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脑室内药物递送与采样在药代动力学与药效学研究中的应用

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DOI：

10.3791/63540

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2022年3月31日

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1Department of Biochemistry & Pharmacology, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne, 2Department of Microbiology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University, 3UNC Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina, Chapel Hill

本文内容

摘要

将治疗药物直接递送至中枢神经系统是绕过血脑屏障的一种方法。本方案展示了脑室内注射技术，随后可采集脑脊液及体内器官组织，有助于在动物模型中研究药物的药代动力学和药效动力学，从而推动新疗法的开发。

摘要

尽管血脑屏障（BBB）可保护大脑免受外来物质侵入，但它同时也阻止了一些治疗药物进入中枢神经系统（CNS），从而难以改善疾病或感染。为绕过血脑屏障，可在动物和人类中将药物直接递送至中枢神经系统。本方案描述了一种通过脑室内给药治疗脑部感染的独特方法，即递送多粘菌素类抗生素——这类抗生素是治疗多重耐药革兰氏阴性菌的最后手段。本研究建立了一种简便的立体定位手术方案，用于在大鼠脑内植入导向套管，使其到达侧脑室。经过24小时恢复期后，可通过连接至导向套管的注射套管对大鼠进行清醒状态下的重复给药。注射可手动进行，以推注方式完成，也可使用微量注射泵实现缓慢且可控流速的输注。通过伊文思蓝染料成功验证了脑室内注射的准确性。可采集脑脊液（CSF），并收集脑组织及其他器官。该方法非常适用于中枢神经系统药物递送及相关药代动力学与药效学研究。

引言

血脑屏障（BBB）是中枢神经系统（CNS）的关键保护机制。这一具有选择性通透性的解剖屏障将循环血液及其溶质与脑组织细胞外液分隔开来，从而阻止大多数分子进入脑组织1,2,3,4，具体是否通过取决于分子的大小、脂溶性5以及是否存在主动转运机制2。

这一保护屏障有利于有效调控复杂的大脑稳态及中枢神经系统健康4,6然而，这也使得向脑部或其他中枢神经系统疾病部位输送药物以治疗感染变得困难4,7. 除了使用多种方法破坏血脑屏障外8,9，绕过血脑屏障的主要方法是将药物直接递送至脑部，通过将其释放到脑脊液（CSF）中实现4尽管这是一种相对侵入性的操作，但已成功用于向患者和实验动物递送靶向治疗药物。在人体中，药物可被输送至脑室系统或脑脊液（CSF）中，并可通过欧马雅储液囊（Ommaya reservoir）进行采样；该储液囊位于头皮下，连接插入侧脑室的导管10,11. 类似的技术已在啮齿类等实验动物中建立，以实现相同的目标。将微型渗透泵植入小鼠体内12,13,14,15 和大鼠16,17 用于向脑室系统或脑实质进行持续药物递送。此外，在麻醉小鼠中采用一次性针头进行直接脑室内注射18,19 清醒的大鼠 通过 外科植入的导管20,21,22,23向中枢神经系统递送药物一直是增进多个领域认知的重要方法20,24,25,26,27,28.

中枢神经系统感染是迫切需要新疗法以及加深对现有抗感染治疗理解的领域之一。由多重耐药革兰阴性菌引起的中枢神经系统感染尤其令人担忧7。多粘菌素是一类日益被用作治疗这些“超级细菌”感染的最后防线抗生素29。根据当前给药指南静脉注射多粘菌素时30，其进入中枢神经系统的穿透能力非常低，而增加剂量则会提高肾毒性的风险。因此，静脉注射多粘菌素治疗中枢神经系统感染效果甚微7。建立安全有效的多粘菌素向中枢神经系统递送的给药方案是一项紧迫而尚未满足的医疗需求31,32,33。因此，本研究建立并描述了一种直接将抗生素注入大鼠脑脊液中的实验方案。然而，该方法也可用于递送任何非神经毒性药物，且能够在小体积（例如，大鼠中最多10 µL）内达到治疗浓度。所描述的技术还可进行调整，以靶向不同的脑区并实现多次注射。

本方案介绍了一种简单直接的手术与注射技术，可实现药物经脑室内（ICV）给药后的高效药代动力学及分布。该手术包括植入导向套管。由于其侵入性小于微渗透泵植入术12,13,14,15,16,17，因此适用于短期内将药物递送至脑脊液（CSF）的实验，是一种更为先进的选择。本方案经过简化，术后24小时可实现极高的存活率和稳定体重，较现有方法有所改进34。手术后，清醒大鼠接受手动推注式脑室内注射，或使用微量泵进行较缓慢的药物输注，以降低血浆峰浓度，同时动物可在笼内自由活动。为建立安全有效的药物剂量方案，随后采集脑脊液、脑组织、脊髓、肾脏、血浆等样本，用于研究药物经脑室内（ICV）给药后的药代动力学及分布情况。药物分布亦可通过可视化手段进行检测，例如免疫组织化学或基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）。必要时可植入双侧套管，以便将原本单侧分布的药物同时注入两侧大脑半球。

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方案

所有实验均遵循澳大利亚科学用途动物护理与使用的相关规定。 实验经墨尔本大学伦理委员会批准（申请编号 #1914890）。实验使用8至14周龄的雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠。

