活体斑马鱼幼鱼眼球摘除以研究视觉系统发育和生长对神经支配的依赖性

摘要

本文介绍了如何通过手术从活体斑马鱼幼体中摘除眼球，作为研究视网膜输入如何影响视顶盖生长与发育的第一步。此外，本文还提供了幼体麻醉、固定和脑组织解剖的方法，并进一步介绍了免疫组织化学染色和共聚焦成像技术。

摘要

斑马鱼具有显著的终生生长能力和再生能力。例如，在胚胎发生期间建立的特化干细胞微环境可支持整个视觉系统（包括眼睛和脑）的持续生长。视网膜与视顶盖之间的协调生长确保了在眼睛和脑中新增神经元时，视网膜拓扑投射图的精确建立。为了研究视网膜轴突是否为调控顶盖干细胞和前体细胞的行为（如存活、增殖和/或分化）提供关键信息，有必要能够在同一只动物以及不同动物之间比较有神经支配和无神经支配的顶盖叶。

通过手术摘除活体斑马鱼幼鱼的一只眼睛，随后观察其视顶盖，可实现这一目标。配套视频演示了如何麻醉幼鱼、用电解法 sharpen 钨针，并使用这些钨针摘除一只眼睛。接着展示了如何从固定后的斑马鱼幼鱼中解剖出脑组织。最后，视频概述了免疫组织化学实验方案，并演示了如何将染色后的胚胎包埋于低熔点琼脂糖中，以用于显微镜观察。

引言

本方法旨在研究视网膜输入如何影响斑马鱼脑中视觉处理中枢——视顶盖的生长与发育。通过摘除一只眼睛，随后比较视顶盖的两侧结构，可在同一标本内观察并归一化视顶盖的变化，从而实现多个标本间的有效比较。将现代分子生物学方法与该技术相结合，将有助于揭示视觉系统生长与发育的机制，以及轴突退变与再生的内在机理。

感觉系统——视觉、听觉和躯体感觉——从外部器官收集信息，并将这些信息传递至中枢神经系统，从而在中脑形成对外部世界的“图谱”^1,2。对于包括许多鱼类在内的几乎所有脊椎动物而言，视觉是占主导地位的感觉模式。视网膜是眼球中的神经组织，通过主要由感光细胞、双极细胞和视网膜神经节细胞（RGCs）构成的神经回路来获取信息，其中RGCs是视网膜的投射神经元。RGCs具有长长的轴突，这些轴突沿视网膜内表面延伸至视神经乳头，在此处聚集成束并共同穿过大脑，最终终止于中脑背侧的视觉处理中枢。这一结构在鱼类和其他非哺乳类脊椎动物中称为视顶盖，与哺乳动物的上丘同源³。

视顶盖是位于背侧中脑的双侧对称多层结构。在斑马鱼和大多数其他鱼类中，视顶盖的每个半球仅接收来自对侧眼睛的视觉输入，因此左视神经终止于右侧视顶盖半球，而右视神经终止于左侧视顶盖半球⁴

方案

本研究中的方法均依照里德学院和伦敦大学学院机构动物护理与使用委员会的指南和批准进行。有关本研究中使用的斑马鱼品系的详细信息，请参见材料表。

1. 准备材料和工具

1. 配制溶液。
   1. 通过稀释60倍浓缩储备液（300 mM NaCl、10.2 mM KCl、20 mM CaCl₂-二水合物、20 mM MgCl₂-六水合物，溶于去离子水中，经高压灭菌后室温保存）来制备胚胎培养基（E3¹⁴）。将160 mL的60倍浓缩E3加入10 L去离子水中。室温保存。
   2. 在E3中配制1%低熔点（LMP）琼脂糖。将1 g LMP琼脂糖加入100 mL E3中，在微波炉中高火加热1–2分钟至完全溶解。将熔化的琼脂糖分装至1.7 mL微量离心管中，4 °C保存。使用前在水浴中加热溶解，并置于40 °C加热块中保温备用。
   3. 通过稀释10倍浓缩储备液（1 M NaCl、20 mM KCl、10 mM MgSO₄、20 mM CaCl₂-二水合物、50 mM HEPES，用10 M NaOH调节pH至7.5，经高压灭菌后室温保存）来配制Marc's改良林格液（MMR¹⁵）等渗溶....

