DNA幕是一种高通量单分子成像技术，可提供实时可视化多种蛋白质-DNA相互作用的平台。本实验方案利用DNA幕技术研究Abo1的生物学功能及其分子机制，Abo1是一种来自裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的含溴结构域AAA+ ATP酶。
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摘要
摘要
染色质是一种高级结构，用于包装真核生物的DNA。染色质会根据细胞周期阶段以及对外界环境刺激的响应发生动态变化。这些变化对于维持基因组完整性、表观遗传调控以及DNA的代谢反应（如复制、转录和修复）至关重要。染色质组装是染色质动态变化的关键过程，由组蛋白伴侣蛋白催化完成。尽管已有大量研究，组蛋白伴侣蛋白如何介导染色质组装的机制仍不明确。此外，由组蛋白伴侣蛋白组织形成的核小体的全局特征也尚不清楚。为解决这些问题，本研究介绍了一种独特的单分子成像技术——DNA幕帘（DNA curtain），该技术有助于在分子水平上研究组蛋白伴侣蛋白介导的核小体组装过程。DNA幕帘是一种混合技术，结合了脂质流动性、微流控技术和全内反射荧光显微镜（TIRFM），为实时观察多种蛋白质-DNA相互作用提供了通用平台。利用DNA幕帘技术，本研究探究了Abo1（一种含有溴结构域的粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe AAA+ ATP酶）的组蛋白伴侣功能，并揭示了Abo1介导组蛋白组装的分子机制。DNA幕帘为研究染色质动态提供了独特的方法。
引言
真核生物的DNA被包装成一种称为染色质的高级结构1,2。核小体是染色质的基本单位，由约147 bp的DNA缠绕在八聚体核心组蛋白上构成3,4。染色质在真核细胞中发挥着关键作用；例如，其致密结构可保护DNA免受内源性因素和外源性威胁的损伤5。染色质结构会随着细胞周期阶段和外界刺激而动态变化，这些变化调控了在DNA复制、转录和修复等过程中蛋白质对DNA的可及性6。染色质的动态变化对于基因组稳定性和表观遗传信息的传递也具有重要意义。
染色质受到多种因素的动态调控，包括组蛋白尾部修饰以及染色质结构调控因子，如染色质重塑复合物、多梳蛋白家族（polycomb group proteins）和组蛋白伴侣蛋白7。组蛋白伴侣蛋白通过核心组蛋白的沉积或解离，协调核小体的组装与解离via8,9。组蛋白伴侣蛋白的功能缺陷可导致基因组不稳定，并引发发育障碍和癌症
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方案
1. 流通池的制备
- 按照先前发表的文献报道，制备带有纳米沟槽图案的清洁熔融石英载玻片25.
- 在一块洁净的熔融石英载片上钻两个直径为1 mm的孔图1A) 使用金刚石涂层钻头（参见 材料表).
- 使用直流溅射法在载玻片上沉积250 nm厚的铝（Al）层32 （参见 材料表) 通入10 mTorr的氩气。
- 旋涂一层310 nm厚的4% 950K聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）（参见 材料表在4,000 rpm条件下离心1分钟，并在180 °C的加热板上烘烤3分钟。
- 使用电子束（ebeam）光刻技术在两个孔之间的PMMA层上绘制纳米沟道图案33 在80 kV电压下，电流为0.724 nA。
注意：纳米沟槽图案的结构和尺寸如图所示 图1A. - 通过将载玻片浸泡在显影液（甲基异丁基酮与异丙醇按1:3比例混合，参见 材料表2分钟
- 使用氯气（Cl₂）通过电感....
