本研究描述了用于三维脑肿瘤模型的柔性叉指电极的开发，即 体外 培养 在卵内 模型，以及 体内 小鼠模型。该方法可用于评估脉冲电场在不同复杂程度下对肿瘤的影响。
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摘要
摘要
胶质母细胞瘤由于其高度侵袭性，难以通过标准肿瘤学疗法根除。基于脉冲电场（PEFs）的生物电治疗在提高治疗效率方面具有前景。然而，这类方法依赖于刚性电极，容易对组织造成急性和慢性损伤，尤其是在脑等软组织中尤为明显。本研究采用柔性电子器件向肿瘤递送脉冲电场，并通过荧光显微镜评估其生物学响应。在超薄透明的聚对二甲苯-C基底上制备叉指金电极，并在其表面涂覆导电聚合物PEDOT:PSS，从而获得一种可贴合、生物相容性良好的器件。利用多种生物模型考察了脉冲电场对肿瘤及其微环境的影响。首先，在电极表面培养胶质母细胞瘤单层细胞，以研究体外（in vitro）现象。作为中间步骤，建立了一种卵内（in ovo）模型，将工程化肿瘤类球体移植到鹌鹑胚胎膜中。由于缺乏免疫系统，该模型可形成高度血管化的肿瘤。在胚胎发育早期，其免疫系统尚未建立，因此肿瘤不会被识别为异物，能够快速生长并利用胚胎现有的血管系统自主形成新生血管，从而构成一种有价值的三维癌症模型。最后，在具有功能性免疫系统的完整生物体内，采用同源异种颅内移植小鼠模型评估柔性电极递送脉冲电场的效果。在植入柔性有机电极装置之前，将肿瘤类球体移植至转基因多荧光小鼠的脑内。通过密封的颅窗，可在数周时间内对脉冲电场治疗过程中的肿瘤及其微环境进行多光子成像。
引言
多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种高度侵袭性的肿瘤，因此很难通过手术切除、放疗和化疗等标准治疗方法根除。尽管采用多模式治疗，患者的预后仍然极差，大多数患者在确诊后1年内即出现疾病进展1,2。近年来，生物电治疗的发展显示出显著潜力，有望改善现有疗法。这类疗法通常在单次治疗过程中施加脉冲电场（PEF），以破坏肿瘤细胞膜的完整性及其微环境。这种细胞膜的破坏也称为电穿孔，其可逆性取决于电场强度和脉冲次数。不可逆电穿孔（IRE）作为一种非热性组织消融技术，通过电脉冲对细胞膜造成致命损伤，从而导致细胞死亡3。可逆电穿孔则应用于电化学治疗（ECT），这是一种成熟的技术，通过将脉冲电场与化疗药物联合使用，增强药物在癌细胞中的摄取4。此外，近期研究证实钙离子电穿孔可作为ECT的替代方案，具有高效、低成本且副作用更少的优势5。尽管取得了这些令人鼓舞的进展，目前PEF通常依赖刚性金属电极施加，而这类电极已知会对软组织造成损伤6。大脑对这类侵入性装置尤为敏感，其机械不匹配性可引发炎症反应和星形胶质细胞瘢痕形成7。
在此背景下，本文介绍了一种灵活的脉冲电场（PEF）递送系统，并结合从微加工到小鼠模型的胶质母细胞瘤三维模型。共形电极采用标准的薄膜微加工工艺制备，使用了聚对二甲苯-C（parylene-C）、金和PEDOT:PSS等柔软且生物相容性良好的材料8,9。采用叉指电极设计，在保持电极指间足够成像透明度的同时，覆盖较大的表面积10。在肿瘤模型方面，利用液体覆盖96孔板方法的一种改进技术，生成表达基因编码荧光报告基因的胶质母细胞瘤细胞三维球状体11。将这些球状体移植至鹌鹑胚胎的尿囊绒毛膜上，构建出一种已被广泛用于研究血管生成或药物毒理学的鸡胚内（in ovo）模型12,13。由于该阶段胚胎尚未发育免疫系统，肿瘤可在胚胎血管系统的作用下成功移植并实现血管化12。随后将柔性电极置于已血管化的肿瘤表面，以研究PEF递送对球状体及其血管系统的影响。最后，通过将工程化球状体植入小鼠模型的脑实质中，在包含肿瘤微环境和免疫系统的完整活体生物体内进一步探究这些效应14。将柔性电极置于植入部位上方，并用玻璃窗封闭颅骨开窗区域，从而实现持续数周的重复双光子成像。
这些方法将对从微电子工程到肿瘤学应用等多个领域的研究人员具有重要意义。该微加工方案可用于并适用于任何需要以PEDOT:PSS包覆薄膜金属电极的应用。此外，为评估抗肿瘤电治疗而开发的生物模型，将有助于普遍性地研究细胞、血管和免疫系统对植入材料反应的差异。
方案
所有实验操作均按照法国法律法规以及1986年11月24日欧洲共同体理事会关于实验动物护理和使用的指令（86/609/EEC）进行。动物研究已获得罗讷河口省兽医服务局（Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône）授权，并经普罗旺斯-蓝色海岸伦理委员会批准（Apafis # 22689-2019100414103054）。
1. 柔性器件的微加工（图1）
- 玻璃片的清洗
- 将玻片在2%皂液中进行超声处理15分钟，然后用水冲洗。
- 再次在80%纯丙酮和20%纯异丙醇的混合液中超声处理15分钟。
警告：这些溶剂有害且易燃。请佩戴个人防护装备（PPE），并在通风橱中操作。 - 用异丙醇冲洗载玻片，并用气枪吹干。
注意：在整个过程中，确保丙酮不会在基底上干燥。
- 金电极图案化（图1A)
- 使用派瑞林沉积系统沉积一层3 µm厚的派瑞林-C（parylene-C, PaC）图1Aa).
