分析易患狼疮的MRL/lpr小鼠的蛋白尿、白细胞肾浸润和蛋白质的肾脏沉积

Summary

本方案描述了一种跟踪小鼠狼疮进展的方法。提出了另外两种程序来表征基于细胞浸润和肾脏中蛋白质沉积的狼疮性肾炎。

Abstract

系统性红斑狼疮（SLE）是一种自身免疫性疾病，没有已知的治愈方法，其特征是许多器官（包括肾脏）的持续炎症。在这种情况下，肾脏失去了清除血液中的废物并调节盐和液体浓度的能力，最终导致肾功能衰竭。女性，特别是育龄妇女，被诊断出的频率是男性的九倍。肾脏疾病是系统性红斑狼疮患者死亡的主要原因。本方案描述了一种快速简单的方法来测量收集的尿液中排泄的蛋白质水平，跟踪狼疮随时间的进展。此外，根据大小和密度选择，提供了一种分离肾脏单核细胞的方法，以研究白细胞的肾脏浸润。此外，已经开发了一种免疫组织化学方法来表征肾小球中的蛋白质沉积和肾小管间质空间中的白细胞浸润。总之，这些方法可以帮助研究与易患狼疮的MRL / lpr小鼠的肾脏相关的慢性炎症的进展。

Introduction

肾脏的主要功能是通过尿液消除有毒物质，同时保持水和盐的稳态¹。该功能在系统性红斑狼疮（SLE）患者中受到威胁，导致所谓的狼疮性肾炎（LN）。LN是免疫系统攻击肾脏的结果，导致持续的肾脏炎症，因此失去了清除血液中废物和调节盐和液体浓度的能力。这最终将导致肾功能衰竭，这可能是致命的。在肾炎过程中，循环的B细胞，T细胞和单核细胞被招募到肾脏，分泌趋化因子，细胞因子和免疫复合物形成自身抗体。这最终导致内皮细胞损伤，膜损伤，肾小管萎缩和纤维化²。

容易出现狼疮的小鼠是一种经典的小鼠模型，表现出类似于人类SLE³的狼疮样临床体征。该模型有助于了解SLE患者死亡的主要原因之一，狼疮性肾炎（LN）⁴。在人和小鼠SLE中，LN的特征在于由肾沉积的免疫复合物引发的逐渐炎症，随后是补体激活，炎症细胞募集和肾功能丧失⁵。免疫复合物沉积是内在肾细胞诱导趋化因子和细胞因子产生的第一步，其通过招募免疫细胞⁶来扩展炎症反应。目前的方案提出了几种跟踪肾脏疾病进展的技术，分析细胞浸润和免疫复合物沉积。

每周收集的尿液可以检测和可视化狼....

Protocol

本议定书由弗吉尼亚理工大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。由于狼疮病在女性中的发病率较高，因此仅使用雌性MRL / lpr小鼠。样本采集从4周龄开始，15周结束。小鼠是从商业来源获得的（参见 材料表），并按照机构指南在特定的无病原体环境中繁殖和维护。

1. 蛋白尿试验

1. 按照以下步骤收集尿液。
   1. 通过喷洒70%乙醇对罩进行灭菌。在表面上放置无菌塑料片。准备吸头，1.5 mL管和移液器以收集约20μL液体。
      注意:吸头和试管必须是无菌的，没有任何预处理。
   2. 取笼子并喷洒70%乙醇，然后将其放入罩内。
   3. 用一只手握住鼠标，用另一只手从上到下轻轻按摩腹侧区域。
   4. 使用1.5 mL管或移液管直接收集尿液，或者如果样品滴落，则从塑料片中收集尿液。对每个样品使用干净的手套、床单和吸头。
      注意:如果这不起作用，请使用无菌烧杯隔离小鼠，然后在小鼠小便后从烧杯中收集尿液。
   5. 将鼠标放回笼子里。取出另一个鼠标并重复步骤 1.1.3-1.1.4。
      注意:收集每只小鼠的样品后，始终用70%乙醇清洁塑料片和烧杯。每组至少需要五只小鼠才能具有统计学意义。尿液样品可以在-80°C下储存，直到使用长达12个月。
2. 通过布拉德福德方法量化蛋白质

Results

该方案使用多种方法来评估狼疮性肾炎的MRL / lpr小鼠。首先，描述了一种程序来研究由于肾功能障碍而引起的蛋白尿水平随时间增加。如图 1所示，雌性小鼠以口服强饲法200μL磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）作为对照组，益生菌 罗伊氏乳杆菌 作为治疗组，浓度为10⁹ cfu / mL，每周两次。治疗从3周龄开始，到15周龄结束。用 罗伊氏乳杆菌 治疗的小鼠组比对照组具有更积极的蛋白尿进展。

图1:随着时间的推移检测MRL / lpr小鼠尿液中的蛋白质水平。 使用简单的线性回归检验执行统计。*P < 0.05，**P.......

