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一种基于荧光的膜电位检测方法，用于高通量功能研究两种上皮细胞系中的两种内源性离子通道

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DOI：

10.3791/63528

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2022年6月22日

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1Molecular Medicine, Hospital for Sick Children, 2Cell Biology, Hospital for Sick Children, 3Department of Physiology, University of Toronto, 4Department of Paediatrics, University of Toronto, 5Department of Biochemistry, University of Toronto

本文内容

摘要

本方案描述了一种通过测量膜电位变化来研究生电性膜蛋白的方法。该检测方法为功能性读取上皮细胞系中内源性表达的多种离子通道提供了平台。

摘要

基于荧光的研究方法适用于培养细胞的高通量酶标仪检测。该方法已广泛用于以在细胞（如HEK-293细胞）中过表达的重组离子通道蛋白为靶点的药物筛选研究。然而，目前越来越强调使用与组织相关的细胞系来研究小分子干预的作用。以下方案描述了一种基于荧光的膜电位检测方法的优化，用于研究在上皮细胞系中内源性表达的离子通道。该膜电位检测方法详细阐述了一种高通量检测囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）氯离子通道活性的技术，适用于两种常用的上皮细胞系Caco-2和Calu-3。此外，本文还描述了该系统的一种新应用，即在同一上皮细胞系中以高通量形式检测上皮钠离子通道（ENaC）的活性。综上所述，这些基于荧光的检测方法为在相关细胞环境中研究靶向两种上皮离子通道的小分子调节剂提供了一个稳健且灵活的平台。

引言

基于荧光的高通量活性检测方法在筛选能够调节重组通道蛋白活性的小分子化合物方面已表现出高度有效性，这些小分子化合物具有成为未来治疗药物的潜力1,2,3,4。针对离子通道调节剂的小分子文库筛选常用方法之一是通过检测膜电位的变化来实现。通常，这类筛选利用在HEK-293细胞等异源表达系统中表达的重组通道蛋白进行5,6,7。

然而，需要在相关细胞类型中对"命中结果"进行验证。我们建议，在内源性表达目标通道的相关细胞系中进行二次筛选是可取的。此类二次筛选将有助于鉴定出那些最有可能在最终验证实验中有效的调节剂，而这些验证实验依赖于较难获取的人体原代组织。

还需要具有灵活性的检测系统，以报告同一种组织类型中多个离子通道靶点的活性。例如，已有大量已发表的文献支持CFTR与ENaC在功能上相互作用8,9,10。尽管目前已知若干经过深入研究的上皮细胞系均表达CFTR和ENaC，但迄今为止，尚无文献描述可同时对两者进行高通量研究的检测条件。

这种基于荧光的膜电位检测方法具有较高的通用性，它采用外源性化学探针来测量CFTR和ENaC的功能，从而避免了使用基因编码探针的需要11。作为原理验证，本文以两种常用的上皮细胞系为例，重点阐述了检测CFTR和ENaC通道活性所必需的关键步骤。

方案

1. 细胞铺板与分化

  1. 在 T-75 培养瓶中，使用含 20% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素（pen/strep）的 EMEM 培养 Calu-3 和 Caco-2 细胞。
  2. 当细胞达到 80–100% 汇合度时，吸除 T-75 培养瓶中的培养基。
  3. 用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤细胞一次。
  4. 向细胞单层加入 2 mL 预热的 0.25% 胰蛋白酶/0.1% EDTA，将 T-75 培养瓶置于 37 °C 环境中约 5 分钟，使细胞从培养瓶表面脱落并解离为单细胞悬液。
  5. 当细胞从瓶壁脱落时，加入 8 mL 培养基（步骤 1.1）中和反应，最终获得总体积为 10 mL 的细胞悬液。
    注意：使用 10 mL 移液管通过机械吹打将细胞团块解离为单细胞悬液。
  6. 将细胞以 30–40% 汇合度接种至 96 孔板（约 140,000–150,000 个细胞/孔）或 384 孔板（约 45,000–50,000 个细胞/孔）。
    1. 若接种一个完整的 96 孔板，将 1.5 mL 细胞悬液加入含 18.5 mL 培养基的 50 mL 离心管中。混匀后，向每孔加入 200 µL 细胞悬液。
    2. 若接种一个完整的 384 孔板，将 1 mL 细胞悬液加入含 17 mL 培养基的 50 mL 离心管中。混匀后，向每孔加入 50 µL 细胞悬液。
      注意：确保无细胞团块存在，且单个细胞在各孔中分布均匀。
  7. 接种后每 2 天更换一次培养基。若不同孔之间的细胞未能同步达到汇合状态，则弃用该板并重复步骤 1.5。
  8. 接种后，等待细胞在 3–5 天内达到 100% 汇合度。在进行功能研究前 24 小时更换培养基。