- 将清洗后的玻璃载玻片放入沉积室中。在制冷器表面喷洒肥皂液，待其干燥后，将其插入沉积系统的指定低温捕集器中。该防粘涂层有助于在沉积完成后轻松去除制冷器上的PaC。
警告：PaC 具有刺激性，可能危害健康。操作时需佩戴手套。 - 称取6 g PaC置于铝舟中，并放入炉内。抽真空至机器压力为10 mTorr，随后以下列参数开始沉积：T冷却器 = -100 °C, T熔炉 = 690 °C，T蒸发器 = 175 °C，以及 T腔室 = 135 °C
- 当沉积完成且汽化器温度低于40 °C时，关闭冷却器、汽化器和炉子。对设备放气并收集样品。
- 将清洗后的玻璃载玻片放入沉积室中。在制冷器表面喷洒肥皂液，待其干燥后，将其插入沉积系统的指定低温捕集器中。该防粘涂层有助于在沉积完成后轻松去除制冷器上的PaC。
- 通过氧气等离子体处理（100 W，50 sccm）活化样品表面30秒。
- 将经等离子体处理的样品以1,000 × g转速旋涂负性光刻胶 g 40秒。将样品置于110 °C的加热板上加热2分钟（图1Ab).
警告：光刻胶溶液易燃并具有刺激性；请佩戴个人防护装备，并在通风橱中操作。 - 在紫外宽带接触式光刻机的光路中放置一个i线滤光片，并通过带有叉指电极设计的掩模版对光刻胶进行曝光（图1Ac).
注意：使用版图编辑软件设计了间距为50或250 µm的叉指电极，并向一家通过激光光绘技术生产聚酯光掩膜的公司订购了光掩膜。 - 将上述样品置于加热板上，110 °C烘烤3分钟，随后冷却至室温5分钟。将样品浸入无金属离子显影液中3分钟，以去除未曝光的光刻胶。用去离子水冲洗样品，并用气枪吹干。图1Ad).
警告：显影液具有刺激性；请佩戴个人防护装备，并在通风橱中操作。 - 通过氧气等离子体处理（100 W，50 sccm）激活样品表面，持续60秒。
- 使用热蒸发仪沉积一层20 nm的铬作为粘附层，并沉积一层300 nm的金，步骤如下（图1Ae).
- 打开放气阀使蒸发仪腔体通气，用金属螺丝将样品（朝下）固定在上方的圆形托盘上。分别将铬和金放入专用的坩埚中。密封腔体并抽真空，使压强降至5·10⁻⁶ mbar以下。-6 Torr。启动样品台的旋转。
- 选择装有铬的坩埚，缓慢增加通过坩埚的电流，直至沉积速率达到 0.2 Å·s-1 达到后，打开快门，等待铬沉积20 nm。关闭快门，并缓慢降低电流至0 mA。
- 选择装有金的坩埚，缓慢增加通过坩埚的电流，直至沉积速率达到 0.2 Å·s-1 达到后，打开快门蒸发金，等待金沉积10 nm，然后将沉积速率提高至1.5 Å·s-1 直至沉积约300 nm为止。关闭快门，然后缓慢将电流降至0 mA。
- 沉积后让样品在室温下冷却15分钟。停止样品台旋转，对设备放气，然后取出样品。
- 将样品浸入盛有丙酮的烧杯中，将烧杯置于摇床平台上，设置转速为110 rpm，震荡15分钟以去除光刻胶。随后用异丙醇冲洗样品，并用气枪吹干图1Af).
- 通过氧气等离子体处理（100 W，50 sccm）活化样品表面30秒。
- 使用派瑞琳沉积系统（见步骤1.2.1）沉积一层3 µm厚的PaC绝缘层（图1Ag).
- 使用派瑞林沉积系统沉积一层3 µm厚的派瑞林-C（parylene-C, PaC）图1Aa).
- 概述开头（图1B)
- 以600 × g的转速对样品进行旋涂，使用正性光刻胶 g 35秒。将其置于110 °C的加热板上加热2分钟（图1Ba).
警告：光刻胶溶液易燃并具有刺激性；操作时须穿戴个人防护装备，并在通风橱中进行。 - 确保紫外宽带接触式光刻机的光路中没有i线滤光片，并使用带有器件轮廓的掩模版通过紫外宽带接触式光刻机对光刻胶进行曝光（图1Bb).
- 将样品浸入无金属离子的显影液中4分钟，以去除曝光的光刻胶。用去离子水冲洗样品，并用气枪吹干图1Bc).
- 使用反应离子刻蚀机对PaC的两层进行轮廓刻蚀（160 W，22分钟，O₂）2：50 sccm，CF4：10 sccm）图1Bd).
- 用丙酮去除残留的光刻胶，异丙醇冲洗，并用气枪吹干样品。
- 以600 × g的转速对样品进行旋涂，使用正性光刻胶 g 35秒。将其置于110 °C的加热板上加热2分钟（图1Ba).
- PEDOT:PSS 涂层（图1C)
- 以70 ×转速旋涂2%的肥皂溶液 g 35秒（图1Ca).
- 使用派瑞琳沉积系统（见步骤 1.2.1）沉积一层 3 µm 的 PaC 舍弃层（图1Cb).
- 以600 × g旋涂正性光刻胶 g 35秒。将样品置于110 °C的加热板上加热2分钟（图1Cc).
