本方案介绍了如何基于微流控芯片构建连续流动聚合酶链式反应系统，以及如何在实验室中搭建毛细管电泳系统。该方法为实验室中核酸分析提供了一种简便的途径。
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本文内容
摘要
摘要
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增目标基因的传统方法，在生物分子诊断中发挥着重要作用。然而，由于传统PCR的温度变化效率较低，耗时较长。本研究提出了一种基于微流控芯片的连续流动PCR（CF-PCR）系统。通过将PCR溶液引入置于不同温度加热器上的微通道中，可显著缩短扩增时间。此外，毛细管电泳（CE）是区分阳性与假阳性PCR产物的理想方法，因此构建了CE系统以实现DNA片段的高效分离。本文描述了利用自主搭建的CF-PCR系统对大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）进行基因扩增，并通过CE检测PCR产物的过程。结果表明，E. coli的目标基因在10分钟内成功扩增，证明这两种系统可用于核酸的快速扩增与检测。
引言
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，可将微量DNA扩增数亿倍。该技术已广泛应用于临床诊断、医学研究、食品安全、法医鉴定等领域。PCR过程主要包括三个步骤：90-95 °C的变性、50-60 °C的退火以及72-77 °C的延伸。热循环是PCR过程中的关键环节；然而，传统的PCR热循环仪不仅体积庞大，而且效率较低，完成25个循环大约需要40分钟。为克服这些局限，本研究自行构建了一种基于微流控芯片的连续流动PCR（CF-PCR）系统。CF-PCR通过将PCR溶液驱动至置于不同温度加热器上的微通道中，可显著节省反应时间1,2,3,4,5。
毛细管电泳（CE）具有诸多优势，例如高分辨率、高速度和优异的重复性6,7,8,9,10,11，因此已成为实验室中分析核酸和蛋白质的常用工具。然而，由于CE仪器价格昂贵，大多数实验室，特别是发展中国家的实验室，难以负担该技术。本文中，我们概述了如何在实验室中制备CF-PCR微流控芯片以及如何搭建一个多功能CE系统的操作流程。我们还展示了利用该CF-PCR系统扩增大肠杆菌（E. coli）以及通过CE系统检测PCR产物的过程。按照本方案所述步骤操作，即使资源有限，使用者也应能够制备微流控芯片、配制PCR溶液、构建用于核酸扩增的CF-PCR系统，并建立一个简单的CE系统以分离DNA片段。
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方案
注意：本实验方案中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息，请参见材料表。
1. CF-PCR 微流控芯片的制备
- 将硅片在 200 °C 下加热 25 分钟，以去除水分。
- 每英寸硅片使用 1 mL SU-8-2075 光刻胶。使用匀胶机在硅片上旋涂，先以 100 rpm/s 的加速度在 500 rpm 下旋转 5–10 秒，然后以 500 rpm/s 的加速度在 2,000 rpm 下旋转 30 秒。
- 将硅片在 65 °C 下预烘 3 分钟，然后在 95 °C 下烘烤 15 分钟。
- 将光刻机的曝光能量设置为150–215 mJ/cm²，使用光刻掩模将设计好的图案刻蚀到光刻胶上。将硅片和掩模放置到位，准备曝光。
- 曝光后，将硅片在 65 °C 下烘烤 2 分钟，然后在 95 °C 下烘烤 7 分钟。
- 将硅片浸入显影液中以去除多余的光刻胶，当观察到微通道时取出（图 1）。用异丙醇冲洗残留的显影液。
- 按 10:1 的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物与固化剂。将混合后的 PDMS 溶液倒入复制模具中，并在 80 °C 下固化 60 分钟。
- 使用等离子清洗仪活化后，将 PDMS 微流控芯片键合到载玻片上，并尽快在 80 °C 下固化 30 分钟（图 2）。
注：芯片的外部尺寸为 80.0 mm × 30.0 mm × 0.4 mm。微流控芯片内含有 40 条蛇形通道（100 µm × 1.46 mm × 100 µm，宽 × 长 × 深）。
2. PCR 溶液的制备
- 配置前需将试剂完全解冻。使用涡旋混合器和离心机确保试剂充分混匀。
- 准备一个离心管，按以下顺序加入各组分：33.75 µL 水、1.0 µL DNA 模板、0.5 µL 引物、5.0 µL 缓冲液、4.0 µL dNTP 混合物、1.5 µL Tween 20、3.5 µL PVP，最后加入 0.25 µL DNA 聚合酶。
