本文介绍一种新的快速建模大鼠开放性脊髓损伤的技术，该技术无需进行椎板切除术。在显微镜下观察的同时进行侧方半横断操作。该技术具有良好的适用性，也可用于其他动物脊髓的颈段、胸段和腰段区域。
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本文内容
摘要
摘要
模拟撕裂样损伤的开放性脊髓损伤技术因涉及椎板切除术而耗时且具有侵入性。本新技术通过去除两个棘突并抬起、倾斜尾侧椎板，从而避免了椎板切除术。该手术区域无需椎板切除即可充分暴露。随后在显微镜下直视控制进行侧方半横断操作。该方法创伤最小，仅需制造微小的骨性创口。
该技术具有多项优势：操作更快，因而对动物的负担更小，且骨损伤更小。由于无需进行椎板切除，脊髓遭受意外损伤的风险显著降低，且不会产生可能引发问题的骨碎片（嵌入脊髓的骨碎片可导致肿胀和继发性损伤）。椎管得以保持完整。其主要局限性在于，半横切只能在椎间隙内进行。
结果表明，与传统的椎板切除术相比（11分钟 vs. 35分钟），该技术的操作速度显著更快。该技术适用于开展开放性脊髓损伤动物模型研究的研究人员，因其具有广泛的适应性，且无需任何额外的专用器械。
引言
脊髓损伤（SCIs）在人类中是一种常见的不幸伤害。脊髓损伤可能以多种方式出现并发症，例如感染，因此在临床上研究这些损伤具有重要意义1。由于目前尚无单一明确的治愈方法，仍需借助动物模型来加深研究人员的理解，并推动潜在治疗方法的发展2,3。尽管闭合性损伤（如压迫和挫伤）是最常被建模的类型，但理解仅能在开放性损伤中模拟的撕裂伤在临床上同样重要4。与闭合性损伤模型相比，使用横断或半横断建立的开放性伤口模型能够更精确地定位损伤位置，这是由损伤性质（挫伤 versus 手术切割）决定的。开放性伤口实验能够以可控、可靠且可重复的方式揭示更特异的神经元损伤机制5。脊髓的完全或部分横断是一种广泛应用的开放性伤口技术，其详细操作可参见Brown和Martinez的文章6。
在研究大鼠开放性脊髓损伤时，部分动物出现了由手术引起的问题：椎板切除术产生的骨碎片嵌入脊髓并引发肿胀；较大的骨缺损需要较长时间愈合；手术耗时过长。为此开发了一种替代的外科技术以消除这些问题。目标是建立一种对动物更温和且更快捷的手术方法。这种新开发的技术比传统的脊髓损伤（SCI）技术快得多。该手术采用微创入路，仅造成较小的骨缺损，同时避免了椎板切除术所引发的相关问题。
所有开放性伤口技术均涉及打开硬脊膜7。近年来多项研究探讨了不同新开发的技术，旨在改进以往的方法8,9。尽管使用这种新技术仍无法避免打开硬脊膜，但它能在硬脊膜上造成更小的伤口，同时实现对脊髓可靠且可控的损伤。查阅有关脊髓损伤技术的文献发现，许多研究人员尝试通过对原始技术进行微小改进，以缩短手术时间10。椎板切除术始终是这些外科手术的一部分，但其耗时较长，且需要造成更大的骨组织创伤6。该手术技术适用于采用开放性伤口脊髓损伤模型的研究人员，特别是用于椎间隙内进行的完全横断或侧半横断操作（图1）。
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方案
所有动物实验均按照欧盟指令（2010/63/EU）进行，并经匈牙利国家食品链安全办公室动物伦理委员会批准（PEI/001/2894-11/2014）。本研究期间严格遵守了所有适用的机构和政府关于动物伦理使用的法规。
1. 手术前准备
- 在手术过程中使用的所有器械（参见材料表）均需灭菌，并在操作前对操作区域的表面进行消毒。
- 预防性地皮下注射单剂量抗生素。
注：抗生素剂量详情参见材料表。 - 在手术前将动物置于手术室中1小时，以使其适应环境并降低应激水平。
- 通过肌内注射氯胺酮和赛拉嗪的混合物对大鼠进行麻醉（氯胺酮80 mg/kg体重（bw），赛拉嗪8 mg/kg bw）。
注：除麻醉作用外，氯胺酮-赛拉嗪组合还能为此操作提供充分的镇痛效果。镇痛方案可根据机构的动物使用指南进行调整。 - 在操作过程中使用加热台或红外灯保持大鼠体温，并在整个麻醉期间使用眼用软膏保持眼睛湿润（必要时重新涂抹）。
- 使用手术胶带将动物固定在手术台上，固定其前肢、后肢和尾巴；根据损伤部位，必要时也固定颈部。如有需要，可将大鼠置于立体定位仪中以在手术期间保持稳定。
- 使用无菌外科缝线在大鼠上颌前牙周围打一个环，并将其固定在手术台边缘。
- 将舌头侧向拉出以维持气道通畅。
- 剃除背部毛发，切口区域周围至少各2 cm范围内的毛发均需剃除。
- 使用聚维酮碘溶液和无菌纱布至少对术区皮肤消毒三次。特别注意浸透切口周围毛发。用无菌洞巾覆盖并固定手术区域。
- 在进行首次切口前，通过夹捏动物的脚趾和尾巴来评估麻醉深度。在整个操作过程中持续监测麻醉是否充分。