- 确保紫外宽带接触式光刻机的光路中没有i线滤光片，通过带有电极活性表面图案的掩膜版对光刻胶进行曝光图1Cd).
- 将样品浸入无金属离子的显影液中4分钟，以去除曝光的光刻胶。用去离子水冲洗样品，并用气枪吹干。图1Ce).
- 使用反应离子刻蚀机对PaC进行刻蚀，以暴露电极的活性表面（160 W，24分钟，O₂）2：50 sccm，CF4：10 sccm）。使用显微镜检查活性表面是否残留有PaC图1Cf).
- 用丙酮去除残留的光刻胶，异丙醇冲洗，并用气枪吹干样品。
- 使用氧气等离子体处理（100 W，50 sccm）对样品表面进行活化，处理时间为90秒。
- 将市售的化学聚合PEDOT:PSS分散液与5 vol%乙二醇（EG）和0.1 vol%十二烷基苯磺酸（DBSA）混合。超声处理15分钟。加入1 wt%的(3-缩水甘油基氧丙基)三甲氧基硅烷（GOPS），再超声处理5分钟。用1.2 µm滤膜过滤溶液。
警告：乙二醇（EG）具有刺激性，可能危害健康。DBSA 具有刺激性和腐蚀性。GOPS 具有腐蚀性。操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE），并在通风橱中处理这些化学品。
注意：总体积取决于样本数量。对于10张标准载玻片，至少准备20 mL溶液，对应以下组分：18.78 mL PEDOT:PSS、1 mL EG、20 µL DBSA 和 200 µL GOPS。 - 以150 × g转速旋涂四层PEDOT:PSS溶液 g 35秒。每层沉积后，将样品在热板上于110°C烘烤60秒，随后冷却至室温5分钟，再旋涂下一层（图 1Cg).
- 将样品浸入水中以去除牺牲性PaC层（图1Ch).
- 在140 °C下烘烤样品1小时。
- 将样品浸入去离子水中30分钟，以去除PEDOT:PSS薄膜中残留的皂类和低分子量化合物，并使样品从玻璃基底上脱落图1Ci).
- 连接与封装（图1D)
- 在涂有铜的聚酰亚胺薄膜上沉积一层薄薄的丙烯酸涂料（图1Da）。使用气溶胶以获得均匀的漆层（图1Db).
- 用激光在丙烯酸涂料上制图（75 kHz，7 W，1 次激光扫描，400 mm·s⁻¹）-1) 以获得两个矩形接触电极（5 mm × 15 mm；间距 1.5 mm）(图1Dc).
- 用饱和的30%（w/v）氯化铁（FeCl₃）溶液湿法刻蚀铜3) 在 40 °C 水中孵育 15 分钟（图1Dd).
警告：FeCl3 具有刺激性和腐蚀性；需在通风橱中戴手套操作。 - 用布蘸取丙酮轻轻擦拭以去除丙烯酸颜料（图1De).
- 用激光将图案化的聚酰亚胺薄膜切割成矩形（15 mm × 30 mm）（15 kHz，10 W，30 次激光扫描，130 mm·s⁻¹）-1) (图1Df).
- 使用三轴点胶机，在3 bar压力下通过直径为330 µm的针头点涂银浆（5 m·min⁻¹）-1) (图 1Dg).
注意：银浆具有刺激性，操作时需佩戴手套。 - 在双目显微镜下，使用镊子将PaC探针与聚酰亚胺薄膜对齐并固定图 1Dh).
注意：可在步骤 1.5.2 中制备对齐标记，以方便将探针定位在接触焊盘上。 - 在烘箱中于 140 °C 烘烤 2 小时。
- 放置一个1 cm2 接触焊盘上的聚酰亚胺保护胶带（图1Di).
- 将PaC探针与聚酰亚胺薄膜的连接界面浸入PDMS中图1Dj).
- 在50 °C下烘烤2小时。
- 移除保护胶带以打开接触焊盘（图1Dk).
注意：微加工 体外 设备相似，但步骤 1.2.1、1.3 和 1.5 必须跳过。
2. 胶质母细胞瘤 GCaMP6f 稳定细胞系的建立
- 慢病毒生产
- 在75 cm²的细胞培养瓶中，使用含4.5 g·L-1葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠，并添加10%无四环素胎牛血清（FBS）、100 units·mL-1青霉素和100 µg·mL-1链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），培养一种专为慢病毒生产优化的HEK 293T衍生细胞系，培养至少3天，直至细胞融合度达到80%。
- 移除培养瓶中的培养基。用10 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻冲洗细胞。
- 加入1 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液，在37 °C孵育5分钟。
警告：胰蛋白酶/EDTA溶液具有健康危害性；操作时应穿戴个人防护装备，并在通风橱中进行。 - 加入8 mL培养基，轻轻吹打形成细胞悬液。
- 计数细胞，并将4 × 106个细胞接种至培养皿中，加入8 mL培养基。
- 次日，将含有GCaMP6f基因及赋予嘌呤霉素抗性的筛选标记质粒25 µg溶于总体积为600 µL的水中。将其加入转染试剂管中。在3,000 rpm下涡旋10秒，室温孵育10分钟，以形成纳米颗粒。