2. CFTR 功能检测缓冲液溶液的配制

  1. 使用所列试剂配制无钠无氯缓冲液 表1.
  2. 将试剂加入组织培养级双蒸水中2O (ddH₂O)2O）。在室温下搅拌过夜（使用密闭容器以避免蒸发），使试剂充分溶解。
  3. 当溶液稳定后，测定其pH值。如果溶液的pH值超过7.4，则加入1 M N用 N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）溶液逐滴调节 pH 至 7.4。
    注意：不要用盐酸调节溶液的pH，因为溶液必须保持无氯。
  4. 让溶液继续混合30分钟，然后测定溶液的渗透压。
    1. 将缓冲液的渗透压调节至生理范围 300 ± 5 mOsm/kg。
  5. 过滤后将缓冲液储存于无菌瓶中。
    ​注意：该溶液可在 4 °C 下保存长达 6 个月。若保存时间超过 6 个月，使用前需在室温下检测 pH 值和渗透压。

3. CFTR 功能检测

  1. 将膜电位染料溶解于无钠无氯缓冲液中（0.5 mg 染料/1 mL 缓冲液），并加热至 37 °C。
    注意：避免将膜电位染料粉末暴露于光照下。
  2. 从 Calu-3 或 Caco-2 细胞单层中移除培养基，并向每孔加入含染料的溶液（96 孔板每孔 195 µL，384 孔板每孔 95 µL）。
    注意：384 孔板每孔最多可加入 112 µL。
  3. 将细胞在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 35 分钟，使细胞负载染料。
  4. 将负载染料的细胞转移至荧光酶标仪。从板底部进行荧光检测，激发波长 = 530 ± 5 nm，发射波长 = 560 ± 5 nm。
  5. 首先以 30 秒为间隔，连续采集 5 分钟的基础荧光读数。
  6. 向每孔加入 5 µL 低浓度佛司可林（forskolin）或 DMSO 溶液，使佛司可林终浓度为 1 µM（1x）。以 15 秒为间隔，持续采集刺激后荧光读数 20 分钟。
    1. 对于 96 孔板体系，通过将 2 µL 的 1 mM 佛司可林（1,000x）储备液或 DMSO 加入 48 µL 无钠无氯缓冲液中，配制低浓度（40 µM 佛司可林（1:25 稀释））溶液。
      注意：此低浓度 40 µM 佛司可林将在下一步中进一步稀释（1:40 稀释），以获得终浓度 1 µM 佛司可林。
    2. 对于 384 孔板体系，通过将 1 µL 的 1 mM（1,000x）佛司可林储备液或 DMSO 加入 49 µL 无钠无氯缓冲液中，配制低浓度（20 µM 佛司可林（1:50 稀释））溶液。
      注意：此低浓度 20 µM 佛司可林将在下一步中进一步稀释（1:20 稀释），以获得终浓度 1 µM 佛司可林。
  7. 向每孔加入 5 µL CFTRInh172 低浓度溶液，使 CFTRInh172 终浓度为 10 µM。以 30 秒为间隔，持续采集抑制阶段读数 15 分钟。
    1. 对于 96 孔板体系，通过将 2 µL 的 10 mM CFTRInh172（1,000x）储备液加入 48 µL 无钠无氯缓冲液中，配制 CFTRInh172 低浓度（400 µM CFTRInh172（1:25 稀释））溶液。
      注意：此低浓度 400 µM CFTRInh172将在下一步中进一步稀释（1:40 稀释），以获得终浓度 10 µM CFTRInh172。
    2. 对于 384 孔板体系，通过将 1 µL 的 10 mM CFTRInh172（1,000x）储备液加入 49 µL 无钠无氯缓冲液中，配制 CFTRInh172 低浓度（200 µM CFTRInh172（1:50 稀释））溶液。
      ​注意：此低浓度 200 µM CFTRInh172将在下一步中进一步稀释（1:20 稀释），以获得终浓度 10 µM CFTRInh172。
  8. 量化每孔的荧光强度数据，并将数值导出为按列排列的电子表格，包含各个孔的数据。为计算佛司可林诱导的变化，将 96 孔板或 384 孔板中每孔的 RFU（相对荧光单位）数值除以基线读数的最后一个荧光强度值，并作图。
    1. 可选：量化 CFTRInh172 介导的抑制反应，以更好地验证 CFTR 功能的特异性12，因为急性佛司可林处理可能通过其他氯离子通道（如 SLC26A9）的活性引起膜去极化12。
  9. 将佛司可林刺激期间相对于基线的最大荧光强度值定义为峰值响应。使用该测量值或曲线下面积来量化 CFTR 反应。

