狼疮易感型MRL/lpr小鼠蛋白尿、肾脏白细胞浸润及肾脏蛋白沉积的分析

摘要

本实验方案描述了一种在小鼠中追踪狼疮进展的方法。另外提供了两种实验程序，用于通过肾脏中的细胞浸润和蛋白质沉积来表征狼疮性肾炎。

摘要

系统性红斑狼疮（SLE）是一种自身免疫性疾病，目前尚无已知治愈方法，其特征是包括肾脏在内的多个器官出现持续性炎症。在此情况下，肾脏失去清除血液废物以及调节盐和液体浓度的能力，最终导致肾功能衰竭。女性患病率显著高于男性，尤其是育龄期女性，其发病率是男性的九倍。肾脏疾病是SLE患者死亡的首要原因。本实验方案介绍了一种快速、简便的方法，用于检测收集尿液中的排泄蛋白水平，以追踪狼疮随时间的进展。此外，还提供了一种基于细胞大小和密度选择的方法，用于分离肾脏单个核细胞，以研究白细胞在肾脏中的浸润情况。同时，建立了一种免疫组织化学方法，用于表征肾小球中的蛋白沉积以及肾小管间质区域的白细胞浸润。综合这些方法，有助于研究易患狼疮的MRL/lpr小鼠肾脏中慢性炎症的进展过程。

引言

肾脏的主要功能是通过尿液排出有毒物质，同时维持水和盐的稳态¹。系统性红斑狼疮（SLE）患者会出现这一功能受损，导致所谓的狼疮性肾炎（LN）。LN是免疫系统攻击肾脏的结果，引起持续性的肾脏炎症，从而丧失清除血液废物以及调节盐和液体浓度的能力。这最终将导致肾功能衰竭，可能危及生命。在肾炎过程中，循环中的B细胞、T细胞和单核细胞被募集至肾脏，分泌趋化因子、细胞因子以及可形成免疫复合物的自身抗体。这最终导致内皮细胞损伤、膜性损伤、肾小管萎缩和纤维化²。

MRL/Mp-Fas^lpr（MRL/lpr）狼疮易感小鼠是一种经典的动物模型，可表现出类似人类系统性红斑狼疮（SLE）的临床症状³。该模型在揭示SLE患者主要死亡原因之一——狼疮性肾炎（LN）的发病机制方面发挥了重要作用⁴。在人类和小鼠的SLE中，LN的特征是由于免疫复合物在肾脏沉积引发逐渐加重的炎症反应，继而激活补体系统，募集炎性细胞，并导致肾功能丧失⁵。免疫复合物的沉积是诱发肾脏固有细胞产生趋化因子和细胞因子的第一步，这些因子通过招募免疫细胞进一步扩大炎症反应⁶。本实验方案介绍了多种用于监测肾病进展的技术，可....

方案

本方案已获得弗吉尼亚理工学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。由于狼疮疾病在雌性个体中发病率较高，因此仅使用雌性MRL/lpr小鼠。样本采集从4周龄开始，至15周龄结束。小鼠来源于商业渠道（见材料表），并根据机构指南在特定病原体-free环境中饲养和维持。

1. 蛋白尿检测

1. 按照以下步骤收集尿液。
   1. 使用70%乙醇喷洒超净台进行消毒，并在台面放置无菌塑料垫。准备移液器吸头、1.5 mL离心管和移液器，用于收集约20 μL液体。
      注意：吸头和离心管必须无菌，且未经任何预处理。
   2. 取出小鼠笼盒，在放入超净台前用70%乙醇喷洒消毒。
   3. 用一只手固定小鼠，另一只手从上至下轻轻按摩其腹部区域。
   4. 使用1.5 mL离心管或移液器直接收集尿液；若尿液滴落在塑料垫上，则从垫上收集。每份样本均需使用新的手套、塑料垫和吸头。
      注意：若上述方法无效，可使用无菌烧杯将小鼠隔离，待其排尿后从烧杯中收集尿液。
   5. 将小鼠放回笼盒。取出下一只小鼠，重复步骤1.1.3–1.1.4。
      注意：每次收集完一只小鼠的样本后，必须用70%乙醇清洁塑料垫和烧杯。每组至少需要五只小鼠，以确保统计学意义。尿液样本可在–80 °C保存，最长可保存12个月。

结果

本方案采用多种方法评估MRL/lpr小鼠的狼疮性肾炎。首先，描述了一种用于研究随时间推移因肾功能障碍导致蛋白尿水平升高的方法。如图1所示，雌性小鼠以每日灌胃200 µL磷酸盐缓冲液（1× PBS）作为对照组，以浓度为10⁹ cfu/mL的益生菌Lactobacillus reuteri作为处理组，每周给药两次。处理从3周龄开始，至15周龄结束。与对照组相比，接受L. reuteri处理的小鼠组蛋白尿进展更为迅速。

图 1<.......

