用于测量感光色素水平的电生理学方法 果蝇 光感受器

摘要

我们提出了一种电生理学方法，用于表征双稳态光敏色素：（i）利用光敏色素分子在吸收光子后发生的电荷位移及其在感光细胞中的大量存在，以及（ii）利用视紫红质与高视紫红质这两种光敏色素状态之间的吸收光谱差异。这些方法可用于筛选影响双稳态光敏色素系统的突变。 

摘要

果蝇 G蛋白偶联的光敏色素视紫红质（R）由一种蛋白质（视蛋白）和一个发色团组成。视紫红质的激活过程始于光子吸收所引发的发色团异构化，从而促进视蛋白发生构象变化，形成第二种暗态稳定的光敏色素状态（变视紫红质，M）。对这种双稳态光敏色素进行随机诱变研究时，需要简单且可靠的突变果蝇筛选方法。因此，已设计出多种用于检测功能性光敏色素水平降低的方法。其中一种方法利用了光敏色素在吸收光子后内部产生的电荷位移，以及光感受器中大量表达的光敏色素分子。这一电信号被称为早期受体电位（或早期受体电流），可通过多种电生理学方法（例如视网膜电图和全细胞记录）进行测量，且其信号强度与功能性光敏色素水平呈线性正比关系。该方法的优点包括高信噪比、对光敏色素水平的直接线性测量，以及不依赖于视紫红质或变视紫红质激活下游的光转导机制。另一种称为持续性去极化后电位（PDA）的电生理学方法，则利用了果蝇光敏色素的双稳态特性以及R和M色素状态之间的吸收光谱差异。PDA由强蓝光诱导，使大量视紫红质转化为变视紫红质，导致在黑暗中长时间无法终止光反应；但可通过强橙光将变视紫红质转换回视紫红质，从而终止PDA。由于PDA是一种需要大量光敏色素转换的强信号，即使光敏色素生成过程中存在微小缺陷，也会导致PDA明显异常，易于检测。事实上，PDA缺陷型突变体的研究已帮助鉴定出多个在光转导过程中起重要作用的新信号蛋白。

引言

光激活的视紫红质（R）是一种G蛋白偶联受体（GPCR），由一种含有7个跨膜结构域的蛋白质（视蛋白）和一个发色团组成。 黑腹果蝇 （果蝇）, 光子吸收诱导11-的异构化顺式-3-羟基视黄醛发色团转化为全-转-3-羟基视黄醛¹，促进视紫红质构象转变为变视紫红质（M, 图1A）。与脊椎动物视紫红质不同，无脊椎动物视紫红质的主要组分 发色团不会从视蛋白上解离，从而形成生理活性的暗稳定色素状态M。随后，全-反式视黄醛进一步吸收光子转-3-羟基视黄醛发色团诱导发色团的异构化^2,3，生成具有11-的R色素状态顺式-3-羟基视黄醛发色团。R态是一种在暗处稳定且生理上无活性的光色素。此外，发色团还存在极快的光子再生途径⁴，与脊椎动物非常相似 视色素，无脊椎动物中存在一条酶促的缓慢再生途径，其中部分步骤由感光细胞周围的视网膜细胞完成^5,6.

果蝇 作为一种研....

方案

1. 利用视网膜电图测量强度-反应关系、持续性去极化后电位（PDA）以及早期受体电位（ERP）

1. 黑腹果蝇（D. melanogaster）的适宜饲养条件
   1. 将黑腹果蝇（D. melanogaster）饲养于装有标准黄色玉米培养基的瓶子中，并置于温度维持在24 °C、光照周期为12小时光照/12小时黑暗的培养箱内
   2. 实验前至少24小时将果蝇瓶置于黑暗环境中
2. 通用实验装置准备
   1. 使用外径1 mm、内径0.58 mm（O.D × I.D）的含纤维硼硅酸盐玻璃毛细管拉制记录电极（图6L，O），电极电阻应为5–10 MΩ；可使用任何合适的拉制仪
   2. 将两根银丝镀上AgCl₂：将0.25 mm银丝插入3 M KCl溶液中，并连接至自制的5 V电源
   3. 将每根镀银丝插入电极夹持器中（图6N）
   4. 使用带细长尖端的注射器将过滤后的林格氏液（见表1）注入玻璃毛细管（图6M）
   5. 将导线电极插入玻璃毛细管中，确保....

结果

图 2 展示了使用 ERG 技术的稳健性和简便性。该技术具有稳健性，因为它通过一种简单的细胞外电压记录技术，在近乎完整的果蝇体内进行记录，仅需一个简单的电生理装置即可完成。即使在突变显著降低或扭曲光反应的情况下，仍能获得振幅相对较大（毫伏范围）的光反应记录，这体现了其稳健性。因此，即使是没有经验的研究人员，也可以使用这一极为简单的实验装置，并在几天内学会如何获得有意义的结果。该技术用于测量视色素水平的主要目标，已通过极大简化的 PDA（图 2C）和 ERP（图 2C-E）方法实现。相比之下，另一种可选方法——微分光光度法，则需要昂贵的光学设备以及大量的培训和操作技巧（图 3B）。ERC（图 5A-D）虽然在技.......

