Method Article

DNA帘法破译组蛋白组装的分子机制

DOI:

10.3791/63501

⸱

March 9th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology, 2Center for Genomic Integrity, Institute for Basic Science (IBS)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA curtain 是一种高通量单分子成像技术，为实时可视化各种蛋白质-DNA 相互作用提供了一个平台。本方案利用DNA帘技术研究了含有裂 殖酵 母的溴结构域AAA+ ATP酶Abo1的生物学作用和分子机制。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

染色质是包装真核 DNA 的高级结构。染色质根据细胞周期阶段和响应环境刺激而发生动态变化。这些变化对于基因组完整性、表观遗传调控和 DNA 代谢反应（如复制、转录和修复）至关重要。染色质组装对染色质动力学至关重要，并由组蛋白伴侣催化。尽管进行了广泛的研究，但组蛋白伴侣使染色质组装的机制仍然难以捉摸。此外，对组蛋白伴侣组织的核小体的全局特征知之甚少。为了解决这些问题，本文描述了一种独特的单分子成像技术，称为DNA帘，该技术有助于研究组蛋白伴侣对核小体组装的分子细节。DNA 幕是一种混合技术，它结合了脂质流动性、微流体和全内反射荧光显微镜 （TIRFM），为各种蛋白质-DNA 相互作用的实时成像提供了一个通用平台。利用DNA帷幕，研究了含有AAA+ ATP酶的 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe bromodomain containing AAA+ ATPase）Abo1的组蛋白伴侣功能，并揭示了Abo1组蛋白组装的分子机制。DNA帷幕为研究染色质动力学提供了一种独特的方法。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真核 DNA 被包装成称为染色质 1,2 的高级结构。核小体是染色质的基本单位，染色质由大约 147 bp 的 DNA 包裹在八聚体核心组蛋白周围 3,4 组成。染色质在真核细胞中起着关键作用;例如，紧凑的结构可保护 DNA 免受内源性因素和外源性威胁的影响 5。染色质结构根据细胞周期阶段和环境刺激而动态变化，这些变化控制 DNA 交易（如复制、转录和修复）过程中的蛋白质获取6。染色质动力学对于基因组稳定性和表观遗传信息也很重要。

染色质受多种因素的动态调控，包括组蛋白尾部修饰和染色质组织者，如染色质重塑因子、多梳基团蛋白和组蛋白伴侣7。组蛋白伴侣通过核心组蛋白的沉积或分离来协调核小体的组装和拆卸 8,9。组蛋白伴侣的缺陷诱导基因组不稳定并导致发育障碍和癌症 9,10