4. ENaC 功能检测缓冲液溶液的配制

  1. 使用表2中列出的试剂配制高钠无氯缓冲液。
  2. 待溶液稳定后，测定其pH值。若溶液pH低于7.4，逐滴加入1 N NaOH溶液，将pH调节至7.4。
    注意：不可使用HCl调节溶液pH，以确保溶液保持无氯状态。
  3. 将缓冲液的渗透压调节至生理范围（300 ± 5 mOsm/kg）。
  4. 过滤缓冲液，并将其储存于无菌瓶中，4 °C保存，最长可保存6个月。
    ​注意：若储存时间超过6个月，使用前需在室温下检测pH值和渗透压。

5. ENaC 功能检测

  1. 将膜电位染料溶解于高钠无氯缓冲液中（0.5 mg 染料/1 mL 缓冲液），并升温至 37 °C。
    注意：避免膜电位染料粉末暴露于光照下。
  2. 从 Calu-3 或 Caco-2 单层细胞中移除培养基，并向每孔加入含染料的溶液（96 孔板每孔 195 µL，384 孔板每孔 95 µL）。
    注意：避免染料溶液暴露于光照下。
  3. 在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育细胞 35 分钟，使细胞充分加载染料。
  4. 将加载了染料溶液的细胞转移至荧光酶标仪中。从板底部读取荧光信号，激发波长为 530 ± 5 nm，发射波长为 560 ± 5 nm。
  5. 首先以 30 秒为间隔，连续采集 5 分钟的基础荧光读数。
  6. 为抑制 ENaC 功能，向每孔加入 5 µL 溶解于高钠无氯缓冲液中的低浓度阿米洛利溶液或低浓度 DMSO 溶液，使阿米洛利终浓度为 10 µM。
    1. 对于 96 孔板体系，通过将 2 µL 的 10 mM 阿米洛利（1,000 倍浓缩液）加入 48 µL 高钠无氯缓冲液中，配制低浓度（400 µM 阿米洛利（1:25 稀释））溶液。
      注意：此 400 µM 低浓度阿米洛利溶液将在下一步进行二次稀释（1:40 稀释），最终获得 10 µM 阿米洛利浓度。
    2. 对于 384 孔板体系，通过将 1 µL 的 10 mM 阿米洛利（1,000 倍浓缩液）加入 49 µL 高钠无氯缓冲液中，配制低浓度（200 µM 阿米洛利（1:50 稀释））溶液。
      注意：此 200 µM 低浓度阿米洛利溶液将在下一步进行二次稀释（1:20 稀释），最终获得 10 µM 阿米洛利浓度。
  7. 以 45 秒为间隔，持续采集 60 分钟的抑制阶段荧光读数。
  8. 重复步骤 3.7 以进行数据分析。
  9. 测量阿米洛利反应，即从基础值到平台期的抑制百分比（通常在加入阿米洛利后约 15–20 分钟）。利用该差值定量 ENaC 的反应水平。

结果

为了测量CFTR通道活性，将高度分化的贴壁细胞孵育在含有膜电位敏感性染料的无氯细胞外溶液中。在佛司可林刺激后，CFTR功能持续表现为膜去极化。. 氯离子外流表现为与溶剂对照组相比荧光信号急剧升高。荧光信号持续升高直至加入CFTR抑制剂（CFTRInh172），随后荧光强度迅速下降，如在Caco-2细胞中所见图1A），在Caco-2和Calu-3细胞中均具有可重复性（图1B). 通过检测佛司可林或DMSO（溶剂对照）处理后荧光最大变化值的差异，评估CFTR活性。各数据点位于佛司可林刺激组（黑色点）或DMSO对照组（灰色点）均值±3个标准差范围内，对应的Z'因子为0.586。该优异评分表明本检测方法具有良好的重复性。图1C若基线存在轻微漂移，可通过在激活后将基线外推至抑制剂加入的时间点，以最小化漂移的影响。反应量可通过曲线下面积进行量化，其中下限由外推线确定。