注意：此处使用的 DNA 模板为 E. coli。E. coli 的引物和 PCR 溶液的组分分别列于 表 1 和 表 2 中。 - 通过涡旋混合溶液。
3. CF-PCR 系统的构建
- 准备两个正温度系数（PTC）陶瓷加热器、两个固态继电器、两个PID温度控制器、两个温度传感器和一根电源线。
注：PTC陶瓷加热器的尺寸取决于微流控芯片的大小；长度应大于芯片的长度——此处使用的PTC陶瓷加热器的长宽高为10 cm x 2 cm x 0.4 cm。 - 将加热器连接至固态继电器。
- 将固态继电器连接至PID温度控制器。
- 将温度传感器探头固定在两个加热器的底部，并将接线端连接至PID温度控制器。
- 将两个固态继电器串联，并连接电源线。
- 使用3D打印技术为两个加热器制作一个插槽，并使加热器保持在同一平面上（3D打印所需的STL文件见补充文件1）。
注：两个加热器之间应留出12 mm的空气间隙。 - 将微流控芯片放置在两个加热器上。
- 准备一台注射泵和一个注射器，将注射器固定在注射泵上，用内径为0.8 mm的硅胶管连接注射器，并在硅胶管顶端连接一根内径为0.7 mm的不锈钢针（图3）。
- 将不锈钢针插入微流控芯片的入口。
- 在芯片出口处放置一个移液器吸头，用于收集PCR产物。
4. 毛细管电泳系统的构建
- 使用高压电源产生脉冲电场；注意正极和负极。
- 使用汞灯作为光源，并通过滤光片筛选汞灯的激发波长。
- 将毛细管放置在显微镜载物台上。
- 用物镜收集荧光发射信号，然后通过R928光电倍增管（PMT）进行检测。观察显微镜和毛细管。在暗室条件下打开光源；激发光由物镜收集。
- 使用自主开发的LABVIEW软件控制电源并完成数据采集（见步骤6.3–6.6）。参见 https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi。
注意：所有实验均在暗室中进行，毛细管电泳系统示意图见图4。
5. 运行PCR反应体系
- 将CF-PCR系统的加热器预设温度分别设为65 °C和95 °C。
- 将微流控芯片放置在两个加热块上。
- 将硅胶管的管尖插入含有50 µL PCR溶液（来自步骤2.3）的离心管中。拉动注射器活塞，缓慢吸取溶液。将注射器固定在注射泵上，并将钢针插入微流控芯片的进样口。
- 设置泵的流速为10 µL/min，按下开始按钮，推动溶液进入微芯片的微通道入口处。
- 在微流控芯片的出口处收集PCR产物。
注意：在PCR前后用超纯水冲洗通道，以去除杂质。
6. 利用本实验室构建的毛细管电泳系统检测PCR产物
- 准备一根总长度为 8 cm、有效长度为 6 cm 的毛细管。
- 通过混合 100 µL 的 1% 羟乙基纤维素（HEC, w/v）、2 µL 的 100 倍稀释 SYBR Green I 染料以及 98 µL 超纯水，配制分离缓冲液，得到含 1x SYBR Green I 的 0.5% HEC（w/v）溶液。
- 使用真空泵将配制好的分离缓冲液填充至毛细管中。
- 在软件界面上输入进样电压（800 V）和进样时间（2.0 s），点击开始按钮，等待 PCR 产物在 100 V/cm 条件下通过电动力学方式注入毛细管（2.0 s）。
注意：此步骤中，PCR 产物置于负极，缓冲液置于正极。 - 在软件界面上输入直流电压（800 V），点击开始按钮，以100 V/cm的电场强度进行电泳运行。
注意：此步骤中，正极和负极均使用缓冲液。 - 当所有 DNA 片段在毛细管中完成分离后，点击停止按钮。
- 每次运行结束后，用无菌水冲洗毛细管 1 分钟。
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结果
图5 显示了PCR产物和DNA标记物的电泳图谱。图5A 为CF-PCR扩增产物的毛细管电泳（CE）结果，图5B 为热循环扩增产物的CE结果，图5C 为100 bp DNA ladder的CE结果。我们首先在CF-PCR系统中扩增了E. coli的目标基因，PCR溶液从芯片入口到出口耗时约10分钟30秒。E. coli目标扩增片段的大小为544 bp。扩增后的PCR产物在CE系统中进行分析，同时在相同实验条件下对100 bp DNA ladder进行毛细管电泳。PCR产物的大小可根据DNA ladder的电泳图谱进行评估。每个实验均重复三次以确保可重复性。图5 中的数据表明，分离后可观察到对应于E. coli PCR产物的峰，且微流控芯片中PCR产物的迁移时间与热循环仪中的结果一致。
