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方法文章

病原体灭活 通过 核黄素-5′-磷酸的可见光光解

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DOI：

10.3791/63531

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2022年4月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用在低强度蓝光和紫光照射下黄素单核苷酸（FMN）光解过程中产生的活性氧来灭活致病菌的实验方案。FMN光解被证明是一种用于消毒过程的简单且安全的方法。

摘要

黄素-5'-磷酸（或黄素单核苷酸；FMN）对可见光敏感。在可见光照射下，FMN光解可产生多种化合物，包括活性氧（ROS）。由FMN光解产生的活性氧对微生物具有危害性，包括致病性细菌，例如 金黄色葡萄球菌 (S. aureus）。本文介绍了一种失活 S. aureus，例如， 通过 在可见光照射下涉及FMN的光化学反应。超氧自由基阴离子（超氧阴离子，O₂⁻，化学结构，氧化还原反应分析，分子式。FMN 光解过程中产生的 ) 进行评估 通过 氮蓝四唑（NBT）还原。微生物活力的 S. aureus 这归因于活性 超氧阴离子，O₂⁻，化学结构，氧化还原反应分析，分子式 物种被用于确定该过程的有效性。细菌灭活率与FMN浓度成正比。紫光在灭活方面效率更高。 S. aureus 与蓝光照射相比，红光或绿光不会引发黄素单核苷酸（FMN）的光解。本文展示了FMN光解作为一种简单且安全的卫生处理方法。

引言

黄素单核苷酸（FMN）是通过核黄素侧链核糖基的5′位磷酸化形成的，所有黄素蛋白在多种细胞过程中产生能量时均需要FMN。它还在人体某些功能中发挥维生素的作用1。FMN在水中的溶解度约为核黄素的200倍2。

细菌的抗菌光动力失活（aPDI）是一种有效控制细菌耐药性的方法3,4，因为它不依赖于细菌耐药的作用机制。在临床上，aPDI 被用于治疗软组织感染，以减少由多重耐药菌引起的医院内皮肤感染5,6,7,8,9。aPDI 还可通过产生活性氧（ROS）导致细胞死亡。ROS，例如超氧阴离子自由基（超氧阴离子自由基 O2−；化学式；在生化过程中的自由基存在）、单线态氧、羟基自由基（•OH）和过氧自由基，是含有活性氧的自由基或分子10,11,12，通常具有高反应活性13。与 ROS 引起的 DNA 损伤类似，膜脂过氧化以及内皮细胞的破坏也是细胞中由 ROS 引起的有害生化反应12。

使用 aPDI 灭活致病性细菌涉及在化学化合物（如亚甲蓝氯化物）存在下，利用可见光或紫外光源使微生物失活14，PEI-ce6 偶联物15，卟啉16二氧化钛17甲苯胺蓝 O18和氧化锌纳米颗粒19甲苯胺蓝O和亚甲蓝属于吩噻嗪类染料，其中亚甲蓝具有毒性。氧化锌纳米颗粒和紫外照射与不良的健康及环境效应相关。因此，开发一种可靠、安全且简单的光敏剂 通过 可见光照射下的光解反应值得进一步研究。

微量营养素核黄素或FMN无毒，且确实用于食品制造或喂养20FMN 和核黄素均对光照高度敏感2. 在紫外光下1,2,21,22,23 蓝光照射10,24这两种化合物达到激发态。光解产生的激活态核黄素或FMN被促进至其三重态，同时产生活性氧（ROS）。2,25Kumar 等人报道，核黄素在紫外光激活下可选择性地增加对病原微生物DNA中鸟嘌呤部分的损伤26在紫外光照射下，光动力活化的核黄素可促进双链DNA中8-OH-dG的生成，后者是氧化应激的生物标志物。27据报道， S. aureus 和 E. coli 在核黄素或FMN光解过程中被活性氧（ROS）失活10,24,28. 作者之前的一项研究表明，核黄素和FMN参与的光解反应能够还原结晶紫，一种三芳基甲烷染料及可生成抗菌剂的物质 超氧阴离子自由基 O2−；化学式；自由基在生物化学过程中的存在，并消除结晶紫的大部分抗菌能力28当黄素腺嘌呤二核苷酸或FMN被蓝光照射时，所产生的活性氧物种因其毒性在HeLa细胞中诱导凋亡 体外29. 通过在核黄素存在下进行光化学处理，Cui 等人通过抑制淋巴细胞的增殖和细胞因子产生使其失活30.

