通过磁活化细胞分选在脱髓鞘动物模型中分离小鼠原代小胶质细胞

摘要

在这里，我们提出了一种方案，利用柱状磁激活细胞分选在脱髓鞘疾病的动物模型中分离和纯化原代小胶质细胞。

摘要

小胶质细胞是大脑中常驻的先天免疫细胞，是中枢神经系统（CNS）炎症或损伤的主要反应者。小胶质细胞可分为静息状态和活化状态，并能响应大脑的微环境迅速改变状态。小胶质细胞将在不同的病理条件下被激活，并表现出不同的表型。此外，活化小胶质细胞有许多不同的亚群，不同亚群之间有很大的异质性。异质性主要取决于小胶质细胞的分子特异性。研究表明，小胶质细胞将被激活，并在炎症性脱髓鞘的病理过程中发挥重要作用。为了更好地了解小胶质细胞在炎症性脱髓鞘疾病（如多发性硬化症和神经脊髓炎视谱系障碍）中的特征，我们提出了一种围膜原发性小胶质细胞分选方案。该方案利用柱状磁活化细胞分选（MACS）获得高度纯化的原代小胶质细胞，并保留小胶质细胞的分子特性，以研究小胶质细胞在炎症性脱髓鞘疾病中的潜在作用。

引言

小胶质细胞起源于卵黄囊祖细胞，其很早就到达胚胎大脑并参与CNS^1，2的发育。例如，它们参与突触修剪³ 和调节轴突生长⁴。它们分泌促进神经元存活和帮助神经元定位的因子⁵。同时，它们参与去除异常细胞和凋亡细胞，以确保大脑的正常发育⁶。此外，作为大脑的免疫感受态细胞，小胶质细胞不断监测脑实质以清除死细胞，功能失调的突触和细胞碎片⁷。已经证明，小胶质细胞活化在多种疾病中起重要作用，包括炎症性脱髓鞘疾病，神经退行性疾病和脑肿瘤。多发性硬化症（MS）中活化的小胶质细胞有助于少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的分化和髓鞘的再生，通过吞噬髓鞘碎片⁸。

在阿尔茨海默病（AD）中，淀粉样蛋白β（Aβ）的积累激活小胶质细胞，其影响小胶质细胞⁹的吞噬和炎症功能。神经胶质瘤组织中活化的小胶质细胞，称为胶质瘤相关小胶质细胞（GAM），可以调节胶质瘤的进展并最终影响患者的预后¹⁰。激活深刻地改变了小胶质细胞转录组，导致形态学变化，免疫受体的表达，吞噬活性增加和细胞因子分泌增强¹¹。在神经退行性疾病中，活化小胶质细胞有不同的亚群，例如疾病相关性小胶质细胞 （DAM）、活化反应小胶质细胞 （ARM） 和小胶质细胞神经退行性表型 （MGnD）⁸。

类似地，小胶质细胞的多个动态功能亚群也在炎症性脱髓鞘疾病中共存于大脑中¹²。了解小胶质细胞不同亚群之间的异质性对于研究炎症性脱髓鞘疾病的发病机制并找到其潜在的治疗策略至关重要。小胶质细胞的异质性主要取决于分子特异性⁸。准确描述小胶质细胞的分子改变对于研究异质性至关重要。单细胞RNA测序（RNA-seq）技术的进步使得在病理条件下鉴定活化小胶质细胞的分子特征¹³。因此，分离细胞群的能力对于在特定条件下进一步研究这些靶细胞至关重要。

为了解小胶质细胞的特征和功能而进行的研究通常是 体外 研究，因为已经发现可以从小鼠幼鼠大脑（1-3天大）制备和培养大量原代小胶质细胞，这些小鼠幼鼠附着在培养瓶上并与其他混合神经胶质细胞一起生长在塑料表面上。随后，纯小胶质细胞可以基于混合胶质细胞^14，15的不同粘附性来分离。然而，这种方法只能从围产期大脑中分离出小胶质细胞，需要数周时间。细胞培养中的潜在变量可能会影响小胶质细胞特征，例如分子表达¹⁶。而且，通过这些方法分离的小胶质细胞只能通过模拟中枢神经系统疾病的状况来参与 体外 实验，不能代表小胶质细胞 在体内 疾病状态下的特征和功能。因此，有必要开发从成年小鼠大脑中分离小胶质细胞的方法。