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讨论
PCR 和毛细管电泳（CE）是核酸分析中两种常用的生物技术。本文描述了 大肠杆菌 以及使用自制的CF-PCR和CE系统对PCR产物进行检测。目标基因为 E. coli 由于高效的热传递，10分钟内成功完成了扩增。小于1,500 bp的DNA片段在8分钟内实现分离（图5这两种技术的最大优势在于，与传统的PCR和平板凝胶电泳方法相比，可大幅节省时间。研究人员需注意，使用后的CF-PCR微流控芯片需要清洗，CE系统应置于洁净且避光的环境中，以避免样品污染。本文介绍的基于微流控芯片的CF-PCR系统与CE系统易于制备，可能为实验室核酸分析提供一种简便的方法。然而，CF-PCR的一个局限性在于每次只能扩增和检测一个样本，这可能限制其广泛应用；为解决此问题，用户可开发集成化的CF-PCR与CE阵列微流控芯片。本研究所报道的平台在感染性疾病临床诊断和核酸研究领域具有广阔的应用前景。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了中国上海市科学技术委员会（编号：19ZR1477500 和编号：18441900400）以及上海理工大学（编号：2017KJFZ049）的经费支持，特此致谢。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 bp DNA Ladder | Takara Bio 公司 | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio 公司 | RR070A | |
| 10x TBE | 北京索莱宝科技有限公司 &有限公司 | T1051 | |
| 显影液 | Alfa Aesar，美国 | L15459 | |
| dNTP 混合物（2.5 μM | Takara Bio 公司 | RR070A | |
| EC-F | 中国上海桑谷生物技术有限公司 | ||
| EC-R | 中国上海 Sangon Biotech | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich，美国 | 9004-62-0 | |
| 异丙醇 | Aladdin，中国上海 | 67-63-0 | |
| 显微镜 | 日本 Olympus | BX51 | |
| 光刻 | SUSS MicroTec，德国 | MJB4 | |
| 光电倍增管 | 日本滨松光子学株式会社 | R928 | |
| 光刻胶 | MicroChem，美国 | SU-8 2075 | |
| PID 温度控制器 | 中国上海 | XH-W2023 | |
| 等离子清洗机 | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| 聚乙烯吡咯烷酮（PVP） | 中国上海阿拉丁 | P110608 | |
| 泵 | 哈佛仪器公司 | PHD2000 | |
| 硅胶管 | BIO-RAD，美国 | 7318210 | |
| 固态继电器 | 中国台湾 | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA聚合酶 | Takara Bio 公司 | RR070A | |
| 钢针 | 中国苏州中鑫启恒 | ||
| SYBR GREEN <图片替代文本"公式 1" src="/files/ftp_upload/63523/63523eq01.jpg" 样式="margin: auto;"/> | Solarbio，北京，中国 | SY1020 | |
| 温度传感器 | EasyShining Technology，中国成都 | TCM-M207 | |
| 模板（E. coli) | Takara Bio 公司 | AK601 | |
| Tween 20 | 中国上海阿拉丁 | T104863 | |
| 电压电源 | 美国纽约州梅迪纳 | TREK MODEL 610E |
参考文献
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. Continuous-flow thermal gradient PCR. Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5(2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
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重印与许可
