现（图 2A）。

TrackEM2 工作流程：图像堆栈导入、切片对齐设置、导出过程；显微镜数据。
图 2：使用 Fiji 创建连续堆栈及连续切片对齐。 （A）加载图像以生成连续堆栈时显示“序列选项”的截图。 （B）TrackEM2 插件及其关键窗口的截图。在“切片间距”界面点击 OK 以继续进行对齐。 （C）成功将连续堆栈加载至可视化面板后的截图。选择对齐堆栈切片后，将弹出三个连续的对齐参数窗口。对齐完成后，导出已对齐的堆栈。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 点击按数字排序名称 | 转换为8位选项，然后按确定。
    注意：转换为8位有助于将数据导入Amira，并减小文件大小，从而在后续步骤中实现更快的处理速度。
  2. 检查所创建图像栈的完整性、顺序和放大倍数。将创建的图像栈保存为.tif文件。
    注意：图像应在相同的放大倍数下采集。
  3. 运行TrakEM2插件41。转到文件 | 新建 | TrakEM2（空白）。
    注意：插件会提示用户保存TrakEM2文件。如有需要，将TrakEM2文件保存至图像文件夹。此时应出现三个窗口：一个项目窗口、一个栈导航（左侧）窗口和一个栈可视化窗格（图2B）。
  4. 在黑色可视化窗格中右键单击，选择导入 | 导入栈，并选择先前创建的图像栈。
  5. 点击确定以将图像栈加载到栈导航窗口中。
    注意：将弹出一个“切片间距”窗口，要求输入像素与尺寸的关系。若仅需进行栈对齐，可直接点击确定跳过此步骤。
  6. 使用滑块检查图像栈中的所有切片。查找已加载的切片，其将在导航平面中显示为一个图块。选择将用于后续对齐的图块。
    注意：被选中的图块将变为蓝色。
  7. 将鼠标悬停在查看窗格上，右键单击图像，选择对齐 | 对齐栈切片（图2C-1）。
  8. 通过三个连续弹出的窗口设置对齐参数。
    注意：对于大多数数据，建议首先采用刚性对齐（允许旋转和平移，但不允许形变），其余参数保持默认设置（图2C-2）。
  9. 运行对齐过程，直至输出日志显示拼接完成。
    注意：运行时间取决于体素数量和计算机速度。
  10. 在查看窗格中检查对齐后的图像栈。按Alt和-键（PC）或Ctrl和-键（Mac）以缩小视图，查看对齐后的图像栈。
  11. 若对对齐结果满意，右键选择导出 | 生成平面图像以保存对齐后的图像栈。
  12. 选择第一张图像作为图像栈的起始，最后一张图像作为结束，点击确定（图2C-3）。将对齐后的图像栈保存为.tif格式。
    注意：为减小文件大小，可将数据裁剪至仅包含必要的感兴趣区域。
  13. 如有需要，可对已对齐的图像栈执行仿射对齐。在Fiji中打开对齐后的图像栈，选择插件 | 配准 | StackReg。
  14. 选择仿射选项，然后点击确定。等待程序运行完成。
  15. 使用不同的文件名保存经过仿射对齐的图像栈。

7. 分割与三维重建

  1. 打开 Amira42。点击 文件 | 打开数据 以加载对齐后的图像序列。
  2. 在新弹出的窗口中指定体素尺寸（图 3A）。

体素分割面板；软件界面示意图，突出显示分割、体素设定及工具。
图3：使用 Amira 对连续图像堆栈进行分割。（A）加载对齐后的图像堆栈前的体素定义弹出窗口。（B）导入图像堆栈后项目界面的截图。选择分割标签页，以在分割编辑器面板中开始对象描记。（C）分割标签页的关键功能。在分割标签页的分割编辑器部分中定义用于分割的对象。使用缩放功能辅助识别对象。选择画笔工具并描记对象的边界。点击选择下方的+符号以分配该描记。已分配的对象将在正交切片视图窗格中显示为红色边界。请点击此处查看此图的放大版本。