荧光活化细胞分选（FACS）和磁分离是两种广泛使用的方法，尽管它们有其不同的局限性^{16，17，18，19}。它们各自的优点和缺点将在讨论部分进行对比。MACS技术的成熟为快速纯化细胞提供了可能性。Huang等人已经开发出一种方便的方法来标记大脑中的脱髓鞘病变²⁰。结合这两种技术方法，我们提出了一种快速有效的柱状CD11b磁分离方案，提供分步描述，以分离成年小鼠大脑脱髓鞘病变周围的小胶质细胞，并保留小胶质细胞的分子特征。局灶性脱髓鞘病变是由在^开始方案21前3天在胼胝体中立体定向注射2μL溶血卵磷脂溶液（1%LPC在0.9%NaCl中）引起的。该协议为进行 体外 实验的下一步奠定了基础。此外，该协议节省了时间，并且在各种实验中广泛使用仍然是可行的。

方案

所有动物程序均已获得中国华中科技大学同济医学院动物护理委员会的批准。

1. 材料

1. 在开始协议之前，请准备以下解决方案。
   1. 通过将胎牛血清（FBS，2%）添加到磷酸盐缓冲盐水（PBS）中来制备上样缓冲液。
   2. 在PBS中添加中性红（NR）染料（最终1%）。
2. 使用市售的成人大脑解离试剂盒准备以下解决方案（参见 材料表）。
   1. 为了制备酶混合物1，将1.9mL缓冲液Z和50μL酶P移液到15mL离心管中。
   2. 为了制备酶混合物2，将20μL缓冲液Y和10μL酶A移液到1.5mL微量离心管中。
   3. 准备碎屑去除溶液。

2. 小鼠灌注和解剖

1. 腹膜内（ip）在麻醉前2-3小时在PBS中向小鼠注射500μL1%NR染料。
   注意:在脱髓鞘小鼠模型中腹腔注射NR有助于辨别病变（图1）。
2. 用戊巴比妥（50mg / kg，ip）麻醉小鼠，并通过检查疼痛反应确保小鼠成功麻醉。
3. 打开鼠标的胸腔并露出心脏。
4. 小心地切下右心房的一个小角，并从左心室用20-30mL冷PBS心内灌注小鼠。
5. 在麻醉下将小鼠斩首。
6. 打开小鼠的头骨，小心地将大脑从头骨中解放出来。
7. 将大脑转移到小鼠大脑切片模具中，并将大脑切成0.1厘米的切片。
8. 取出脑切片并将其置于培养皿（60/15毫米）的冷PBS中。使用显微外科镊子在立体显微镜下用NR染料标记的胼胝体周围标记的病变进行显微切片。
   注意:确保解剖组织尽可能完整，以方便随后的转移;总解剖进度应在2小时内完成。
9. 将解剖组织转移到含有适当量冷上样缓冲液的15 mL离心管中。
   注意:将2-3只小鼠的胼胝体组织在一个管中作为一个样品池化。

3. 组织解离

1. 将解剖的组织以300×g离心30秒（达到此速度后）以收集管底部的样品。
2. 在培养箱中预热酶混合物1和酶混合物2至37°C。
3. 将1，950μL预热酶混合物1加入一个样品中，并在37°C的培养箱中消化5分钟。
4. 加入30μL预热酶混合物2并轻轻混合。
5. 在37°C的培养箱中消化15分钟，每5分钟轻轻混合一次。
6. 消化后将4毫升冷PBS加入管中，轻轻摇匀。
7. 将70μm过滤器放在50 mL离心管上，并用500μL冷PBS预湿滤器。通过将消化的组织样品通过过滤器来过滤解离的组织，并将50 mL离心管中过滤的悬浮液转移到15 mL离心管中。
   注意:如果组织量太小，请跳过此步骤。
8. 将过滤的组织样品在4°C下以300×g 离心10分钟，并缓慢完全地吸出上清液。
   注意:除酶消化外，所有步骤都应在冰上进行。

4. 清除碎屑

1. 用1，550μL冷PBS轻轻重悬细胞沉淀。
2. 加入450μL冷溶液以去除碎屑并充分混合。
3. 使用1，000μL移液器非常缓慢且轻轻地用2×1 mL冷PBS覆盖上述混合物。
   注意:离心管倾斜45°，并用移液器沿管壁缓慢添加PBS。
4. 将管缓慢而轻柔地转移到离心机中，并在4°C和3，000× g 下旋转10分钟。
5. 离心后寻找三层。使用1，000μL移液器完全吸出两层顶层（图2）。
6. 用冷负载缓冲液填充高达5 mL的试管，并轻轻倒置试管三次。
7. 在4°C和1，000× g 下离心10分钟。完全吸出上清液，避免破坏细胞沉淀。