讨论

使用该方法的主要优势在于 果蝇 感光细胞制备的优势在于其易于获取、光刺激操作简便且精确，最重要的是，能够应用分子遗传学的强大技术手段⁷已通过广泛的遗传学研究确立 果蝇 作为解析复杂生物过程遗传机制的极为有用的模型系统⁷结构相对简单 果蝇 基因组（仅包含四条染色体，包括X和Y性染色体、两条较大的常染色体——染色体2和染色体3，以及微小的点状第四染色体）、易于培养的特性以及较短的世代周期（在24 °C下约为2周）使其成为 果蝇 适用于筛选大量诱变个体果蝇。此外，由于平衡染色体的构建，使得任何分离出的突变体的分离与维持成为可能；平衡染色体含有显性标记和多重倒位，可阻止其与天然染色体发生重组。现有的分子工具已使得对 体外 在天然细胞环境中修饰的基因产物³⁷这一强大的方法已产生大量突变果蝇，其新蛋白质功能缺陷是原本难以预测的⁷.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带细长针头的1 mL注射器			图6M
1 把粗头镊子		Dumont #5，标准型	0.1 毫米 × 0.06 毫米，长 110 毫米，Inox（图 6H）
2个聚光镜
A/D转换器	分子装置	Digidata 1200	可能的替代设备：Molecular Devices 公司生产的任意 Digidata（例如 1440A）——图 7C
放大器	近乎完美的电子器件		可能的替代品：Warner Instruments - IE251A 或 IE-210（带前置放大器头级）- 图7D
防振台	纽波特	VW-3036-OPT-01	图7H
毛细血管	哈佛仪器	硼硅酸盐玻璃毛细管	1 mm × 0.58 mm（图6O）
Clampex	分子装置		软件
CO2 储液罐
冷光源	Schott	KL1500 LCD	图6C
精密擦拭器	Kimtech		Kimwipes（图6K）
电极夹 holder			适用于内径为1 mm的毛细管（图6N、图7N和图7P）
法拉第笼	自制		电磁噪声屏蔽与黑色前帘（图7K）
滤光片（颜色）	Schott	OG590，边缘滤光片	图7S
滤光片（颜色）	Schott	BP450/40 nm	图7S
滤光片（颜色）	运动外套	550 nm	图7S
冷光源滤光片（彩色）	Schott	RG630	图6C
过滤（加热）	Schott	KG3	图7S
滤光片（中性密度滤光片）	色度	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	图7S
闪光灯系统	霍尼韦尔		图 7U
带注射器的果蝇睡眠监测系统	Inject + matic		图6A-B
灯电源供应器	PTI	LPS-220	图7W
光探测器	自制		光电晶体管（图7O）
光导			3 mm 直径，1.3 m 长（图 7L,M）
光源			高压无臭氧75 W氙灯（以50 W功率运行），可替换为Cairn Research - OptoLED（图7R）
低温熔化石蜡	自制		由蜂蜡混合物（Tm≈62 °C）和石蜡以约3:1的比例混合，使其熔点达到约55℃–56 °C（图6J）
用于果蝇的磁力架	自制		图6I 和 图7Q
带有前置放大器的微电极放大系统	近乎完美的电子器件		阻抗测试仪（图7G）
显微操作仪（机械粗调）	Tritech Research，Narishige	M-2
显微操作仪（机械精细型）	Leitz Microsystems	莱茨机械显微操作器	图7F
pCLAMP	分子装置		软件
培养皿			60 mm
脉冲发生器	AMPI	掌握 8	图7A
用于心电图的导电膏	Parker Laboratories	Redux 电解质 Crè我
快门驱动器	Uniblitz，Vincent Associates	VCM-D1 单通道单稳态	图7V
快门系统	Uniblitz，Vincent Associates	LS2 2 mm 单稳态快门	图7V
银丝	Warner Instruments		0.25–直径1 mm，需要进行氯化处理
由铂铱合金丝制成的电烙铁			0.25 mm 直径（图 6F）
体视变倍显微镜	尼康	SMZ-2B	图6D
体视变倍显微镜	野生型	野生型M5	具有 6、12、25 和 50 倍放大设置（图 7E）
注射器滤器	Millex		22 µm PVDF 滤膜
垂直式移液器拉制仪	Sutter/ Narishige	Model P-97/PP-830	根据个人偏好选择使用垂直或水平拉制仪（图6L）
石蜡丝加热器	自制		见图S1（图6E-G）
氙闪光灯系统	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	图7X