结果

为了确认眼球摘除是否完全，并评估视顶盖的变化，实验在 Tg[atoh7:RFP] 品系中进行，该品系使用膜定位的红色荧光蛋白（RFP）标记所有视网膜神经节细胞（RGCs），从而标记从视网膜投射并形成视神经的所有轴突²⁴。尽管使用该品系并非绝对必要，但它能够直观地观察和可视化视神经在视顶盖神经 Neuropil 中的终止区域。其他标记视神经的方法也是可行的，例如使用亲脂性染料 DiI 或 DiO 进行轴突示踪^25,26，或利用 brainbow 技术进行多光谱标记²⁷。

如图2所示，在摘除眼睛后，视顶盖神经毡中的视网膜轴突出现进行性退变。术后两天时，RFP标记的轴突表现出快速沃勒变性（Wallerian degeneration）²⁸的典型特征，如出.......

讨论

本文所述技术展示了研究斑马鱼脊椎动物视觉系统发育的多种方法之一。其他研究人员已发表过分离胚胎视网膜并进行基因表达分析¹⁹，或在视顶盖中可视化神经元活动的方法³⁰。本文提供了一种探索视网膜输入差异如何影响视顶盖中细胞行为的方法。

为确保摘除眼球手术成功以及幼体术后存活，必须保证幼体健康，并使用1%琼脂糖进行充分麻醉和固定。此外，镊子和钨针必须非常锋利且洁净。手术前后24小时内不喂食幼体，其存活率最高；而在含抗生素的MMR培养液中饲养幼体可加快愈合过程。重要的是，MMR具有较高的离子强度，尤其是较高的钙离子浓度，有助于促进伤口愈合¹⁴。然而，长时间暴露于较高盐浓度环境可能降低存活率，这一点在胚胎期斑马鱼中已有报道³¹。最关键的步骤之一是固定，以确保后续脑组织解剖的成功，而成功的脑组织解剖对于免疫染色样本图像的数据分析至关重要。使用新配制的含4%蔗糖的4%多聚甲醛（被亲切地称为“甜固定液”）通常有助.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
设备与耗材：
繁殖盒	Aquaneering	ZHCT100
道康宁高真空润滑脂	Sigma 或同等供应商	Z273554
锥形瓶（125 mL）			用于配制含抗生素的Marc's改良Ringer液，以供手术后孵育使用。
精细镊子 - Dumont #5	精细科学工具（FST）	11252-20
玻璃巴斯德吸管	DWK Lifescience	63A53 && 63A53WT	用于移液胚胎和幼鱼。
用于显微镜观察的载玻片	VWR 或同等供应商	48311-703	标准玻璃显微镜载玻片可从多家不同的实验室供应商订购。
玻璃器皿，包括量瓶和量筒			用于配制和储存溶液。
2组分环氧树脂	ACE Hardware 或其他 Gorilla Glue 或同等产品的供应商	0.85 oz 注射器	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
微量离心管（1.7 mL）	VWR 或同等供应商	22234-046
镀镍针夹（17 cm 长度）	精细科学工具（FST）	26018-17	用于在磨尖钨丝及进行手术/解剖时固定钨丝。
尼龙网茶漏或等效物	速卖通或同等平台		用于在斑马鱼产卵后收集卵；https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
回形针			用于钨针 sharpening 装置。
100 mm 培养皿	Fischer Scientific 或同等供应商	50-190-0267
35 mm 培养皿	Fischer Scientific 或同等供应商	08-757-100A
移液管泵	SP Bel-Art 或同等产品	F37898-0000
氢氧化钾（KOH）	Sigma	909122	用于钨针 sharpening 装置。在通风橱中，通过将 KOH 颗粒加入去离子水中，配制 10% w/v 的 KOH 溶液。
电源（可变电压）			用于钨针尖 sharpening 装置。任何可调电压的电源均可使用（甚至可用于凝胶电泳的电源）。
Sylgard 184 弹性体试剂盒	道康宁	3097358
钨丝（直径 0.125 mm）	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	锐化钨针以去除眼睛并解剖幼鱼。
可变温度加热模块	The Lab Depot 或同等供应商	BSH1001 或 BSH1002	设定为40-42 °实验前 C 阶段。
宽口玻璃罐带盖（例如，干净的果酱罐或萨尔萨酱罐）			用于钨针 sharpening 装置。
