本文介绍了一种利用柱状磁性激活细胞分选技术，在脱髓鞘疾病动物模型中分离和纯化原代小胶质细胞的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
小胶质细胞是大脑中常驻的固有免疫细胞，是中枢神经系统（CNS）发生炎症或损伤时的主要应答细胞。小胶质细胞可分为静息状态和活化状态，并能根据脑内微环境的变化迅速转换状态。在不同的病理条件下，小胶质细胞会被激活并表现出不同的表型。此外，活化的小胶质细胞存在多种不同的亚群，不同亚群之间具有高度异质性。这种异质性主要取决于小胶质细胞的分子特异性。研究表明，小胶质细胞在炎性脱髓鞘的病理过程中会被激活，并发挥重要作用。为了更深入地了解小胶质细胞在多发性硬化症和视神经脊髓炎谱系障碍等炎性脱髓鞘疾病中的特性，本文提出一种病灶周围原代小胶质细胞分选方案。该方案采用柱状磁性激活细胞分选技术（MACS），以获得高纯度的原代小胶质细胞，同时保留其分子特征，从而探究小胶质细胞在炎性脱髓鞘疾病中的潜在作用。
引言
小胶质细胞起源于卵黄囊前体细胞，这些前体细胞很早就迁移到胚胎大脑中，并参与中枢神经系统（CNS）的发育1,2。例如，它们参与突触修剪3以及调控轴突生长4。它们分泌促进神经元存活的因子，并协助神经元定位5。同时，它们还参与清除异常细胞和凋亡细胞，以确保大脑的正常发育6。此外，作为脑内的免疫活性细胞，小胶质细胞持续监视脑实质，清除死亡细胞、功能障碍的突触及细胞碎片7。已有研究表明，小胶质细胞的活化在多种疾病中发挥重要作用，包括炎性脱髓鞘疾病、神经退行性疾病和脑肿瘤。在多发性硬化症（MS）中，活化的小胶质细胞通过吞噬髓鞘碎片，促进少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的分化及髓鞘再生8。
在阿尔茨海默病（AD）中，β-淀粉样蛋白（Aβ）的积聚会激活小胶质细胞，从而影响小胶质细胞的吞噬和炎症功能9。在胶质瘤组织中被激活的小胶质细胞被称为胶质瘤相关小胶质细胞（GAM），可调控胶质瘤的进展，最终影响患者的预后10。这种激活会显著改变小胶质细胞的转录组，导致形态学变化、免疫受体的表达、吞噬活性增强以及细胞因子分泌增加11。在神经退行性疾病中存在多种不同亚群的激活态小胶质细胞，例如疾病相关小胶质细胞（DAM）、激活反应性小胶质细胞（ARM）和小胶质细胞神经退行性表型（MGnD）8。
类似地，在炎性脱髓鞘疾病中，大脑内也共存着多种动态功能亚群的小胶质细胞12。了解不同小胶质细胞亚群之间的异质性，对于研究炎性脱髓鞘疾病的发病机制并寻找潜在的治疗策略至关重要。小胶质细胞的异质性主要取决于其分子特异性8。因此，准确描述小胶质细胞的分子改变，是研究其异质性的关键。单细胞RNA测序（RNA-seq）技术的进步使得在病理条件下识别活化小胶质细胞的分子特征成为可能13。因此，分离特定条件下目标细胞群体的能力，对于进一步深入研究这些细胞至关重要。
为了解小胶质细胞的特性和功能而开展的研究通常 体外 研究发现，可从新生小鼠（1-3日龄）脑组织中制备并培养大量原代小胶质细胞，这些细胞会与其他混合胶质细胞共同贴附于培养瓶表面并在塑料培养基质上生长。随后，可根据混合胶质细胞间黏附性的差异分离获得纯化的小胶质细胞。14,15然而，该方法仅能从围产期脑组织中分离小胶质细胞，且耗时数周。细胞培养过程中潜在的变量可能影响小胶质细胞的特性，例如分子表达水平16此外，通过这些方法分离的微胶质细胞仅能参与 体外 通过模拟中枢神经系统疾病的条件进行实验，无法代表小胶质细胞的特征和功能 体内 疾病状态。因此，有必要开发从成年小鼠脑组织中分离小胶质细胞的方法。
荧光激活细胞分选（FACS）和磁分离是两种广泛应用的方法，尽管它们各自存在不同的局限性16,17,18,19它们各自的优缺点将在讨论部分进行对比。MACS 技术的成熟为快速纯化细胞提供了可能。Huang 等人开发了一种便捷的方法，用于标记脑内的脱髓鞘病变。20结合这两种技术方法，我们提出了一种快速高效的柱式CD11b磁珠分离方案，逐步描述了从成年小鼠脑内脱髓鞘病灶周围分离小胶质细胞并保留其分子特征的操作流程。局灶性脱髓鞘病灶通过立体定位注射2 µL溶血卵磷脂溶液（1% LPC溶于0.9% NaCl）至胼胝体，于启动分离方案前3天完成注射。21. 本方案为执行下一步操作奠定了基础 体外 实验。此外，该方案节省时间，且在各类实验中具有广泛的适用性。
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方案