核黄素的光解作用可用于通过紫外线灭活血液中的病原体10,24，但血液成分在紫外线照射下可能受到损伤30。也有报道称，血小板暴露于紫外线后，其膜表面的活化标志物P-选择素和LIMP-CD63的表达会逐渐增强。紫外线及高强度辐照的细胞毒性需要进一步研究，而在涉及可见光的黄素单核苷酸（FMN）光反应中，若能使用一种操作简便且安全的光敏剂将具有重要意义。

短波长的光具有更高的能量，更易对细胞造成严重损伤。然而，在存在合适光敏剂的情况下，使用低强度紫光照射可抑制病原微生物。光敏作用及活性氧的产生 超氧阴离子自由基 O2−；化学式；在生物化学过程中的自由基存在 因此，研究在紫光照射下由FMN产生的ROS对细菌失活作用的途径非常重要。

抗菌控制是一个普遍存在的问题，而新抗生素的开发通常需要数十年时间。经紫光照射后，由FMN介导的光失活可有效灭活环境中的致病菌。本研究提出了一种高效的抗菌方案 体外 利用紫光驱动FMN光解，从而生成 超氧阴离子自由基 O2−；化学式；自由基在生物化学过程中的存在 对于aPDI。微生物的存活性 S. aureus 用于确定FMN诱导的aPDI的可行性。

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方案

1. 光解系统设置

  1. 如图1所示，将六个发光二极管（LED）（直流12 V）安装在一个不透明塑料杯（8 cm × 7 cm）内侧，以构建光解系统31。
  2. 将反应物（见下文）加入玻璃试管（直径13 mm，高100 mm）中，并将试管固定在杯口顶部，如图1所示。将实验装置置于温度恒定为25 ± 3 °C的室内。
  3. 使用红外测温仪监测并记录光解反应过程中各测试单元的温度。
    注意：图2显示了使用校准的紫外-可见光光谱仪测得的蓝光、绿光、红光和紫光的发射光谱。本研究中所用蓝光、绿光、红光和紫光LED的最大吸收波长分别为465 nm、529 nm、632 nm和405 nm。LED芯片在辐照实验期间可能使装置升温，因此每次实验中的整个光反应系统均置于温度保持在25 ± 3 °C恒定条件的室内。

2. 光波长对核黄素（FMN）光解作用的影响（图3）

  1. 在100 mM磷酸钾缓冲液（PB，pH 7.8）中配制0.1 mM FMN溶液。将FMN样品（每份3 mL）分别暴露于强度为10 W/m2的蓝光、绿光、红光或紫光下照射5分钟。另取3 mL FMN溶液置于黑暗中作为对照。
  2. 使用紫外/可见分光光度计测定照射后FMN样品在250–750 nm波长范围内的吸光度。

3. 硝基蓝四氮唑（NBT）还原法检测超氧阴离子自由基 O2−；化学式；在生物化学过程中的自由基存在。（图 4）。

注意：此处使用的氮蓝四唑（NBT）还原法是对核黄素光反应检测方法的轻微修改。NBT还原法用于评估由黄素单核苷酸（FMN）光解产生的超氧阴离子自由基 O2−；化学式；生化过程中的自由基存在的水平。光激发的FMN首先被L-甲硫氨酸还原为半醌形式，随后将一个电子传递给氧气，从而生成超氧阴离子自由基 O2−；化学式；生化过程中的自由基存在31。所生成的超氧阴离子自由基 O2−；化学式；生化过程中的自由基存在可将NBT还原为甲臜，后者在560 nm处具有特征性吸收峰32。

  1. 将109.3 mg L-甲硫氨酸加入73.3 mL磷酸缓冲液（PB，100 mM；pH 7.8）中。涡旋振荡使L-甲硫氨酸充分溶解。
  2. L-甲硫氨酸完全溶解后，向溶液中加入10 mg NBT粉末和1.53 mL 0.117 mM FMN。每使用1 mL反应溶液（即FMN、L-甲硫氨酸和NBT的混合物），FMN、甲硫氨酸和NBT的终浓度分别为2.4 × 10-6 M、1.0 × 10-2 M和1.6 × 10-4 M。
  3. 将反应溶液（1 mL）置于10 W/m2的蓝光或紫光LED照射下，光照时间为1–5分钟。
  4. 检测光化学反应产生的超氧阴离子自由基 O2−；化学式；在生化过程中的自由基存在物种（通过在560 nm处的吸光度测定），该反应可还原NBT并生成甲臜。

4. FMN 光解后金黄色葡萄球菌（S. aureus）的存活率（图 5）

  1. 将一株 S. aureus（BCRC 10451）从培养平板接种至含有10 mL LB培养基的15 mL螺口试管中，在37 °C摇床中培养16 h。
  2. 取0.5 mL菌液转移至1.5 mL离心管中，加入无菌水稀释，使菌液在600 nm处的光密度（OD600）达到0.5（约6 × 107 CFU/mL）。
  3. 取0.5 mL菌液转移至1.5 mL离心管中，在14,000 × g 条件下离心10 min，弃去上清液，获得菌体沉淀。
  4. 向步骤4.3中获得的菌体沉淀中分别加入1 mL含30、60和120 µM FMN的磷酸盐缓冲液（PB），涡旋混匀。作为光照对照，单独加入1 mL PB缓冲液。
  5. 分别取含30 µM FMN和单独PB的活性细菌悬液各1 mL，加入玻璃试管中，用10 W/m2的紫光照射30 min。
  6. 分别取含30、60和120 µM FMN以及单独PB的活性细菌悬液各1 mL，加入玻璃试管中，用20 W/m2的蓝光照射120 min。另设一组含120 µM FMN的活性细菌悬液1 mL，同样用20 W/m2蓝光照射60 min。
  7. 按照步骤4.5和4.6设置试管，并用厚铝箔包裹，作为暗对照组。
  8. 在30–120 min的照射期间，将照射室（以及暗对照组）置于9 ± 1 °C的冷藏室中。
    注：LED光源释放的热量不可忽略，因LED芯片置于照射杯内可能在实验过程中加热光反应体系，因此实验在保持在9 ± 1 °C的冷藏室中进行。
  9. 照射结束后，从各反应液中取0.2 mL涂布于LB琼脂（LA）平板上，用L型玻璃涂布棒均匀涂布，并在37 °C过夜培养。
  10. 根据过夜培养结果，计算S. aureus的活菌平板计数及灭活率。
    注：S. aureus的灭活率以百分比减少值表示，计算公式为[1 - I / D] × 100%，其中I和D分别代表光照处理组与暗对照组的CFU数量。百分比减少值定义为灭活率的负值。