ENaC 活性也可在96孔板中培养的汇合气道和结肠上皮细胞中进行检测。与CFTR通道活性检测不同，这些细胞浸没在含高浓度钠的溶液中，从而允许钠离子通过ENaC被吸收。当急性加入阿米洛利后，钠离子摄取被阻断，细胞出现相对的膜超极化。这一点在Caco-2细胞中低浓度（10 µM）（图2A）和高浓度（50 µM）阿米洛利（图2A，B）处理下以及在Calu-3细胞中高浓度阿米洛利（50 µM）处理下均得到证实（图2B）。ENaC检测已扩展至384孔板格式，并在ENaC抑制实验中表现出良好的可重复性。类似地，各个数据点与阿米洛利抑制的平均值（黑色点）或DMSO对照（灰色点）相比，均分布在均值±3个标准差范围内。Calu-3细胞中的ENaC反应在使用阿米洛利（50 µM）急性处理时报告的Z'因子为0.629（图2C），表明该体系适用于高通量筛选。

佛司可林反应分析；时间过程图、箱形图、质量控制图；ΔF/F%，% 变化。
图 1：在 Caco-2 和 Calu-3 细胞中通过膜去极化变化测量 CFTR 通道活性。 （A）Caco-2 细胞中佛司可林（1 µM）刺激及 DMSO 对照的代表性曲线。（B）Caco-2 和 Calu-3 细胞中佛司可林刺激的箱须图（**** P < 0.0001，n > 3 次生物学重复，n > 3 次技术重复）。生物学重复指独立的细胞系传代；技术重复指多孔板中的独立孔。箱形图显示中位数；边界表示四分位距（IQR），须线表示最小值和最大值。（C）Caco-2 细胞中佛司可林刺激与 DMSO 对照相比，CFTR 反应的 Bland-Altman 图。黑点代表佛司可林刺激引起的荧光最大绝对变化。灰点代表 DMSO 对照引起的荧光变化。缩写：CFTR = 囊性纤维化跨膜传导调节因子；DMSO = 二甲基亚砜；IQR = 四分位距；Fsk = 佛司可林；ΔF/F0 = 荧光变化量。请点击此处查看该图的放大版本。

阿米洛利抑制图；ΔF/F0 与时间关系图、箱形图及细胞研究的样本分析。
图 2：通过膜超极化测量 Caco-2 和 Calu-3 细胞中上皮钠离子通道（ENaC）的抑制情况。 （A）Caco-2 细胞中阿米洛利（10 µM）相对于 DMSO 对照组对 ENaC 抑制作用的代表性曲线。 （B）Caco-2 和 Calu-3 细胞中阿米洛利抑制作用的箱须图（**** P < 0.0001，n > 3 次生物学重复，n > 3 次技术重复）。 （C）Calu-3 细胞中阿米洛利抑制作用与 DMSO 对照组相比的 Bland-Altman 图，用于评估 ENaC 反应的可重复性。黑点代表阿米洛利抑制引起的荧光最大绝对变化值；灰点代表 DMSO 对照组引起的荧光变化值。缩写：ENaC = 上皮钠通道；DMSO = 二甲基亚砜；Amil. = 阿米洛利；ΔF/F0 = 荧光变化量。 请点击此处查看该图的放大版本。

名称浓度
NMDG (N-甲基-D-葡糖胺)150 mM
葡萄糖酸内酯150 mM
葡萄糖酸钾3 mM
HEPES10 mM

表1：无钠无氯条件下CFTR功能检测所用试剂及其相应浓度。 缩写：CFTR = 囊性纤维化跨膜传导调节因子。

名称浓度
Sodium Gluconate150 mM
Potassium Gluconate3 mM
HEPES10 mM

表2：高钠零氯ENaC功能检测缓冲液所用试剂及其相应浓度。 缩写：ENaC = 上皮钠（Na）通道。

讨论

在此，我们描述了基于荧光的方法，用于检测结肠上皮癌细胞系 Caco-2 和人肺上皮癌细胞系 Calu-3 中 CFTR 和 ENaC 的活性。这些上皮细胞系中的膜电位检测方法可用于在最终验证前确认先前在异源表达系统中鉴定出的小分子调节化合物的有效性。 体外 在原代患者来源的上皮细胞培养物中进行验证。