所有动物实验程序均已获得中国华中科技大学同济医学院动物护理委员会的批准。
1. 材料
- 开始实验方案前，请准备以下溶液。
- 通过向磷酸盐缓冲液（PBS）中加入胎牛血清（FBS，终浓度 2%）来制备上样缓冲液。
- 向 PBS 中加入中性红（NR）染料（终浓度 1%）。
- 使用市售的成年动物脑组织解离试剂盒（参见材料表）配制以下溶液。
- 配制酶混合液 1：将 1.9 mL Buffer Z 和 50 µL Enzyme P 移入 15 mL 离心管中。
- 配制酶混合液 2：将 20 µL Buffer Y 和 10 µL Enzyme A 移入 1.5 mL 微量离心管中。
- 配制去碎片溶液。
2. 小鼠灌注与解剖
- 在麻醉前2-3小时，向小鼠腹腔内（i.p.）注射500 µL含1%中性红（NR）染料的PBS溶液。
注意：在脱髓鞘小鼠模型中腹腔注射中性红有助于识别病灶（图1）。 - 使用戊巴比妥钠（50 mg/kg，i.p.）对小鼠进行麻醉，并通过检测疼痛反应确认麻醉是否成功。
- 打开小鼠胸腔，暴露心脏。
- 小心剪去右心房的一小角，从左心室进行心脏内灌注，使用20–30 mL冰冷PBS溶液。
- 在麻醉状态下将小鼠断头。
- 打开颅骨，小心将脑组织从颅腔中分离出来。
- 将脑组织转移至小鼠脑切片模具中，切成0.1 cm厚的脑片。
- 取出脑片并置于培养皿（60/15 mm）中的冰冷PBS中。在体视显微镜下使用显微外科镊子对胼胝体周围被中性红染料标记的病灶进行显微解剖。
注意：确保所解剖的组织尽可能完整，以利于后续转移操作；整个解剖过程应在2小时内完成。 - 将解剖所得组织转移至含有适量冰冷上样缓冲液的15 mL离心管中。
注意：将2–3只小鼠的胼胝体组织合并至同一离心管中作为一个样本。
3. 组织解离
- 将解剖后的组织在300 ×g 条件下离心30秒（达到该转速后开始计时），使样品沉降至管底。
- 将酶混合液1和酶混合液2在37 °C培养箱中预热。
- 向一个样品中加入1,950 µL预热的酶混合液1，在37 °C培养箱中消化5分钟。
- 加入30 µL预热的酶混合液2，轻轻混匀。
- 在37 °C培养箱中继续消化15分钟，每5分钟轻轻混匀一次。
- 消化完成后向管中加入4 mL冷的PBS缓冲液，轻轻振荡。
- 将70 µm滤膜置于50 mL离心管上，并用500 µL冷的PBS缓冲液预湿滤膜。通过滤膜过滤解离的组织，将滤过的悬液转移至15 mL离心管中。
注意：如果组织量过少，可跳过此步骤。 - 将过滤后的组织样品在4 °C、300 ×g条件下离心10分钟，缓慢且彻底地吸除上清液。
注意：除酶消化步骤外，所有操作均需在冰上进行。
4. 去除碎片
- 用 1,550 µL 冷的 PBS 轻柔重悬细胞沉淀。
- 加入 450 µL 冷的去碎片溶液，充分混匀。
- 使用 1,000 µL 移液器将上述混合物沿离心管壁缓慢而轻柔地叠加 2 × 1 mL 冷 PBS。
注意：将离心管倾斜约 45 °，用移液器沿管壁缓慢加入 PBS。 - 将离心管缓慢而轻柔地转移至离心机中，在 4 °C、3,000 × g 条件下离心 10 分钟。
- 离心后观察是否形成三层结构。使用 1,000 µL 移液器完全吸除最上两层（图 2）。
- 用冷的上样缓冲液将管内体积补至 5 mL，并轻柔倒置混匀三次。
- 在 4 °C、1,000 × g 条件下离心 10 分钟。完全吸除上清液，注意避免扰动细胞沉淀。
5. 小胶质细胞的磁珠分选
- 用 90 µL 分离缓冲液重悬细胞沉淀，并加入 10 µL CD11b（小胶质细胞）磁珠。
- 充分混匀，在 4 °C 下孵育 15 分钟。
- 加入 1 mL 分离缓冲液，使用 1,000 µL 移液器轻轻上下吹打以洗涤细胞。在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，彻底吸除上清液以去除未结合的磁珠。
- 将细胞重悬于 500 µL 分离缓冲液中。
- 将用于阳性筛选的 MS 柱及其分离器置于磁场中。
- 按照生产商的操作说明，用 500 µL 分离缓冲液冲洗柱子，以保护细胞并确保磁性分选的效率。
- 将细胞悬液加载到 MS 柱上，弃去流出液（含有未标记的细胞）。
- 向柱子中加入 500 µL 分离缓冲液，重复洗涤三次，以洗去黏附在柱壁上的细胞，并弃去每次的流出液。
注意：只有当柱子储液腔完全排空后，才可加入新的分离缓冲液进行洗涤。 - 洗涤后，将柱子从分离器上取下，放置于一个 15 mL 离心管上。