讨论

狼疮性肾炎（LN）是系统性红斑狼疮（SLE）患者死亡的主要原因，而加重该疾病的因素仍不明确。本方案的应用旨在通过多种方法表征肾功能，包括蛋白尿检测、分离肾脏白细胞的流式细胞术分析以及冷冻肾脏组织切片的免疫荧光染色。

收集尿液时需要考虑的一个重要问题是，必须在一天中的相同时间和相同的地点进行收集。小鼠是夜行性动物，因此最准确的样本应在小鼠开始活跃之前的傍晚采集。选择这一时间的另一个原因是，MRL/lpr 小鼠通常在夜间大量饮水，导致尿液被稀释。因此，在不恰当的时间采集样本可能会增加尿液浓度和/或体积的变异性。此外，尽可能多地收集尿液对于获得准确的结果也非常重要。

Bradford 法可为我们提供样品中蛋白质含量的估算结果。该方法并非针对任何系统性红斑狼疮（SLE）标志蛋白，但足以反映疾病进展情况²⁶。此外，与其他方法相比，该方法成本较低。值得注意的是，Bradford 法对时间较为敏感，因此必须在半小时内完成。若等待时间过长，样品结果往往会出现数值升高或假阳性。与市售尿液分析试纸条.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10倍浓度Tris缓冲盐溶液（TBS）	赛默飞世尔科技	J60764.K2
2-巯基乙醇	赛默飞世尔科技	21985-023
抗人/小鼠 C3	Cedarlane	CL7632F
抗小鼠 CD138 BV711	Biolegend	142519
抗小鼠 CD45 AF700	Biolegend	103127
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9418-100G
胶原酶D	Sigma-Aldrich	11088882001
共聚焦显微镜 LSM 880	Zeiss	LSM 880
考普林瓶	Fisher Scientific	50-212-281
冷冻模具	Fisher Scientific	NC9511236
密度梯度介质	GE Healthcare	17-1440-02	Percoll
DEPC 处理水	赛默飞世尔科技	AM9906
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527
dsDNA-EC	InvivoGen	tlrl-ecdna
乙二胺四乙酸	Fisher Scientific	S311-500	EDTA
EVOS M5000 显微成像系统	赛默飞世尔科技	AMF5000
FACS 融合细胞分选仪	BD 生物科学	FACS 融合
胎牛血清 - 优质，经热灭活	R&研发系统	S11150H
Fisherbrand 96孔聚苯乙烯板	Fisher Scientific	12-565-501
GraphPad Prism	GraphPad	N/A
汉克’s 平衡盐溶液	赛默飞世尔科技	14175-079
HEPES	赛默飞世尔科技	15630-080
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	N/A
罗伊氏乳杆菌 Kandler 等	ATCC	23272
MEM非必需氨基酸	赛默飞世尔科技	11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J 小鼠（MRL/lpr）	杰克逊实验室	485
指甲油	N/A	N/A	任何常规商店
O.C.T. 化合物	Tisse-Tek	4583
PAP笔	Sigma-Aldrich	Z377821
Peel-A-Way 一次性包埋模具	Polysciences	R-30
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15140-122
磷酸盐缓冲液（PBS）	赛默飞世尔科技	70011069
Pierce 20x TBS 缓冲液	赛默飞世尔科技	28358
Pierce Coomassie Plus（Bradford）检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23236	包含白蛋白标准品
ProLon Gold 抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher	P36934
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32	BD 生物科学	553141	FcR封闭
RPMI 1640	赛默飞世尔科技	11875-093
丙酮酸钠	赛默飞世尔科技	11360-070
SpectraMax M5	Molecular Devices	N/A	SoftMax Pro 6.1 软件
无菌细胞滤网 100 µM	Fisher Scientific	22363549
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
盐酸万古霉素	Goldbio	V-200-1
Zombie Aqua	Biolegend	423102	用于流式细胞术分析的荧光染料