带鳄鱼夹引线的导线			用于钨针 sharpening 装置。
显微镜：
体视显微镜			任何类型均可使用，但首选带有可调节透射光的镜面底座。
激光扫描共聚焦显微镜			建议使用高数值孔径（NA）、20-25倍的水浸物镜。 此处使用显微镜控制和图像采集软件（尼康的 NIS-Elements），但任何共聚焦显微镜均可适用。
手术与解剖用试剂：
二水合氯化钙	Sigma	C7902	用于 Marc's 改良 Ringer 液 (MMR) 和胚胎培养基 (E3)。
HEPES	Sigma	H7006	对于马可氏改良林格液（MMR）。
低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520-050	在胚胎培养基（E3）或Marc's改良Ringer液（MMR）中配制1%溶液。
六水合氯化镁	Sigma	1374248	用于胚胎培养基（E3）。
硫酸镁	Sigma	M7506	对于马可氏改良林格液（MMR）。
多聚甲醛	电子显微镜科学公司	19210	将8%（w/v）的储存液用2倍浓缩的PBS（由10倍浓缩PBS储存液稀释而成）稀释。
青霉素/链霉素	Sigma	P4333-20ML	在马氏改良林格液中按1:100稀释。
磷酸盐缓冲液（PBS）片剂	诊断生物系统	DMR E404-01	用去离子水配制10倍浓缩液，经高压灭菌后室温保存。使用时稀释至1倍工作浓度。
氯化钾	Sigma	P3911	用于 Marc 的改良 Ringer 液 (MMR) 和胚胎培养基 (E3)。
氯化钠	Sigma	S9888	用于 Marc's 改良 Ringer 液（MMR）和胚胎培养基（E3）。
氢氧化钠	Sigma	S5881	配制10 M溶液，并用于将MMR的pH值调节至7.4。
蔗糖	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	配方：https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
免疫组织化学试剂：
Alexafluor 568 标记的二抗用于检测兔 IgG	Invitrogen	A-11011	以1:500稀释比例用于整体免疫组织化学。
DAPI 或 ToPro3	Invitrogen	1306 或 T3605	用DMSO配制1 mg/mL的溶液；用于复染时按1:5,000稀释。
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D8418	免疫阻断缓冲液的一种成分。
甲醇（MeOH）	Sigma	34860	将甲醇与PBST等水溶液混合是放热反应。请至少提前数小时配制甲醇/PBST溶液，或在使用前置于冰上冷却。
正常山羊血清	ThermoFisher Scientific	50-062Z	免疫阻断缓冲液的一种成分。可分装为 1-10 mL 体积，于 -20 ℃ 保存。 °C.
检测磷酸化组蛋白 H3 的一抗	Millipore	06-570	以1:300稀释比例用于整体免疫组织化学。
检测红色荧光蛋白（RFP；可检测dsRed衍生物）的一抗	MBL International	PM005	以1:500稀释比例用于整体免疫组织化学。
蛋白酶K（PK）	Sigma	P2308-10MG	配制10 mg/mL的PBS储存液，使用时稀释至10 µg/mL
Triton X-100	Sigma	T8787	在 PBS 中配制 20%（v/v）的储存液。
数据分析软件
ImageJ（Fiji）			用于图像分析的免费软件；https://imagej.net/software/fiji/
RStudio			用于统计分析和数据可视化的免费软件；https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop 或 GIMP			专有图像处理软件（如 Adobe Photoshop 和 Illustrator）常用于制作图表。免费替代软件是 Gnu 图像处理程序（GIMP；https://www.gimp.org/）
斑马鱼品系。 本研究使用了 AB、TU， Tg[atoh7:RFP] 品系			可从以下网址获取：  美国斑马鱼国际资源中心（https://zebrafish.org/home/guide.php）或欧洲斑马鱼资源中心（https://www.ezrc.kit.edu/）。尚未存入上述任一资源中心的特异性转基因品系，可在相关论文发表后向个别实验室申请获取。