- 向柱子中加入 1 mL 分离缓冲液，推动活塞到底部，以冲洗出磁性标记的细胞。重复此步骤三次，以完全收集磁性标记的细胞。
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结果
使用 CD11b 磁珠分离的微胶质细胞纯度较高
通过上述方案分离了脱髓鞘小鼠模型病灶周围的微胶质细胞，并通过流式细胞术进行检测。根据试剂说明书，细胞使用 CD11b-异硫氰酸荧光素（FITC）和 CD45-别藻蓝蛋白（APC）进行荧光标记，以在流式细胞术中鉴定微胶质细胞。已有大量文献表明，CD11b 和 CD45 抗体足以用于检测分离所得微胶质细胞的纯度19,22。流式细胞仪使用未染色及单染对照样本完成荧光补偿。细胞通过前向散射高度（FSC-H）和侧向散射高度（SSC-H）设门；单细胞通过前向散射面积（FSC-A）与 FSC-H 进行圈选。通过流式细胞术检测磁性分离前后微胶质细胞（定义为 CD11b+CD45Intermediate）的比例。采用反向回圈技术（back-loop technique）调整流式细胞术分析的设门策略，以确定微胶质细胞的设门范围。与每只小鼠脑组织磁性分离前约含有 3 × 104 个细胞和 ...
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讨论
该方案提出了一种分离脱髓鞘病灶周围小胶质细胞的方法，有助于研究小胶质细胞在炎性脱髓鞘疾病中的功能特性。使用CD11b磁珠捕获的小胶质细胞具有高纯度和高活性。方案中的关键步骤包括病灶的精确定位以及小胶质细胞的最佳纯化。在方案步骤2.1中，需在处死小鼠前2小时注射NR溶液，以确保病灶能够被准确显示20。在方案步骤2.8中，需注意将脑组织切片置于冰盒上进行解剖，并尽快完成此步骤，以提高细胞活性。在步骤2.9中，必须选择适当的组织作为酶消化和去碎片处理的同一样本。当去碎片效果不理想时，步骤3.7不可跳过。在步骤4.3中，加入PBS时必须轻柔操作，以形成不同层次，确保尽可能去除碎片。除酶消化步骤外，方案中的所有步骤均应在冰上操作，以保证细胞活性并减少小胶质细胞的转录反应。该方案的每一步操作均温和，能保持高细胞活性，因此无需使用死细胞去除溶液22,23。
该方案中用于小鼠脑组织的酶解离方法已证明适用于单细胞RNA测序
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
本研究由同济医院（华中科技大学）优秀青年科学家基金（项目编号：2020YQ06）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微型离心管 | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL 离心管 | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL 离心管 | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm 滤膜 | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| 成年动物脑组织解离试剂盒，适用于小鼠和大鼠 | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J 小鼠 | SJA Labs | ||
| CD11b（小胶质细胞）磁珠，适用于人和小鼠 | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| 胎牛血清 | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS 多功能支架 | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| 中性红 | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte 流式细胞仪 | Agilent | 由多个部件组成的系统 | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| 戊巴比妥钠 | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| 体视显微镜 | MshOt | MZ62 |
参考文献
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