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 流通池的制备

  1. 按照先前发布的报告25准备一个清洁的熔融石英载玻片，其中包含纳米沟槽图案。
    1. 使用金刚石涂层钻头在清洁的熔融石英载玻片（图 1A）中钻两个直径为 1 mm 的孔（参见 材料表）。
    2. 使用直流溅射32 （参见 材料表）和 10 mTorr 氩气在载玻片上沉积 250 nm 厚铝 （Al）。
    3. 在4,000rpm下旋涂310nm厚的4%950K聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA）（参见 材料表）1分钟，然后在180°C的热板上烘烤3分钟。
    4. 使用电子束（ebeam）光刻33 在两个孔之间的PMMA层上绘制纳米沟槽图案，在80 kV时电流为0.724 nA。
      注:纳米沟槽图案的结构和尺寸如 图1A所示。
    5. 通过将载玻片浸泡在显影溶液（甲基异丁基酮和异丙醇的1:3比例，参见 材料表）中2分钟，除去暴露的电子束PMMA。
    6. 使用氯 （Cl2）....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作描述了用于DNA幕式测定的流通池制备程序（图1A）。DNA Curtain 测定有助于 Abo1 在 DNA 上研究组蛋白 H3-H4 二聚体组装。首先，通过用嵌入染料YOYO-1染色DNA分子来检查DNA窗帘的形成。绿线以平行阵列显示，表明 YOYO-1 插入到 DNA 分子中，这些分子在流体动力流下在扩散屏障处排列均匀和拉伸（图 2A）。为了排除 YOYO-1 阻碍 DNA 和组蛋白相互作用的可能性，在添加组蛋白之前，用高盐缓冲液从 DNA 中去除 YOYO-1。在没有 Abo1 的情况下将 Cy5-H3-H4 二聚体注射到 DNA 幕中时，Cy5-H3-H4 不与 DNA 结合，表明 H3-H4 二聚体与 DNA 缺乏自发结合（图 2B）。当 Cy5-H3-H4 注射 Abo1 时，DNA 分子上出现红色荧光点，表明 Abo1 将 H3-H4 二聚体加载到 DNA 上（图 2C）。缓冲液流.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作为一种单分子成像技术，DNA帘已被广泛用于探测DNA代谢反应43。DNA 帷幕是一种混合系统，将脂质流动性、微流控和 TIRFM 连接起来。与其他单分子技术不同，DNA curtain 能够实现蛋白质-DNA 相互作用的高通量实时可视化。因此，DNA帘技术适用于探究分子相互作用背后的机制，包括序列特异性关联、蛋白质与DNA一起运动以及DNA上的蛋白质-蛋白质碰撞17,20,26。此外，DNA幕的高通量特性能够收集足够的数据，以确保统计可靠性。DNA帷幕有助于研究蛋白质的生物物理化学性质，包括动力学参数、扩散系数、速度和合成能力17,26,27,30。.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢韩国科学技术院的Ji-Joon Song教授、Carol Cho博士和Juwon Jang博士对Abo1和Cy5-H3-H4的大力支持。这项工作得到了国家研究基金会资助（NRF-2020R1A2B5B01001792），蔚山国立科学技术研究所校内研究基金（1.210115.01）和基础科学研究所（IBS-R022-D1）的支持。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL 鲁尔锁注射器BecktonDickinson301321
1' x 3' 熔融硅滑玻片G. Finkenbeiner1 英寸 x 3 英寸矩形和 1 mm 厚度
10 mL 鲁尔锁注射器BecktonDickinson302149
18：1 （Δ9-顺式） PC （DOPC）Avanti850375这是生物素化脂质原液
18：1 生物素帽 PEAvanti870273这是生物素化脂质原液
18：1 PEG2000 PEAvanti880130的一种成分 这是生物素化脂质原液的一种成分
3 mL 鲁尔锁注射器BecktonDickinson302832
6 通样品进样阀IDEXMX 系列 II
950K PMMA全抗蚀671.04
丙酮SAMCHUNA1759
腺苷 5'-三磷酸二钠盐水合物 （ATP）SigmaA2383
铝（Al）TASCO，韩国LT50AI414直径 4 英寸，厚度 1/4 英寸
Amicon Ultra 离心过滤器，MWCO 10 kDaMilliporeZ648027
氨苄青霉素Mbcell MB-A4128抗生素
AZ 300 MIF 显影剂Merck10454110521用于去除铝
刀片DORCODN5212 mm x 6 m
三氯化硼 （BCl3）UNIONGAS纯度：>99.99%
牛血清白蛋白 （BSA）SigmaA7030
过氧化氢酶SigmaC40-1g这是 100x gloxy 库存
氯 （Cl2）UNIONGAS纯度：>99.99%
透明双面胶带3M313770
D-（+）-葡萄糖SigmaG7528