2. 手术
- 使用20号手术刀片进行皮肤切口。为暴露手术区域，沿脊柱做一条2-2.5 cm长的切口，切开皮肤各层。以L1椎体为中点，将切口平行于脊柱走向定位，使其沿脊柱向头侧和尾侧方向各延伸约1 cm。
- 通过切开肌肉周围结缔组织，松解伤口边缘。
- 沿脊柱做两个平行切口，穿透骨膜。切口位于脊突两侧紧邻处，范围从第13胸椎（Th13）至第1腰椎（L1）椎骨之间。
- 使用骨膜剥离器解剖附着于椎骨的肌肉，直至所有脊柱韧带均清晰可见。放置牵开器。
- 去除第13个脊椎的棘突th 胸椎和第1节st 使用牙科骨钳暴露腰椎椎体以全面显露手术区域。此后，通过观察放大（4倍至16倍）的显微图像来控制手术操作。
- 必要时使用无菌纱布控制术中出血。
- 小心抬起剩余的L1棘突，抬高L1椎弓。切断黄韧带以暴露脊髓。进一步抬高尾侧棘突，以便显露脊髓硬膜并将其切断。将尾侧棘突向头侧倾斜，以观察软脑膜。
- 透过软脑膜寻找后正中静脉，以显示脊髓的中线。
- 以静脉作为方向上的中分线，使用显微外科手术刀在避开静脉的前提下进行切口。将切口置于静脉下方，位于通过脊髓前后径的横断面上。通过将刀片从正中线向外侧移动，切断一半的脊髓。
注意：切口为单侧，位于右侧，于第4肋间th 腰段 - 尽量定位切口以避免切断脊前动脉。切断脊髓时，注意不要对椎体施加过度压力，以保护脊髓腹侧的脊前动脉。
图1：示意图展示大鼠新型开放性脊髓损伤（SCI）技术的操作步骤。（A）暴露的椎体。（B）已切除的棘突（Th13 和 L1）。（C）被抬起并倾斜的 L1 椎体椎弓。（D）在右侧进行的半横断操作，右侧半横断的脊髓单独显示并放大。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 在伤口缝合过程中，不要直接闭合硬脑膜。应使用缝线（缝合线规格 4-0）紧密缝合脊柱突周围的肌肉，从而间接闭合硬脑膜上的小切口。
- 使用缝线闭合背部的结缔组织层。
- 最后，缝合切口周围的皮肤。
3. 术后护理与随访
- 让动物在笼中苏醒。除温控房间外，还需使用加热灯保持动物体温。动物术后苏醒后不得单独留置，且不可将其与其他大鼠同笼饲养。
- 每10分钟至少监测一次呼吸频率，直至其完全清醒。必要时可给予轻柔刺激（例如轻擦头部），以帮助其从麻醉状态中苏醒。
- 当动物清醒且活动状态正常时，将其安全转运回动物房。
- 术后24小时内密切监护大鼠。术后24小时后，每天至少检查动物两次，直至实验结束，观察其是否有痛苦迹象。
- 每天使用相关机构的动物福利方案，彻底评估一次动物的痛苦迹象，并特别注意检查伤口是否有感染和炎症的征象。
注意：应激和感染会影响动物的福利以及实验结果。 - 每天皮下注射抗生素，直至实验结束。将动物饲养于无菌笼具中，每笼一只，并提供食物和水 随意摄取，与之前相同。在实验结束时（或在实验期间观察到任何严重不良反应时），应根据相关机构的动物福利规程，以人道方式处死动物。
注意：此处动物在使用氯胺酮-赛拉嗪联合麻醉诱导深度睡眠后，先进行生理盐水灌注（1/3 mL/g 体重），随后进行4%多聚甲醛灌注（1 mL/g 体重）处死。
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结果
半横断术后，大鼠同侧后肢出现瘫痪（体内实验证据表明半横断成功）。只有在取出脊髓后才能进行完整的标本评估（参见图2，其中可从腹侧和背侧观察取出的脊髓）。
图2：半横断后取出的脊髓的腹侧和背侧视图。 完整取出的脊髓分别从腹侧（A）和背侧（B）观察，图示为并列排列。
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讨论
这种微创脊髓损伤技术是在研究脊髓损伤大鼠时开发的，研究团队曾面临手术本身带来的一系列问题（椎板切除术产生的骨碎片导致脊髓受压和损伤、手术耗时过长、大面积骨伤口愈合缓慢）。通过取消椎板切除术，该操作时间显著缩短（11分钟 vs. 35分钟），椎管结构得以保持完整，骨伤口明显减小，且不再产生可能损伤脊髓的骨碎片。
棘突的切除步骤不可省略，因为必须切除上方（颅侧）的棘突，才能将下方（尾侧）的棘突向后倾斜。切除下方棘突可显著改善脊髓的视野，便于进行半横断操作。
半切术是本方案中最关键的步骤。此处的半切术为徒手操作，但并非必须如此。也可使用立体定位仪替代。在手术过程中，可将大鼠固定于立体定位仪框架中以稳定动物6。该操作仅需对本文所述技术进行轻微调整。对于经验较少的操作者，此方法尤其有帮助。
这种新技术具有极高的通用性。本实验在腰段L4节段（L1椎骨）进行；然而，该技术也可根据具体实验需求，应用于脊髓的其他节段（该技术已成功用于胸段和颈...