- 将管中内容物逐滴加入HEK 293T细胞培养物中，手动轻轻摇晃混匀。在37 °C孵育至少4小时。
- 用新鲜培养基替换含纳米颗粒复合物的旧培养基，将细胞放回37 °C继续培养。
- 三天后，收集上清液，在500 × g下离心10分钟以去除细胞碎片。收集含有病毒颗粒的液体部分。
备注：可通过定量慢病毒滴度检测确认上清液中的病毒产量，病毒可于-80 °C保存至少2年。
- 胶质母细胞瘤细胞转导
- 在75 cm²细胞培养瓶中，使用含1 g·L-1葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠，并添加10%无四环素FBS、100 units·mL-1青霉素和100 µg·mL-1链霉素的DMEM培养胶质母细胞瘤细胞，至少培养4天。
- 弃去培养基，将步骤2.1.9中获得的上清液加入靶细胞中。
- 在培养基中加入5 µg·mL-1的六亚甲基溴化铵以提高转导效率。在37 °C孵育6小时。随后更换为10 mL新鲜培养基。
警告：六亚甲基溴化铵具有刺激性，操作时应戴手套。
- 稳定细胞系的建立
- 转导后2至3天，加入10 mL含1 g·L-1葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠、10% FBS、100 units·mL-1青霉素、100 µg·mL-1链霉素并补充嘌呤霉素的DMEM，以杀死未转导的细胞。在此培养基中继续培养至少3天。
警告：嘌呤霉素具有刺激性，操作时应戴手套。
备注：在转导前，需通过将细胞培养于含不同浓度嘌呤霉素的推荐培养基中测试细胞对嘌呤霉素的敏感性。一天后在显微镜下观察细胞状态，选择使大多数细胞死亡但仍有少量存活的浓度，以确保抗生素毒性不过强，避免同时杀死转染成功的细胞。 - 移除培养基，用10 mL PBS冲洗细胞。
- 加入1 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液，在37 °C孵育5分钟。
- 加入8 mL培养基，轻轻吹打形成细胞悬液。
- 取100 µL细胞悬液，使用细胞计数仪测定细胞浓度。用带60 µm传感器的手持式自动细胞计数器吸取50 µL细胞悬液进行检测。
- 以每孔1个细胞的密度接种至96孔板。例如，若细胞浓度为1 × 103个/mL，则每孔加入1 / (1 × 103)，即0.001 mL细胞悬液。每个孔均接种以提高成功率，并补加培养基至每孔总体积为200 µL。
- 一天后，找出仅含一个细胞的孔，并检测其荧光（λexc = 490 nm，λem = 530 nm）。标记仅含有一个转染细胞的孔。继续培养数天，直至孔内细胞接近完全融合。
- 弃去培养基，用200 µL PBS冲洗细胞。加入100 µL 0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液，在37 °C孵育5分钟。
- 加入100 µL培养基，轻轻吹打形成细胞悬液。将细胞悬液转移至培养皿中。加入5 mL培养基，继续培养数天，直至培养皿中细胞接近完全融合。
- 弃去培养基，用5 mL PBS冲洗细胞。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液，在37 °C孵育5分钟。
- 加入6 mL培养基，轻轻吹打形成细胞悬液。将细胞悬液转移至T25培养瓶中。继续培养数天，直至培养瓶中细胞接近完全融合。
- 弃去培养基，用5 mL PBS冲洗细胞。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液，在37 °C孵育5分钟。加入7 mL含1 g·L-1葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠，并补充10% FBS、100 units·mL-1青霉素和100 µg·mL-1链霉素的DMEM。轻轻吹打形成细胞悬液。
- 将细胞悬液分至四个T25培养瓶中（每瓶2 mL），每瓶再加入5 mL培养基。继续培养数天，直至各瓶细胞接近完全融合。
- 对其中三个培养瓶重复步骤2.3.12，保留最后一个培养瓶用于步骤3.1.3。将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，在150 × g下离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于900 µL溶液中。轻柔混匀以维持细胞悬液的均一性。
- 将细胞悬液转移至冻存管中。加入100 µL二甲基亚砜。将冻存管置于-80 °C过夜。随后将冻存细胞转移至液氮中，用于后续实验。
备注：可通过在培养基中加入5 µM离子霉素钙盐，并在荧光显微镜下检测荧光增强情况（λexc = 490 nm，λem = 530 nm）来评估转染效率。
- 转导后2至3天，加入10 mL含1 g·L-1葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠、10% FBS、100 units·mL-1青霉素、100 µg·mL-1链霉素并补充嘌呤霉素的DMEM，以杀死未转导的细胞。在此培养基中继续培养至少3天。