直流溅射SoronaSRM-120用于在滑轨上沉积铝
刚石涂层钻头EurotoolDIB-211.00用于在熔融二氧化硅滑轨上打孔
DL-二硫苏糖醇 （DTT）SigmaD0632
Dove-prismKorea Electro-Optics Co. Ltd.1906-106定制的带减反射涂层的熔融石英鸽子棱镜
钻头DremelDremel 3000用于在熔融石英载玻片上打孔
Electron Bean LithographyNanobeam Ltd.NB3
乙二胺四乙酸 （EDTA）SigmaEDS-1KG
手拧接头IDEXF-300与"PFA Tubing Natural"连接形成鲁尔锁管
无法兰外螺纹IDEXP-235与"PFA Tubing Natural"连接，形成鲁尔锁管
冷冻干燥机，HyperCOOLLabogeneHC3110用于冻干液体蛋白质
葡萄糖氧化酶SigmaG2133-50KU这是 100x gloxy stock
盐酸胍Acros Organics364790025
汉密尔顿注射器Hamilton Company80065该注射器用于样品注射
Hellmanex IIISigmaZ805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pgCytiva28-9893-36用于 FPLC（尺寸排阻）
热板搅拌器康宁PC-420D
盐酸SigmaH1759用于 Tris-HCl
指数匹配油蔡司444970-9000-000
电感耦合等离子体反应离子刻蚀Top Technology Ltd.FabStar
异丙基 &β;-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG）Glentham Life SciencesGC6586-100g用于诱导 &β;-半乳糖苷酶活性
Lambda 噬菌体 DNANEBN0311
LB 肉汤BD difco244610肠杆菌细胞生长培养基
鲁尔接头 10-32IDEXP-659连接鲁尔锁注射器和管道
氯化镁六水合物 Fisher 生物试剂BP214
甲基异丁基酮 （MIBK）化药 先进材料用于显影液
显微镜 （Eclipse Ti2）尼康Eclipse Ti2倒置荧光显微镜
显微镜玻璃盖玻片MARIENFELD10114222 x 50 mm（1 号）
显微镜载玻片DURAN GROUPDU.2355013载玻片 玻璃研磨边缘 45 度;，普通 26 x 76 毫米
纳米端口IDEXN-333-01
物镜尼康CFI Plan Apochromat VC 60XC WI浸入类型：水，放大倍数：60 倍，校正：18，工作距离：0.29 （0.31-0.28）
单次 BL21 （DE3）pLysS 化学感受态大肠杆菌Thermo Fisher ScientificC6060-03过表达蛋白质的感受态细胞
氧 （O2）NOBLEGAS，韩国纯度：>99.99%
PFA 管 天然IDEX1512L它与"手拧接头"连接，形成鲁尔锁管
苯甲基磺酰氟 （PMSF）罗氏11359061001蛋白酶抑制剂
Sephacryl S-200 高分辨率Cytiva17-0584-01用于 FPLC（尺寸排阻）
截止阀IDEXP-732
乙酸钠Sigma791741
氯化钠 （NaCl）SigmaS3014
氢氧化钠 （NaOH）Sigmas5881
光谱/Por 分子多孔膜管，MWCO 6-8kDaSpectrum laboratories132660
链霉亲和素Thermo Fisher ScientificS888
四氟化硫 （SF4）NOBLEGAS，韩国纯度：>99.99%
注射泵Scientific78-8210
四氟甲烷 （CF4）NOBLEGAS，韩国纯度： >99.99%
TritonX-100SigmaT9284
Trizma 基地SigmaT1503用于 Tris-HCl
TSKgel SP-5PWTOSOH14715用于 FPLC（离子交换）
联合组件IDEXP-760这连接了管道
尿素SigmaU5378
真空炉Jeio TechOV-11
YOYO-1Thermo Fisher ScientificY3601这种插层染料在 DMSO
&β;-巯基乙醇 （BME）SigmaM6250
剂 的成分金 大KD 中稀释

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Woodcock, C. L., Ghosh, R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (5), 000596(2010).
  2. Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA CurtainHistone AssemblyChromatin DynamicsSingle Molecule ImagingHistone ChaperonesNucleosome AssemblyMicrofluidic ChamberTotal Internal Reflection MicroscopyATP HydrolysisProtein DNA Interaction

Related Articles