注意：在项目界面中将出现一个图像堆栈节点，右侧查看窗格中将显示一个正交切片（图3B）。

  1. 开始分割时，选择分割选项卡（图3B）。
    注意：建议在分割前及分割过程中保存分割进度。选择模型 | 另存为模型，保存为任意合适的.am文件。
  2. 在分割编辑器面板中点击新建，以在材料列表中定义新对象。右键单击以更改对象颜色，双击以重命名对象。
  3. 对于手动分割，请在材料列表下方选择分割工具。选择默认的画笔工具以高亮显示像素（图3C）。
    注意：也可使用画笔工具勾勒对象轮廓，然后按Shift + F填充对象。
  4. 要将画笔工具转换为橡皮擦，在选择像素进行修正时持续按住Ctrl键。对图像堆栈中的每一层切片进行标注。
  5. 确认后，点击+号将选区分配给一个标签。点击-号以移除选区。
  6. 分割完成后，返回项目界面。查找连接到图像堆栈的、带有“.label”扩展名的节点。
  7. 右键单击“.label”扩展名，选择生成表面 | 应用，以创建一个.surf文件。
  8. 要渲染分割对象的三维模型，右键单击.surf文件并选择表面视图，在查看窗格中生成三维模型。
  9. 保存三维模型，用于可视化或进一步的定量分析。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对于该技术，根据生物学研究目的预先选定感兴趣区域，并在包埋组织修块和切片前进行识别。同样，切面的大小可能由具体的研究问题决定；在本例中，样品被修块至留下约 0.3 mm × 0.15 mm 的切面（图 4A）。这使得可获得两个网格，每个网格包含 9 张连续切片，共 18 张连续切片，涵盖约 62 µm3（316 µm × 150 µm × 1.3 µm）体积的肝组织。该体积足以实现肝组织中单个线粒体的完整三维重建。

内质网-线粒体接触分析；电子显微镜；分割示意图；细胞结构研究。
图 4：分割与三...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种可及的vEM技术，用于在三维空间中可视化细胞器结构及其相互作用。本文以肝细胞中细胞器间接触的形态学特征作为案例进行展示。然而，该方法也已应用于研究多种其他样本和研究领域，包括外周神经中施万细胞与内皮细胞的相互作用45、内皮细胞中魏贝尔-帕拉德小体的生物发生46、肾细胞中的物质分泌47，以及海马神经元突触的形态学48。为了更深入地理解肝脏生物学，该方法可用于研究二维肝细胞培养、三维肝类器官模型系统49以及肝脏组织中的肝细胞形态。这一稳健且灵活的方法适用于许多具备常规120 kV透射电子显微镜和超薄切片机的实验室，无需昂贵的样品制备技术。

尽管本方案具有较好的可操作性，但需要注意的是，尚有其他vEM技术可供选择，这些技术可能根据具体的研究问题为研究者提供某些优势；详见 表1 综述

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢Joanna Hanley、Rebecca Fiadeiro和Ania Straatman-Iwanowska提供的专业技术支持。同时感谢Stefan实验室成员以及Ian J. White的有益讨论。J.J.B.由英国医学研究理事会（MRC）对伦敦大学学院（UCL）分子细胞生物学MRC实验室的资助支持，资助编号为MC_U12266B。C.J.S.由英国医学研究理事会（MRC）对伦敦大学学院（UCL）分子细胞生物学MRC大学单位的资助支持，资助编号为MC_UU_00012/6。P.G.由欧洲研究理事会资助，资助编号为ERC-2013-StG-337057。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 注射器滤器Sarstedt83.1826.001
铝制托盘Agar ScientificAGG3912
Amira v6ThermoFisherhttps://www.thermofisher.com
氯仿FisherC/4960/PB08
DDSA/十二烯基琥珀酸酐TAABT027Epon 组分
金刚石刀DiaTOMEultra 45°
DMP-30/2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚TAABD032Epon 组分
Dumont 镊子 N5Agar ScientificAGT5293
Fijihttps://imagej.net/
Fiji TrakEM2 插件https://imagej.net/
36% 甲醛溶液TAABF003
Formvar 包被的载网自制替代品：EMS diasum (FF2010-Cu)
带涂布棒的玻璃瓶Medisca6258
玻璃小瓶Fisher Scientific15364769
25% 戊二醛溶液TAABG011
MNA/甲基纳迪克酸酐TAABM011Epon 组分
2% 四氧化锇溶液TAABO005
铁氰化钾Sigma-AldrichP-8131
环氧丙烷Fisher ScientificE/0050/PB08
可重复使用粘合剂Blue Tack
Reynolds 柠檬酸铅TAABL037切片染色
二甲胂酸钠Sigma-AldrichC-0250用于配制 0.1 M 二甲胂酸盐缓冲液
超级胶水RS Components918-6872氰基丙烯酸酯胶，步骤 1.3
TAAB 812 树脂TAABT023Epon 组分
单宁酸TAABT046
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
双组分环氧树脂RS Components132-605替代品：步骤 2.13
超薄切片机LeicaUC7
振动切片机Leica切片厚度 100 µm，切割速度 0.16 mm/s，振幅 1 mm。
Weldwood 原装接触胶DAP107接触型粘合剂：步骤 3.1.4

参考文献

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