5. 小胶质细胞的磁分离

1. 用90μL上样缓冲液重悬细胞沉淀，并加入10μLCD11b（小胶质细胞）珠。
2. 充分混合并在4°C下孵育15分钟。
3. 加入1mL上样缓冲液，并用1，000μL移液管轻轻上下移液，以在孵育后洗涤细胞。将细胞在4°C和300×g 下离心10分钟，并完全吸出上清液以除去未结合的珠子。
4. 将细胞重悬于500μL上样缓冲液中。
5. 将 MS 色谱柱与其分离器一起放置在磁场中进行正向选择。
6. 用500μL上样缓冲液冲洗色谱柱，以保护细胞并确保基于制造商协议的磁分选效率。
7. 将细胞悬浮液施加到MS柱上，并丢弃含有未标记细胞的流出物。
8. 向色谱柱中加入500μL上样缓冲液三次，以洗去粘附在柱壁上的细胞并丢弃流出的细胞。
   注意:仅当色谱柱储液器完全空时，才添加新的上样缓冲液进行洗涤。
9. 洗涤色谱柱后，将色谱柱从分离器中取出，并将其放在 15 mL 离心管上。
10. 向色谱柱中加入1 mL上样缓冲液，并将柱塞推至色谱柱底部以冲洗出磁性标记的细胞。重复此步骤三次以完全收集磁性标记的细胞。

结果

使用CD11b珠分离的小胶质细胞具有高纯度
使用上述方案分离脱髓鞘小鼠模型中病变周围的小胶质细胞，并通过流式细胞术进行测试。用CD11b-荧光素异硫氰酸酯（FITC）和CD45-别叶花青素（APC）荧光标记细胞，以根据制造商的说明在流式细胞术中测定小胶质细胞。有多种文献表明，CD11b和CD45抗体足以检查分离出的小胶质细胞^19，22的纯度。使用未染色和单染色的对照样品在流式细胞仪上完成荧光补偿。细胞由前向散射高度（FSC-H）和侧散射高度（SSC-H）门控;单细胞由前向散射区（FSC-A）和FSC-H门控。通过流式细胞术测试磁分离前后小胶质细胞（鉴定为CD11b ⁺ CD45^中间体）的比例。采用后循环技术，通过确定小胶质细胞的门限来调整流式细胞术分析的门控策略。与每个小鼠大脑磁分离前约3×10⁴ 个细胞和6个×10³ 个小胶质细胞（图3A

讨论

该方案提出了一种分离脱髓鞘病变周围的小胶质细胞的方法，可以帮助研究小胶质细胞在炎症性脱髓鞘疾病中的功能特征。使用CD11b珠捕获的小胶质细胞具有高纯度和活力。方案中的关键步骤包括病灶的精确定位和最佳的小胶质细胞纯化。在方案步骤2.1中，有必要在牺牲小鼠之前2小时注射NR溶液，以确保病变可以准确显示²⁰。在方案步骤2.8中，注意将脑组织切片放在冰盒上进行解剖，并尽快完成此步骤，从而提高细胞活力。在步骤2.9中，有必要选择适当的组织作为酶消化和碎片去除的一个样品。步骤3.7当碎屑清除效果不理想时，不能跳过。在步骤4.3中，PBS的添加必须温和以形成不同的层，以确保尽可能多地去除碎屑。除酶消化外，方案中的所有步骤都应在冰上进行，以确保细胞活力并降低小胶质细胞的转录反应。方案中的每个步骤都是温和的并保持高活力的，因此没有必要使用死细胞去除溶液^22，23。

该方案中小鼠大脑的酶解离方法已被证明适用于单细胞RNA-seq

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	BIOFIL	CFT001015
15 mL 离心管	BIOFIL	CFT011150
50 mL 离心管	BIOFIL	CFT011500
70 µm 过滤器	Miltenyi Biotec	130-095-823
成体脑解离试剂盒，小鼠和大鼠	Miltenyi Biotec	130-107-677
C57BL/6J 小鼠	SJA Labs
CD11b（小胶质细胞）珠子，人和小鼠	Miltenyi Biotec	130-093-634
胎牛血清	BOSTER	PYG0001
FlowJo	BDBiosciences	V10
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MiniMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-102
MS 色谱柱	Miltenyi Biotec	130-042-201
中性红色	Sigma-Aldrich	1013690025
NovoCyte 流式细胞仪	安捷伦		A 系统组成各种部件
NovoExpress	Agilent	1.4.1
PBS	BOSTER	PYG0021
戊巴比妥	Sigma-Aldrich	P-010
体视显微镜	MshOt	MZ62