3. 三维模型
- 类球体培养
- 制备1% (w/v) 琼脂糖溶液于去离子水（DI水）中。
- 将100 g琼脂糖粉末加入100 mL去离子水中，放入微波炉加热至粉末完全溶解。定期搅拌溶液以避免结块。将溶液在120 °C条件下高压灭菌20分钟。
- 从高压灭菌器中取出后，小心地向96孔板的每个孔中加入75 µL琼脂糖溶液。将溶液滴加至孔壁侧面以形成弯月面，从而获得非黏附性圆底。室温下静置15分钟使其凝固。
- 将步骤2.3.14中获得的培养瓶中的细胞（见步骤2.3.12）从培养表面解离下来。
- 每孔接种10,000个胶质母细胞瘤细胞，并用含1 g·L-1葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠的DMEM培养基补足至每孔总体积为150 µL，该培养基还补充有10%胎牛血清（FBS）、100单位·mL-1青霉素和100 µg·mL-1链霉素。
- 将细胞在37 °C培养箱中孵育，3天内不移动培养板。之后，使用多通道移液器每2天更换一半培养基，直至进行后续实验。移液时将枪头保持在孔的上部，以避免损伤琼脂糖或类球体本身。
注意：类球体的大小取决于接种的细胞数量和细胞系类型，因此需根据具体实验条件进行调整。
- 制备1% (w/v) 琼脂糖溶液于去离子水（DI水）中。
- 鸡胚内（in ovo）模型
- 将受精的日本鹌鹑蛋（C. japonica）置于37 °C、57%湿度的孵育箱中，放置于带有自动旋转装置的托盘上，每2小时翻转一次。此日记为胚胎发育第0天（ED0）。
- 用70% (w/v)乙醇清洗塑料称量皿，取出后在通风橱下干燥。
注意：自此步骤起，实验不再在无菌条件下进行。但需保持清洁环境，以防止胚胎上霉菌生长。 - 在ED3时，使用经70% (w/v)乙醇预清洗的细尖镊子轻轻打开蛋壳，将胚胎倒入塑料称量皿中，用另一个称量皿盖住，并置于37 °C标准湿化培养箱中继续孵育3天。
- 在ED6时，用23 G针头在绒毛尿囊膜（CAM）上制造一个小切口。
- 使用移液器将一个培养7天的类球体置于切口处，然后将胚胎放回培养箱继续孵育3天，直至进行后续实验。
注意：可向胚胎眼部注射荧光染料以可视化血管结构。 - 实验当天，使用显微操作器将柔性探针放置于血管化肿瘤的表面。
- 体内（in vivo）模型
注意：本实验方案部分改编自先前发表的参考文献14。使用成年多色荧光AMU-Neuroinflam小鼠（B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD）；这些小鼠通过转基因表达ECFP标记Thy1+神经元的一个亚群，通过转基因表达EGFP标记外周LyzM+炎症细胞，并在Cd11c+启动子控制下表达EYFP标记小胶质细胞的一个亚型。简言之，在任何处理或注射前，先用1.5%异氟烷对动物进行2分钟轻度镇静。手术前，使用氯胺酮（120 mg/kg；腹腔注射）和赛拉嗪（12 mg/kg；腹腔注射）对动物实施麻醉。随后，在耳部局部涂抹3%利多卡因凝胶 以缓解立体定位支架固定过程中可能引起的耳部疼痛。接着，在手术 部位注射0.25%布比卡因溶液 以减轻开颅手术引起的疼痛。小鼠准备就绪后，按照参考文献14所述进行直径为4 mm的开颅手术。使用26 G针头在开颅区域中央的硬脑膜上打孔，并使用参考文献14中描述的注射系统将肿瘤类球体注入。此外，如本文所述，在用玻璃窗封闭开颅部位前，将柔性电极放置于表达GCamp6或DsRed的肿瘤类球体表面。- 滴加一滴杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），使其覆盖开颅区域。将柔性电极置于DPBS液滴上，并轻轻将探针背面的接触垫放置于小鼠背部（图4B）。
注意：操作时佩戴无菌手套并采用“仅接触枪头”技术。若接触非无菌表面，需立即更换手套。操作过程中提供适当的保温支持。 - 用一小片滤纸轻触DPBS液滴，吸除多余液体，直至探针能平整贴合硬脑膜并顺应脑组织曲率。确保电极下方保留一层薄薄的DPBS，且液体不从电极边缘溢出。这可在后续步骤中防止胶水溢出形成屏障。
注意： 所有器械在使用前均需灭菌。 - 在探针表面滴加少量硅胶粘合剂，并覆盖一片直径5 mm的圆形盖玻片。轻压盖玻片，使硅胶均匀分布，并使盖玻片与探针之间的距离最小化。继续压紧盖玻片30秒，使硅胶充分固化。
- 为固定盖玻片，迅速在其侧面涂抹瞬间胶，并持续下压直至胶水完全固化。
- 使用牙签在探针颈部涂抹瞬间胶，注意使胶水渗入颈部下方，以提供稳定支撑。
- 用牙科水泥覆盖颅骨，构建慢性固定帽。需特别注意仅覆盖盖玻片的边缘部分。
- 抬起探针背部，在探针颈部下方填充水泥。在水泥固化前将探针放回原位。用钝头镊子轻轻下压探针颈部，使其表面与盖玻片齐平，避免在实验中干扰显微镜物镜。
- 在探针颈部顶部覆盖不超过1.5 mm厚的牙科水泥层，以牢固固定探针。围绕盖玻片周围1–2 mm处构建一个水泥围堰，形成高约1.5 mm的环形凸起，用于容纳双光子成像所需的浸没液（图4C）。