必须确认上述测量结果确实归属于目标通道。例如，归因于CFTR的测量结果应表现出对CFTR蛋白表达以及氯离子电化学驱动力的依赖性，而该驱动力可被forskolin和抑制剂CFTRInh-172所调节。类似地，若由10 µM氨苯蝶啶（amiloride）引起的膜电位变化依赖于ENaC蛋白的表达和向内钠离子驱动力，则可将其归因于ENaC。尽管我们已在转染了ENaC全部三个亚基的MDCK细胞中验证了ENaC的这些特性2，但尚未正式确认在Caco-2和Calu-3细胞中测得的氨苯蝶啶反应确实由ENaC介导。这一点尤为重要，因为氨苯蝶啶除了作用于ENaC外，还可调节钠-质子交换体NHE3的功能13。可以设想，本实验中观察到的氨苯蝶啶诱导的超极化可能部分反映了细胞内酸化对其他通道的间接影响。为了证实利用该膜电位敏感染料所测得的氨苯蝶啶诱导超极化在上述细胞系以及更复杂的细胞系统（如iPSC来源的组织）中确实由ENaC介导，我们正在通过敲除这些细胞系中ENaC的必需亚基（β亚基）来验证该活性是否随之消失。

这些检测的成功取决于多个因素。首先，上皮细胞培养物必须达到融合状态并充分分化。在测定CFTR和ENaC功能时，建议在96孔板中每孔接种约145,000个细胞，或在384孔板中每孔接种45,000个细胞。当上皮细胞达到融合状态（接种后3-4天内）时，需继续培养2-5天以完成分化。该时间点的确定依据先前通过免疫印迹法检测到的CFTR蛋白表达量达到最大值14。同样，Calu-3和Caco-2两种细胞系中ENaC功能表达的最佳时间也已确定。

细胞未达到汇合或细胞过度生长会导致技术重复之间的可重复性降低。若个别孔中的细胞未能同时达到汇合状态，则应弃用这些培养板。此外，基线读数不稳定或缺乏刺激响应可能提示细胞质量较差，此类样本必须排除在分析之外。对CFTR激活剂佛司可林（forskolin）或ENaC抑制剂氨氯吡脒（amiloride）的响应减弱，可能反映出细胞传代次数过多15。尽管Calu-3和Caco-2细胞不存在此问题，但其他细胞或组织可能无法良好贴附于培养板，需要预先包被孔板。例如，在先前的研究中，二维胆管上皮细胞培养通过胶原包被实现贴附16。另一种方法是使用多聚-L-赖氨酸（Poly-L-Lysine）提高二维肠道组织的贴附性2。

此外，在使用基于荧光的检测方法来测试小分子对离子通道的调节作用时，必须考虑小分子自身荧光特性可能带来的干扰。为确认功能反应的特异性，可采用传统的电生理学方法（如Ussing实验17）进一步验证膜电位检测结果。

在确认膜电位敏感性染料所检测到的反应确实由目标离子通道介导后，这些检测方法在相关细胞环境中验证上皮离子通道的潜在调节剂方面具有巨大潜力。该平台能够弥合异源表达系统中高通量调节剂筛选与难以获取的原代组织中耗时且复杂的生物电测量之间的差距。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

作者感谢多伦多病童医院的 Christopher Fladd 和 SPARC 生物中心在进行测量 CFTR 和 ENaC 膜电位实验中的帮助。本研究由囊性纤维化研究所（CFIT）项目资助，资金来自加拿大囊性纤维化协会（CF Canada）和病童基金会。本工作还获得加拿大政府通过基因组加拿大（Genome Canada）及安大略基因组研究所（OGI-148）的资助。本研究亦由安大略省政府资助。S.X. 获得了加拿大胃肠病学会（CAG）博士奖学金的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿米洛利Spectrum ChemicalTCI-A2599-5G溶于DMSO，-20 °C保存
CFTRInh-172CF Foundation Therapeutics溶于DMSO，-20 °C保存
EMEM, 1xsWisent320-005-CL
胎牛血清（FBS）Wisent080-450
FLIPR膜电位染料Molecular DevicesR80424 °C保存
佛司可林Sigma-AldrichF3917溶于DMSO，-20 °C保存
葡萄糖酸内酯或（D-(+)-葡萄糖酸 δ-内酯）Sigma-AldrichG4750室温保存
HEPESBioshopHEP001.5室温保存
人支气管腺癌细胞系（Calu-3）ATCCHTB-55
人上皮结肠腺癌细胞系（Caco-2）ATCCHTB-37
N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）Sigma-AldrichM2004室温保存
青霉素-链霉素溶液Wisent450-200-EL
磷酸盐缓冲液（PBS）Wisent311-010-CL
葡萄糖酸钾Sigma-AldrichP1847室温保存
葡萄糖酸钠Sigma-AldrichG9005室温保存

参考文献

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CFTR ENaC

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