5. 检测 超氧阴离子自由基 O2−；化学式；自由基在生物化学过程中的存在 在 S. aureus (图6)

  1. 按照步骤4所述方法准备 S. aureus 样品。
  2. 用无菌水将样品的细菌密度稀释至在600 nm处的光密度为0.5（OD600，约6 × 106 CFU/mL）。取0.5 mL培养液转移至1.5 mL离心管中，在14,000 × g 下离心10分钟，弃去上清液，获得细胞沉淀。
  3. 将0.1093 g L-甲硫氨酸、0.1 g NBT和25 mL FMN（400、240或120 µM）加入75 mL磷酸盐缓冲液（PB）中。每使用1 mL反应液，FMN、甲硫氨酸和NBT的终浓度分别为100（60或30）× 10-6 M、7.3 × 10-3 M和1.2 × 10-3 M。
  4. 将1 mL各反应液（即含不同FMN浓度的溶液）加入步骤5.2中获得的细胞沉淀中。用10 W/m2的紫光照射10分钟。
  5. 将混合物在14,000 × g 下离心10分钟，弃去上清液。用1 mL二甲基亚砜（DMSO）重悬沉淀，以提取还原的NBT。通过在560 nm处测定吸光度检测生成的 超氧阴离子自由基 O2−；化学式；在生化过程中的自由基存在 物种。

6. 统计分析

  1. 以三次独立实验的均值 ± 标准差（SD）表示数据。
  2. 采用方差齐性的双样本t检验来评估两个测量值之间是否存在差异。p值 < 0.05 被认为具有统计学显著性。

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结果

光波长对FMN的影响
使用蓝光、绿光、红光和紫光LED照射后，0.1 mM FMN的吸收光谱如图3所示。在避光对照组中，FMN在372 nm和444 nm处有两个吸收峰。绿光和红光对其无显著影响，因为光谱变化不明显。相比之下，在10 W/m2强度下分别用蓝光和紫光照射5分钟后，FMN在444 nm处的吸光度分别降低了约19%和34%，表明蓝光/紫光照射可促进FMN的光解反应。

利用蓝光或紫光照射黄素单核苷酸（FMN）后检测超氧阴离子自由基，\( \text{O}_2^{ \cdot -} \)，分子结构表示，化学分析。 的生成<...

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讨论

光敏剂可增强化学化合物的光化学反应以产生活性氧（ROS）。在光敏剂存在的情况下，通过光照可使病原微生物失活。本研究通过外源性光敏剂核黄素（FMN）在紫光照射下产生的活性氧，测定其对S. aureus的抗菌光动力失活（aPDI）效果。

如图所示 图3，对于FMN，使用紫光或蓝光照射5分钟后，其在444 nm处的吸光度显著降低，而在绿光或红光照射下，FMN的吸光度无明显变化。采用NBT还原法来检测还原产物的生成 超氧阴离子自由基 O2−；化学式；自由基在生物化学过程中的存在 通过 电荷转移过程10,33. 作者先前的一项研究...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢 Tak-Wah Wong 博士和 Zong-Jhe Hsieh 先生在实验方面提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蓝色、绿色和红色LED灯Vita LED Technologies Co., 中国台湾台南DC 12 V 5050
二甲基亚砜Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯190186
红外温度计Raytek 公司，加利福尼亚州圣克鲁斯市MT4
LB肉汤Difco 公司，新泽西州
L-甲硫氨酸Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯1.05707
NBTBio Basic 公司，加拿大安大略省马克姆市
电源中国台湾新北市，China tech 公司YP30-3-2
核黄素 5′-磷酸盐Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯R7774
RNaseNew England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
太阳能功率计Tenmars Electronics Co.，中国台湾台北TM-207
金黄色葡萄球菌金黄色亚种中国台湾新竹生物资源收集与研究中心（BCRC）10451
紫外-可见光分光光度计Ocean Optics，佛罗里达州邓迪USB4000
紫外-可见分光光度计日本东京，日立高新技术公司U-2900
紫光LED中国东莞，龙辉电子有限公司

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