- 待水泥完全固化后，皮下注射术后镇痛药布托啡诺（0.05 mg/kg，每10 g体重注射0.1 mL），并将动物置于温暖环境中直至苏醒。包括靠近红外灯泡以及用纸巾包裹动物。
注意： 在小鼠所在位置放置温度计以监测体温。 - 使用恒电位仪在1–10 kHz频率范围内测定阻抗。
- 让动物术后恢复至少10天。手术后立即给予抗炎药物，并持续监测动物状态，以提供适当的术后镇痛。
- 滴加一滴杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），使其覆盖开颅区域。将柔性电极置于DPBS液滴上，并轻轻将探针背面的接触垫放置于小鼠背部（图4B）。
4. 脉冲电场（PEF）递送与成像
- 将标本置于荧光显微镜下观察。对于3D模型，肿瘤仅能从顶部观察。
注意：对于 在卵内 模型在落射荧光显微镜下进行实验（也可使用双光子显微镜），而对 体内 在双光子显微镜下进行模型观察图6). - 将脉冲发生器使用弹簧针连接器连接到器件的接触焊盘上（体外）或鳄鱼夹（在卵内 和 在体内) (图4A）。设置所需的参数（脉冲次数、电压、脉冲持续时间、频率），然后运行发生器以施加脉冲电场（PEFs）图 4A）。同时测量荧光，以实时观察PEFs的作用效果。
结果
本方案适用于两种胶质母细胞瘤模型，其中集成了柔性的脉冲电场（PEF）递送系统。在完成微加工和封装步骤后，通过电化学阻抗谱（EIS）在生理盐水中对柔性电极进行表征，以评估并验证其性能。PEDOT:PSS涂层电极表现出典型的由截止频率分隔的容抗主导区和电阻主导区，而未涂层电极仅显示容抗行为（图2）。
采用液体覆盖96孔板法的一种改良方法，培养由稳定表达荧光细胞内钙离子报告蛋白的转染胶质母细胞瘤细胞构成的三维肿瘤。可通过明场显微镜观察类球体的生长情况（图3；ED 0）。获得球形且致密的类球体所需时间至少为2至3天，具体时长取决于细胞系类型及接种的细胞数量。
在in ovo模型中，将类球体移植到鹌鹑胚胎的绒毛尿囊膜上（图3；ED 6）。几天后可通过荧光显微镜评估移植是否成功，因为活细胞含有胞内钙离子，因而具有荧光信号（图3；ED 9）。通过向血管内注射荧光染料，可在荧光显微镜下观察肿瘤的血管化情况（图3；ED9）。然而，由于类球体结构非常致密，可能无法始终清晰观察到肿瘤内部的血管。将柔性交错电极放置于已血管化的肿瘤表面（图3；ED 9），并连接至脉冲发生器。放置探针时应轻柔操作，以避免胚胎出血；否则荧光染料可能扩散，从而阻碍成像观察。通过测量电路中的电流，可验证脉冲是否正确传递至生物环境。对这些in ovo模型进行成像，可实现实时监测脉冲电场（PEFs）对三维胶质母细胞瘤肿瘤中胞内钙离子的影响，以及对肿瘤血管系统所诱导的血管收缩效应，同时避免了包括免疫系统在内的其他细胞类型的干扰15。
对电穿孔效应在胶质母细胞瘤中作用的研究也可在更为完整且具有预测性的模型中进行。事实上， 体内 上述模型14 将一个三维胶质母细胞瘤移植到小鼠脑实质中图4）。肿瘤注射部位被一个交联葡聚糖凝胶半球形栓塞物封闭，以模拟肿瘤生长过程中所受的生理性生物物理约束。尽管在参考文献中已有描述14需要再次强调的是，将葡聚糖半珠精确地用超级胶水粘附至硬脑膜上至关重要；否则，肿瘤可能通过未封闭的硬脑膜逸出，并完全覆盖大脑表面，导致无法成像。对于任何慢性成像实验而言，颅窗愈合过程中发生的组织向内生长都会构成严重障碍，因为新生组织不透明，会使图像变得模糊或无法使用。因此，在插入并粘牢半珠后，必须仔细地在开放颅窗的侧壁周围均匀涂覆一层薄薄的超级胶水，密封整个腔壁，同时防止胶水滑落或流入硬脑膜表面。当柔性探针放置于肿瘤注射部位上方时，探针下方不得残留气泡，原因有二：其一，气泡存在时无法进行成像；其二，气泡具有绝缘作用，会改变电刺激的电学特性。在完成上述各项预防措施后，需将一块玻璃窗用胶固定于颅骨上，封闭开颅部位，以实现持续数周的慢性成像。由于肿瘤由表达GCaMP或DsRed的细胞构成，可通过荧光显微镜确认注射效果。电极植入后，必须测量其电化学阻抗，以验证电极性能。与在生理盐水溶液中测得的阻抗相比，阻抗值会有所升高 体内 由于生物环境的存在，在100 Hz以上的频率下图5）。通过双光子显微镜，可在数周时间内透过透明基质观察并表征具有血管化的神经实质及肿瘤浸润情况。图6). 例如，使用在特定细胞（免疫细胞和神经元）中表达荧光蛋白的转基因动物，可以揭示仅由电极植入所诱导的轻微炎症反应图6A) 或显示在胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤表面植入经PEF刺激的电极后26天存在小胶质细胞和单核细胞图6B1）。在后一种情况下，肿瘤周围及内部均发现有外周单核细胞来源的细胞以及脑内常驻的小胶质细胞图6B2）。在施加PEF的当天，可将柔性电极的接触垫直接连接至双光子显微镜下的脉冲发生器。总体而言，该模型可用于研究生物电治疗对参与脑肿瘤发育的多种细胞类型随时间变化的影响，作用深度可达约 500 µm.