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披露
作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文报道工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
作者谨此感谢Gergely Ángyán提供的原始插图。本研究工作由匈牙利布达佩斯塞梅维什大学资助。本研究还得到了匈牙利人力资源开发运行计划（EFOP-3.6.2-16-2017-00006）的支持。此外，本研究还获得了匈牙利创新与技术部主题卓越计划（2020-4.1.1.-TKP2020）的资助，该资助属于塞梅维什大学治疗学主题计划框架内的一部分。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 阿莫西林克拉维酸钾（Augmentin，1,000 mg/200 mg 粉末） | GlaxoSmithKline, 英国 | 术前一次性皮下注射抗生素进行预防（每只动物给予10 mg阿莫西林和2 mg克拉维酸；即 Augmentin 1,000 mg/200 mg 粉末）。术后每日每只动物给予10 mg阿莫西林和2 mg克拉维酸（Augmentin 1,000 mg/200 mg 粉末），持续给药 | |
| 聚维酮碘（Betadine） | EGIS，匈牙利 | 使用聚维酮碘溶液对术区皮肤进行消毒 | |
| 卡利普索（Calypsol，50 mg/mL） | Richter Gedeon，匈牙利 | 麻醉：肌肉注射氯胺酮 80 mg/kg 与赛拉嗪 8 mg/kg 的联合方案 | |
| 赛拉嗪 CP XYLAZIN 2%（20 mg/mL） | Produlab Pharma B.V.，荷兰 | 麻醉：肌肉注射氯胺酮 80 mg/kg 与赛拉嗪 8 mg/kg 的联合方案 | |
| 牙科骨钳 | Dentech，匈牙利 | BS 0127 | 使用牙科骨钳去除第13胸椎和第1腰椎的棘突 |
| 牙科外科微型电机 | W&H，奥地利 | MF-TECTORQUE | 使用牙科外科微型电机在L1椎体处实施椎板切除术 |
| 光学显微镜 | 蔡司（Zeiss），德国 | OPMI19-FC | 通过观察放大16倍的显微图像来监控手术过程 |
| 生理盐水溶液（0.9% NaCl） | 费森尤斯卡比（Fresenius Kabi），德国 | 在整个麻醉过程中使用生理盐水滴眼液保持大鼠眼部湿润（必要时重复滴加） | |
| 骨刮匙（raspatorium） | Dentech，匈牙利 | FK 1164 | 借助骨刮匙分离附着于椎骨上的肌肉，直至所有脊髓韧带均清晰可见 |
| 牵开器 | Dentech，匈牙利 | RT 1253 | |
| 手术刀 | Dentech，匈牙利 | BB 173 | |
| 手术刀 | Dentech，匈牙利 | BB 184 | |
| 12号手术刀片 | B. Braun，德国 | 12 | |
| 20号手术刀片 | B. Braun，德国 | 20 | |
| 无菌剪裁纱布（10 x 10 cm） | Sterilux, Hartmann，德国 | ||
| 缝线（单丝、合成；可吸收与不可吸收），规格：4-0 | B. Braun，德国 | ||
| 镊子（13 cm） | Dentech，匈牙利 | BD 1555 | |
| 精细组织镊（精细组织钳） | Dentech，匈牙利 | BD 1670 |
参考文献
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- Guan, B., Chen, R., Zhong, M., Liu, N., Chen, Q. Protective effect of Oxymatrine against acute spinal cord injury in rats via modulating oxidative stress, inflammation and apoptosis. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 149-157 (2020).
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重印与许可