Discussion

LN是SLE患者死亡的主要原因，加重该病的因素尚不清楚。该方案的应用是使用多种方法表征肾功能，包括蛋白尿的测量，分离的肾白细胞的FACS分析以及冷冻肾切片的免疫荧光染色。

收集尿液时要考虑的一个要点是，必须与一天中的时间和尿液收集的位置一致。小鼠是夜间活动的动物，因此在小鼠开始活跃之前的下午晚些时候收集最准确的样本。选择这个时间的另一个原因是MRL / lpr小鼠倾向于在晚上喝大量的水，导致尿液稀释。因此，在错误的时间收集可能会增加尿液的浓度和/或体积变异性。收集尽可能多的尿液以获得准确的结果也很重要。

布拉德福德测定法可以让我们估计出有多少蛋白质存在。它对任何SLE标志物蛋白都不具有特异性，但足以给出疾病进展的想法²⁶。此外，与其他方法相比，这种方法具有成本效益。值得注意的是，布拉德福德测定对时间敏感。因此，必须在半小时内完成。如果等待时间过长，样本往往会具有增加的值或较高的错误结果。与用于尿液分析的商用试剂条相比，另一个好处是它提供了准确的数字，而不是尿液样本内的范围。评分条.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Tris 缓冲盐水 （TBS）	Thermo Fisher Scientific	J60764。K2
2-巯基乙醇	Thermo Fisher Scientific	21985-023
抗人/小鼠 C3	Cedar烷	CL7632F
抗小鼠CD138 BV711	Biolegend	142519
抗小鼠CD45 AF700	Biolegend	103127
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9418-100G
胶原酶 D	Sigma-Aldrich	11088882001
共聚焦显微镜 LSM 880	蔡司	LSM 880
Coplin 染色缸	Fisher Scientific	50-212-281
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
密度梯度培养基	GE Healthcare	17-1440-02	Percoll
DEPC 处理水	ThermoFisher Scientific	AM9906
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527
dsDNA-EC	InvivoGen	tlrl-ecdna
乙二胺四乙酸	Fisher Scientific	S311-500	EDTA
EVOS M5000 显微镜成像系统	Thermo Fisher Scientific	AMF5000
FACS 融合细胞分选仪	BD Biosciences	FACS Fusion
胎牛血清 - 优质，热灭活	R&D 系统	S11150H
Fisherbrand 96 孔聚苯乙烯板	Fisher Scientific	12-565-501
Graphpad 棱镜	GraphPad	N/A
Hank's 平衡盐溶液：	Thermo Fisher Scientific	14175-079
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
ImageJ 软件	：美国国立卫生研究院	N/A
罗伊氏乳杆菌 Kandler 等人。	ATCC	23272
MEM 非必需氨基酸	Thermo Fisher Scientific	11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J 小鼠 （MRL/lpr）	Jackson Lab	485
指甲油	N/A	N/	A 任何常规商店
OCT 化合物	Tisse-Tek	4583
PAP 笔	Sigma-Aldrich	Z377821
Peel-A-Way 一次性包埋模具	Polysciences	R-30
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140-122
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Thermo Fisher Scientific	70011069
Pierce 20x TBS 缓冲液	Thermo Fisher Scientific	28358
Pierce 考马斯 Plus （Bradford） 检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23236	白蛋白标准品包括
ProLon Gold 抗淬灭封片剂	ThermoFisher	P36934
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32	BD Biosciences	553141	FcR 封闭剂
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
丙酮酸钠	Fisher Scientific	11360-070
SpectraMax M5	分子设备	N/A	SoftMax Pro 6.1 软件
无菌细胞过滤器 100 µM	Fisher Scientific	22363549
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
盐酸万古霉素	Goldbio	V-200-1
Zombie Aqua	Biolegend	423102	用于流式细胞术分析的荧光染料