图1：柔性电极的微加工工艺。（A）金电极图案化与聚对二甲苯C基底。（B）轮廓开口。（C）PEDOT:PSS涂层。（D）连接与封装。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：柔性金电极与PEDOT:PSS涂层冷电极在盐溶液中的电化学阻抗谱。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：该 在卵内 胶质母细胞瘤模型 ED 0：在明场显微镜下观察到的类球体。ED 3：鹌鹑胚胎去壳培养，开窗后第3天。ED 6：在明场显微镜下观察到的植入绒毛尿囊膜（CAM）的肿瘤。ED 9：柔性装置置于血管化肿瘤上（肿瘤呈绿色，血管呈红色）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 4：体内 应用。 （A）体内 实验示意图。（B）盖玻片和丙烯酸树脂封装前的探针放置状态。（C）完成探针植入后的状态。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：柔性金电极在盐水溶液中的电化学阻抗谱与植入式探针的比较。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：通过电极进行的活体多光谱双光子成像。（A）对照组多荧光AMU-Neuroinflam小鼠在植入电极后第3天健康脑表面的拼接图像。青色显示第5层锥体神经元的树突分支，绿色显示募集的粒细胞和单核细胞，黄色显示活化的小胶质细胞和树突状细胞。粉红色显示由于热量积聚引起的红外扩散。（B1）与（A）类似图像，但在皮层内深200 µm处植入肿瘤类球体并立即植入电极后第26天。注意绿色和黄色免疫细胞的积聚。（B2）与（B1）类似图像，但位于电极表面下方100 µm处。注意在红色肿瘤团块周围区域存在蓝色神经元树突分支，肿瘤团块本身被黄色小胶质细胞和树突状细胞浸润。深蓝色显示来自肿瘤周围胶原的二次谐波信号。（B3）（B2）的放大视图，显示肿瘤附近存在中间神经元胞体（由箭头指示）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本研究中描述的方法能够实现整合了脉冲电场（PEF）递送系统的脑肿瘤模型，用于研究脉冲电场在不同生物组织层次上的效应。微加工工艺包含标准的薄膜制备流程，可在电极设计上提供高度的自由度，并可根据具体应用进行调整。在某些情况下，制造过程结束后增加一步额外的热退火处理，有助于减少电极在加工过程中产生的弯曲现象。
使用稳定表达荧光钙指示剂的胶质母细胞瘤细胞系可避免与染料递送和滞留相关的所有问题，尤其是在非常致密的三维肿瘤中16。事实上，与传统的化学荧光钙指示剂相比，该方法可在较长时间内维持较高的表达水平17。本方案可应用于多种细胞系，因其已广泛用于神经活动成像11。本文中使用了人源和小鼠源细胞系（分别为U87和Gl261，用于在免疫缺陷或免疫健全小鼠体内进行移植）。然而，近期研究表明，U87细胞系经过多年的细胞培养已积累大量突变，与原始细胞存在差异，从而影响实验的可重复性18。用于制备三维肿瘤的方法具有高通量、可重复性强的优点，并可根据细胞系类型、接种细胞数量及培养时间生成特定尺寸的类球体19。但这些类球体结构致密，在对肿瘤核心区域进行成像时存在不利影响。
在研究脉冲电场（PEF）对三维肿瘤及其血管系统的影响时，in ovo 模型可作为初步研究手段，其优势在于避免了脑组织中其他细胞类型的相互作用。该模型成本低、操作快速、通量高，且相较于动物模型面临的伦理问题更少。在整个实验过程中必须保持胚胎的完整性，因为任何损伤都可能影响胚胎存活及成像质量。打开鹌鹑蛋时需格外小心，以避免损伤胚胎膜。移植肿瘤组织及放置柔性电极时也必须谨慎操作，防止出血导致胚胎死亡。通过向血管内注射荧光染料，可利用荧光显微镜同时观察肿瘤细胞和血管生成情况。眼内注射时需精细操作，防止染料泄漏至胚胎液中，否则可能造成背景残留荧光，降低成像质量。该模型还可用于追踪药物摄取过程，因其可直接进入循环系统。然而，由于胚胎最长存活时间为12天，因此仅能进行约7天的观察，显著短于in vivo模型21。
在动物因突然减重20%而达到伦理实验终点之前，体内脑肿瘤 模型可被监测4至5周。该模型耐受性良好，只要电极的连接尾部不过长，即可保持稳定。否则，动物容易抓挠翻转连接器，可能导致其最终撕裂，从而无法与刺激器再次连接。尽管如此，这4周的时间足以覆盖胶质母细胞瘤发展的各个阶段。通过在不同时间点比较同一感兴趣体积内的肿瘤细胞密度，可以观察到肿瘤生长动力学的演变过程。特别是，在免疫转换时期观察到肿瘤生长增强22。在存在刺激电极的情况下进行类似研究，将有助于了解脉冲电场（PEF）对肿瘤增殖速率以及肿瘤对免疫清除敏感性的影响。与卵内模型相比，体内模型可被视为研究免疫细胞对肿瘤进展影响及其在PEF治疗效应中所起作用的有价值的临床前模型。本方案改编自先前发表的文章，并在放置颅窗前增加了柔性电极装置14。由于初始刺激预期会诱导细胞死亡并引发免疫反应的持续失调，因此可通过双光子显微镜进行直接和后续观察，从而表征肿瘤的急性和慢性生物电治疗效应。
在双光子显微镜下，柔性探针的连接部分易于接触。因此，可以根据观察到的对神经组织和/或靶向细胞的影响，实时调整电刺激参数，这类似于医生在观察患者磁共振成像（MRI）或计算机断层扫描（CT）图像的同时进行介入手术操作。最后需要注意的是，使用瞬干胶和硅胶对脑部电极进行仔细密封至关重要，以防止组织再生。
综上所述，本文所述方案代表了一种利用柔性有机聚合物电极研究脉冲电场疗法对胶质母细胞瘤模型作用的创新模型。这两种模型具有不同水平的复杂性，因而可将细胞、血管或免疫效应分离开来，以更深入地理解其作用机制。贴合性、浅表电极可在破坏肿瘤微环境、引发血管收缩或细胞内钙离子失调的同时，减少医源性损伤15。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究工作得到了法国国家科研署（ANR-18-CE19-0029）的支持。作者衷心感谢 S.M. Bardet 在构建稳定表达 GCaMP6f 的细胞系方面所做的贡献，以及 D. O'Connor 在 in ovo 模型实验中提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (3-环氧丙氧基丙基)三甲氧基硅烷 | Sigma | 440167 | GOPS |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 4-十二烷基苯磺酸 | Sigma | 44198 | DBSA |
| 96孔板 | Falcon | 353075 | |
| 丙酮 | 技术 | 530 | |
| 丙烯酸树脂 | Fischer Scientific | NC1455685 | |
| 琼脂糖 | Sigma | A9539 | |