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结果
本文描述了用于DNA幕实验的流动池制备流程（图 1A）。DNA帘实验促进了对Abo1介导组蛋白H3-H4二聚体在DNA上组装的研究。首先，通过使用YOYO-1（一种嵌入式染料）对DNA分子进行染色，检测DNA帘的形成。结果显示为平行排列的绿色条带，表明YOYO-1已嵌入DNA分子中，且DNA分子在流体动力作用下于扩散屏障处整齐排列并充分拉伸（图 2A). 为排除YOYO-1可能阻碍DNA与组蛋白相互作用的可能性，在加入组蛋白前，使用高盐缓冲液将YOYO-1从DNA上移除。当在无Abo1存在的情况下将Cy5-H3-H4二聚体注入DNA帘时，Cy5-H3-H4未与DNA结合，表明H3-H4二聚体无法自发结合DNA（图2B）。当注入 Cy5-H3-H4 与 Abo1 时，DNA 分子上出现红色荧光点状信号，表明 Abo1 可将 H3-H4 二聚体装载到 DNA 上（图 2C）。暂时关闭缓冲液流动，以确保Cy.......
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讨论
作为一种单分子成像技术，DNA curtain 已被广泛用于研究DNA代谢反应43。DNA curtain 是一种融合了脂质流动性、微流控技术和全内反射荧光显微镜（TIRFM）的杂合系统。与其他单分子技术不同，DNA curtain 能够实现对蛋白质-DNA 相互作用的高通量实时可视化观察。因此，该技术适用于探究分子间相互作用的机制，包括序列特异性结合、蛋白质沿DNA的移动以及蛋白质在DNA上的碰撞17,20,26。此外，DNA curtain 的高通量特性使其能够收集足够多的数据，以确保统计上的可靠性。DNA curtain 有助于研究蛋白质的生物-物理化学性质，包括动力学参数、扩散系数、移动速度和持续性17,26,27
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢韩国科学技术院（KAIST）的Ji-Joon Song教授、Carol Cho博士和Juwon Jang博士在Abo1和Cy5-H3-H4方面提供的大力支持。本研究得到了国家研究基金会资助项目（NRF-2020R1A2B5B01001792）、蔚山科学技术院内部研究基金（1.210115.01）以及基础科学研究所（IBS-R022-D1）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 鲁尔锁式注射器 | 贝克顿-迪金森 | 301321 | |
| 1英寸 × 3英寸熔融石英载玻片 | G. Finkenbeiner | 1 英寸 × 3 英寸矩形，厚度 1 毫米 | |
| 10 mL 鲁尔锁型注射器 | 贝克顿-迪金森 | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-顺式)磷脂酰胆碱（DOPC） | Avanti | 850375 | 这是生物素标记脂质储备液的一个组分 |
| 18:1 生物素化帽状 PE | Avanti | 870273 | 这是生物素标记脂质储备液的一个组分 |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | 这是生物素标记脂质储备液的一个组分 |
| 3 mL 鲁尔锁注射器 | 贝克顿-迪金森 | 302832 | |
| 六通样品进样阀 | IDEX | MX系列II | |
| 950K PMMA | 全电阻 | 671.04 | |
| 丙酮 | SAMCHUN | A1759 | |
| 三磷酸腺苷二钠盐水合物（ATP） | Sigma | A2383 | |
| 铝（Al） | TASCO，韩国 | LT50AI414 | 直径4英寸，厚度1/4英寸 |
| Amicon Ultra 离心滤膜，截留分子量 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| 氨苄青霉素 | Mbcell | MB-A4128 | 抗生素 |
| AZ 300 MIF 显影液 | 默克 | 10454110521 | 用于去除铝 |
| 刀片 | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| 三氯化硼（BCl₃）3) | UNIONGAS | 纯度： >99.99% | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A7030 | |
| 过氧化氢酶 | Sigma | C40-1g | 这是100倍浓缩gloxy储存液的组分之一 |
| 氯（Cl2) | UNIONGAS | 纯度： >99.99% | |
| 透明双面胶带 | 3M | 313770 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G7528 | |
| 直流溅射 | 索罗纳 | SRM-120 | 用于在载玻片上沉积铝膜 |
| 金刚石涂层钻头 | Eurotool | DIB-211.00 | 用于在熔融石英载玻片上打孔 |
| DL-二硫苏糖醇（DTT） | Sigma | D0632 | |
| 道威棱镜 | 韩国电光有限公司 | 1906-106 | 定制熔融石英道威棱镜，带抗反射涂层 |
| 钻孔 | Dremel | Dremel 3000 | 用于在熔融石英载玻片上打孔 |
| 电子束光刻 | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma | EDS-1KG | |
