通过磁活化细胞分选在脱髓鞘动物模型中分离小鼠原代小胶质细胞

摘要

在这里，我们提出了一种方案，利用柱状磁激活细胞分选在脱髓鞘疾病的动物模型中分离和纯化原代小胶质细胞。

摘要

小胶质细胞是大脑中常驻的先天免疫细胞，是中枢神经系统（CNS）炎症或损伤的主要反应者。小胶质细胞可分为静息状态和活化状态，并能响应大脑的微环境迅速改变状态。小胶质细胞将在不同的病理条件下被激活，并表现出不同的表型。此外，活化小胶质细胞有许多不同的亚群，不同亚群之间有很大的异质性。异质性主要取决于小胶质细胞的分子特异性。研究表明，小胶质细胞将被激活，并在炎症性脱髓鞘的病理过程中发挥重要作用。为了更好地了解小胶质细胞在炎症性脱髓鞘疾病（如多发性硬化症和神经脊髓炎视谱系障碍）中的特征，我们提出了一种围膜原发性小胶质细胞分选方案。该方案利用柱状磁活化细胞分选（MACS）获得高度纯化的原代小胶质细胞，并保留小胶质细胞的分子特性，以研究小胶质细胞在炎症性脱髓鞘疾病中的潜在作用。

引言

小胶质细胞起源于卵黄囊祖细胞，其很早就到达胚胎大脑并参与CNS^1，2的发育。例如，它们参与突触修剪³ 和调节轴突生长⁴。它们分泌促进神经元存活和帮助神经元定位的因子⁵。同时，它们参与去除异常细胞和凋亡细胞，以确保大脑的正常发育⁶。此外，作为大脑的免疫感受态细胞，小胶质细胞不断监测脑实质以清除死细胞，功能失调的突触和细胞碎片⁷。已经证明，小胶质细胞活化在多种疾病中起重要作用，包括炎症性脱髓鞘疾病，神经退行性疾病和脑肿瘤。多发性硬化症（MS）中活化的小胶质细胞有助于少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的分化和髓鞘的再生，通过吞噬髓鞘碎片⁸。

在阿尔茨海默病（AD）中，淀粉样蛋白β（Aβ）的积累激活小胶质细胞，其影响小胶质细胞⁹的吞噬和炎症功能。神经胶质瘤组织中活化的小胶质细胞，称为胶质瘤相关小胶质细胞（GAM），可以调节胶质瘤的进展并最终影响患者的预后¹⁰

方案

所有动物程序均已获得中国华中科技大学同济医学院动物护理委员会的批准。

1. 材料

1. 在开始协议之前，请准备以下解决方案。
   1. 通过将胎牛血清（FBS，2%）添加到磷酸盐缓冲盐水（PBS）中来制备上样缓冲液。
   2. 在PBS中添加中性红（NR）染料（最终1%）。
2. 使用市售的成人大脑解离试剂盒准备以下解决方案（参见 材料表）。
   1. 为了制备酶混合物1，将1.9mL缓冲液Z和50μL酶P移液到15mL离心管中。
   2. 为了制备酶混合物2，将20μL缓冲液Y和10μL酶A移液到1.5mL微量离心管中。
   3. 准备碎屑去除溶液。

2. 小鼠灌注和解剖

1. 腹膜内（ip）在麻醉前2-3小时在PBS中向小鼠注射500μL1%NR染料。
   注意:在脱髓鞘小鼠模型中腹腔注射NR有助于辨别病变（图1）。
2. 用戊巴比妥（50mg / kg，ip）麻醉小鼠，并通过检查疼痛反应确保小鼠成功麻醉。
3. 打开鼠标的胸腔并露出心脏。
4. 小心地切下右心房....

结果

使用CD11b珠分离的小胶质细胞具有高纯度
使用上述方案分离脱髓鞘小鼠模型中病变周围的小胶质细胞，并通过流式细胞术进行测试。用CD11b-荧光素异硫氰酸酯（FITC）和CD45-别叶花青素（APC）荧光标记细胞，以根据制造商的说明在流式细胞术中测定小胶质细胞。有多种文献表明，CD11b和CD45抗体足以检查分离出的小胶质细胞^19，22的纯度。使用未染色和单染色的对照样品在流式细胞仪上完成荧光补偿。细胞由前向散射高度（FSC-H）和侧散射高度（SSC-H）门控;单细胞由前向散射区（FSC-A）和FSC-H门控。通过流式细胞术测试磁分离前后小胶质细胞（鉴定为CD11b ⁺ CD45^中间体）的比例。采用后循环技术，通过确定小胶质细胞的门限来调整流式细胞术分析的门控策略。与每个小鼠大脑磁分离前约3×10⁴ 个细胞和6个×10³ 个小胶质细胞（图3A

讨论

该方案提出了一种分离脱髓鞘病变周围的小胶质细胞的方法，可以帮助研究小胶质细胞在炎症性脱髓鞘疾病中的功能特征。使用CD11b珠捕获的小胶质细胞具有高纯度和活力。方案中的关键步骤包括病灶的精确定位和最佳的小胶质细胞纯化。在方案步骤2.1中，有必要在牺牲小鼠之前2小时注射NR溶液，以确保病变可以准确显示²⁰。在方案步骤2.8中，注意将脑组织切片放在冰盒上进行解剖，并尽快完成此步骤，从而提高细胞活力。在步骤2.9中，有必要选择适当的组织作为酶消化和碎片去除的一个样品。步骤3.7当碎屑清除效果不理想时，不能跳过。在步骤4.3中，PBS的添加必须温和以形成不同的层，以确保尽可能多地去除碎屑。除酶消化外，方案中的所有步骤都应在冰上进行，以确保细胞活力并降低小胶质细胞的转录反应。方案中的每个步骤都是温和的并保持高活力的，因此没有必要使用死细胞去除溶液^22，23。

该方案中小鼠大脑的酶解离方法已被证明适用于单细胞RNA-seq

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	BIOFIL	CFT001015
15 mL 离心管	BIOFIL	CFT011150
50 mL 离心管	BIOFIL	CFT011500
70 µm 过滤器	Miltenyi Biotec	130-095-823
成体脑解离试剂盒，小鼠和大鼠	Miltenyi Biotec	130-107-677
C57BL/6J 小鼠	SJA Labs
CD11b（小胶质细胞）珠子，人和小鼠	Miltenyi Biotec	130-093-634
胎牛血清	BOSTER	PYG0001
FlowJo	BDBiosciences	V10
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MiniMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-102
MS 色谱柱	Miltenyi Biotec	130-042-201
中性红色	Sigma-Aldrich	1013690025
NovoCyte 流式细胞仪	安捷伦		A 系统组成各种部件
NovoExpress	Agilent	1.4.1
PBS	BOSTER	PYG0021
戊巴比妥	Sigma-Aldrich	P-010
体视显微镜	MshOt	MZ62