| 高压灭菌 | Tuttnauer | 3150 EL | |
| AZ 10XT | 微化学品 | 正性光刻胶 | |
| AZ 826 MIF 显影剂 | 默克 | 10056124960 | 无金属离子的负性光刻胶显影液 |
| AZ 开发者 | 默克 | 10054224960 | 无金属离子的正性光刻胶显影液 |
| AZ nLof 2070 | 微化学品 | 负性光刻胶 | |
| 布托啡诺 | Axience | ||
| 卡洛芬 | Rimadyl | ||
| Sorvall Legend X1R 离心机 | 赛默飞世尔科技 | 75004260 | |
| CMOS相机 Prime 95B | 光度测量 | ||
| CO2 培养箱 HERAcell 150i | 赛默飞世尔科技 | ||
| DAC板 | 国家仪器公司 | USB 6259 | |
| Dé共喷雾 Pébéo | 培养 | 3167860937307 | 黑色丙烯酸涂料 |
| 德克斯特兰-德克萨斯红 70,000 | 赛默飞世尔科技 | D1830 | |
| 芯片粘接胶 "埃皮纳勒" | 日立 | EN-4900GC | 银浆 |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D2438 | |
| 分液机 | Tianhao | TH-2004C | |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基 + GlutaMAX™- I | Gibco | 10567-014 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Sigma | D6429 | |
| Egg incubator COUVAD'OR 160 | lafermedemanon.com | ||
| 乙二醇 | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | 6881.1 | |
| 日本鹌鹑受精卵 | Japocaille | ||
| 胎牛血清 | VWR | S181BH | |
| 烧瓶 | 格雷纳 | 658170 | |
| 荧光体视显微镜 | Leica MZFLIII | ||
| Gl261 | DSMZ | ACC 802 | |
| 金颗粒 - 直径 3 mm × 厚度 6 mm | Neyco | ||
| 手持式自动细胞计数仪 | Millipore | PHCC00000 | |
| 加热干燥箱 | Memmert | UF110 | |
| 溴化六甲密胺（Hexadimethrine Bromide，Sequa-brene） | Sigma | S2667 | |
| 热板 Delta 6 HP 350 | Süss Microtec | ||
| 照明系统 pE-4000 | CoolLed | ||
| 可调谐飞秒红外激光器（Maï-Taï) | Spectra Physics（美国） | ||
| 钙离子霉素（钙盐） | Sigma | I3909 | |
| Kapton 胶带 SCOTCH 92 33x19 | 3M | 聚酰亚胺保护胶带 | |
| 实验室自制脉冲发生器 | |||
| Labcoter 2 聚对二甲苯沉积系统 PDS 2010 | 脊髓刺激 | ||
| Lenti-X 293 T 细胞系 | Takara Bio | 63218 | 经优化用于慢病毒生产的 HEK 293T 衍生细胞系 |
| Lenti-X GoStix Plus | Takara Bio | 631280 | 定量慢病毒滴度检测 |
| 掩模对准器 MJB4 | Süss Microtec | ||
| Micro-90 浓缩清洗液 | 国际产品 | M9050-12 | |
| 显微镜载玻片 76 x 52 x 1 mm | Marienfeld | 1100420 | |
| 30G针头 | BD Microlance 3 | 304000 | |
| PalmSens4 恒电位仪 | PalmSens | ||
| 聚对二甲苯-C ：对二氯二甲基对二亚甲基苯 | 脊髓刺激 | 300073 | |
| PCB 处理槽 | Mega Electronics | PA104 | |
| PEDOT:PSS Clevios PH 1000 | Heraeus | ||
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 培养皿 | Falcon | 351029 | |
| pGP-CMV-GCaMP6f | Addgene | 40755 | 质粒 |
| 磷酸盐缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | D8537 | |
| 等离子体处理系统 PE-100 | 等离子体刻蚀 | ||
| PlasmaLab 80 反应离子刻蚀机 | Oxford Instruments | ||
| 塑料口罩 | 塞尔巴 | ||
| 塑料称量船 64 x 51 x 19 mm | VWR | 10770-454 | |
| 聚二甲基硅氧烷：SYLGARD 184 硅胶弹性体试剂盒 | 陶氏化学 | 1673921 | |
| 聚酰亚胺铜膜 60 µm（Kapton） | 古德费洛 | IM301522 | |
| 丙-2-醇 | 技术 | 574 | |
| Protolaser S | LPKF | ||
| 嘌呤霉素 | Gibco | A11103 | |
| 直径5毫米圆形盖玻片 | Fischer Scientific | 50-949-439 | |
| Scepter 传感器 - 60 µm | 默克密理博 | PHCC60050 | |
| 硅胶粘合剂 Kwik-Sil | World Precision Instruments | ||
| 旋涂仪 | Süss Microtec | ||
| 旋涂仪 | 劳雷尔 | WS-650 | |
| 超级胶水 | 办公用品店 | ||
| 无四环素的 fœ胎牛血清 | Takara Bio | 631105 | |
| 热蒸发仪 Auto 500 | Boc Edwards | ||
| 双光子显微镜 | Zeiss LSM 7MP | ||
| U87-MG | ATCC | HTB-14 | 人胶质母细胞瘤细胞 |
| 超声波清洗机 | VWR | ||
| Vortex VTX-3000L | LMS | VTX100323410 | |
| Xfect 单次使用试剂 | Takara Bio | 631447 | 转染试剂 |
参考文献
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重印与许可