| 指旋接头 | IDEX | F-300 | 它与 "PFA 管道，天然色" 形成鲁尔锁式管路 |
| 无凸缘螺母 | IDEX | P-235 | 它与 "PFA 管道，本色" 形成鲁尔锁式管路 |
| 冷冻干燥机，HyperCOOL | Labogene | HC3110 | 用于液体蛋白的冻干 |
| 葡萄糖氧化酶 | Sigma | G2133-50KU | 这是100倍浓缩gloxy储存液的组分 |
| 盐酸胍 | Acros Organics | 364790025 | |
| 汉密尔顿注射器 | Hamilton公司 | 80065 | 该注射器用于样品进样 |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | 用于FPLC（尺寸排阻） |
| 加热板搅拌器 | 康宁 | PC-420D | |
| 盐酸 | Sigma | H1759 | 用于 Tris-HCl |
| 折射率匹配油 | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| 电感耦合等离子体反应离子刻蚀 | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| 异丙基 β异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG） | 格伦特汉生命科学 | GC6586-100g | 用于诱导 ββ-半乳糖苷酶活性 |
| λ噬菌体DNA | NEB | N0311 | |
| LB肉汤 | BD Difco | 244610 | 大肠杆菌细胞生长培养基 |
| 鲁尔接头 10-32 | IDEX | P-659 | 连接鲁尔锁式注射器与管路 |
| 六水合氯化镁 | fisher bioreagents | BP214 | |
| 甲基异丁基酮（MIBK） | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | 用于配制溶液 | |
| 显微镜（Eclipse Ti2） | 尼康 | Eclipse Ti2 | 倒置荧光显微镜 |
| 显微镜玻璃盖玻片 | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm（1号） |
| 显微镜载玻片 | DURAN GROUP | DU.2355013 | 载玻片磨砂边 45°，普通 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| 物镜 | 尼康 | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | 浸油类型：水，放大倍数：60倍，校正：18，工作距离：0.29（0.31-0.28） |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS 化学感受态 E. coli | 赛默飞世尔科技 | C6060-03 | 用于过表达蛋白的感受态细胞 |
| 氧气（O₂）2) | NOBLEGAS，韩国 | 纯度： >99.99% | |
| PFA 管道，天然色 | IDEX | 1512L | 它与 "指旋接头" 形成鲁尔锁式管路 |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | 罗氏 | 11359061001 | 蛋白酶抑制剂 |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | 用于FPLC（尺寸排阻） |
| 关闭阀 | IDEX | P-732 | |
| 乙酸钠 | Sigma | 791741 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma | S3014 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por 分子多孔膜管，截留分子量 6-8 kDa | Spectrum 实验室 | 132660 | |
| 链霉亲和素 | 赛默飞世尔科技 | S888 | |
| 四氟化硫（SF4) | 中国台湾 | 纯度： >99.99% | |
| 注射泵 | KD Scientific | 78-8210 | |
| 四氟化碳（CF₄）4) | 中国台湾 | 纯度： >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma 碱 | Sigma | T1503 | 用于 Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | 用于FPLC（离子交换） |
| 联合体组装 | IDEX | P-760 | 连接管路 |
| 尿素 | Sigma | U5378 | |
| 真空烘箱 | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | 赛默飞世尔科技 | Y3601 | 该嵌入染料用DMSO稀释 |
| β-巯基乙醇（BME） | Sigma | M6250 |
参考文献
- Woodcock, C. L., Ghosh, R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (5), 000596(2010).
- Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure.<....
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