1. 侧脑室插管的立体定位手术

  1. 手术过程中使用经高压灭菌的棉签和手术单。
  2. 为手术准备以下物品。
    1. 安装立体定位仪、麻醉给药系统、药物、化学试剂及辅助材料（参见 材料表). 用70%乙醇清洁立体定位仪框架、光纤光源、手持钻等设备。
    2. 将22 G引导套管针及其配套的假套管针浸入 材料表在80%乙醇中进行消毒。
      注意：制造商已将22 G导向管和假性套管预切至底座下方约4 mm的长度。
    3. 消毒手术器械（参见 材料表使用热珠灭菌器灭菌20秒，然后喷洒80%乙醇。将灭菌后的器械置于无菌洞巾上。
    4. 准备一个复苏箱（铺有垫巾的大鼠饲养盒），将盒子的一半置于加热垫上。
  3. 进行手术。
    1. 将经乙醇清洁的22 G导管套管拧入立体定位仪框架上的套管固定器中。
    2. 将大鼠放入诱导室（300 mm × 200 mm，参见 材料表）并在1 L/min的氧气流速下使用5%异氟烷诱导麻醉。
    3. 当大鼠深度麻醉（无足底反射）后，将其转移至立体定位仪，通过鼻罩以1 L/min的氧气维持2%–3%异氟烷麻醉。将大鼠门齿钩挂于门齿杆上，小心地将鼻罩罩住鼻部，并轻柔向后牵拉大鼠以确认固定牢固。
    4. 在双眼上涂抹保护性眼用润滑剂，以防止干燥。
    5. 皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）、布托啡诺（0.05 mg/kg）生理盐水溶液以及3 mL生理盐水，用于镇痛及促进术后恢复。
    6. 捏压脚趾以检查足底反射。反射消失后，将大鼠颅骨固定于固定框上。将一侧耳棒插入耳道并拧紧，另一侧重复相同操作。
    7. 将耳杆向两侧移动，确保耳杆上的刻度数值在两侧相等。按压颅骨时，头部不应发生移动。
    8. 用电动剃须刀剃除头部上方的毛发。用纸巾和生理盐水将残留毛发擦拭干净。必要时，再次在双眼涂抹眼用润滑剂，以防干燥。
    9. 用无菌棉签蘸取4%氯己定和含酒精的皮肤消毒液，依次擦拭头皮（参见 材料表从颅骨中心开始，以画圈方式向外移动，直至清理完整个表面。
    10. 皮下注射约150 µL罗哌卡因（1%）（参见 材料表沿预定切口位置。
    11. 使用手术刀片从两眼之间沿头部中线向颅底做10-15 mm的切口。
    12. 使用棉签和手术刀刮除结缔组织，暴露颅骨。
    13. 将无菌棉签浸入3%过氧化氢溶液中，然后涂抹于颅骨表面。等待5秒使化学物质与皮肤发生反应，随后用干燥的棉签清洁该区域。
    14. 再次涂抹3%过氧化氢，这将使颅骨的缝合线更加清晰可见。等待10秒让化学物质与皮肤发生反应，然后用干燥的棉签擦拭清洁该区域。用生理盐水冲洗，并用干净的棉签擦干。
    15. 用棉签蘸取少量Super etch凝胶，轻轻涂抹于颅骨表面，以增加表面孔隙度，利于牙科水泥黏附。
    16. 在颅骨上涂抹足量生理盐水以冲洗掉超级蚀刻剂，并用干净的棉签擦干。
    17. 确定前囟位置，并使用记号笔标记。
    18. 在不会妨碍向导套管放置的位置上，为锚定螺钉钻出一个凹痕。
      注意：如果插管右侧侧脑室，则应在大脑左半球且相对于脑室偏后的位置进行钻孔。
    19. 将钻头与颅骨保持约75°–80°角，缓慢钻出深度约为颅骨厚度一半的凹痕。使用蘸有生理盐水的棉签清除骨屑。
    20. 用镊子牢固夹住螺钉，将其对准凹槽，再用螺丝刀小心地旋入颅骨，避免颅骨破裂。每旋转一圈后，检查螺钉是否紧密固定。
    21. 确认颅骨表面平整。利用立体定位仪的移动臂，调整引导套管使其接触前囟点（bregma）处的颅骨。按下立体定位仪控制显示器上的按钮，将代表Z轴坐标的DV（背腹向）数值归零。
    22. 使用框架的移动臂抬起导管套管（22 G，长度4 mm），将其移至λ点。降低套管直至接触颅骨表面，再次记录DV读数。
      注意：前囟（bregma）处的腹背向（DV）数值与后囟（lambda）处的腹背向（DV）数值之差应小于0.2 mm。如有必要，相应调整鼻固定器，即根据需要上下移动大鼠头部，并重复测量。
    23. 将引导套管移回至与前囟接触，并通过按显示器上的按钮，重新将DV（背腹向）、AP（前后向）和ML（内外向）三个坐标归零。
    24. 将导引套管移至预先设定的目标坐标。
      注意：对300–350 g成年大鼠进行右侧脑室插管时，采用以下坐标：-0.7 mm AP，-1.4 mm ML，-4.00 mm DV（与导管长度相同）。
    25. 用记号笔标记套管末端，然后将其下放至颅骨表面接触并标记最终的套管位置。
    26. 使用钻头在颅骨上钻出一个直径为2.3 mm的孔，用于植入22 G引导套管，操作时应保持钻轴处于垂直方向，即与颅骨成90°角。需小心缓慢地逐步深入颅骨，避免钻入脑组织。
      注意：如有必要，使用可移动的立体定位臂将套管 lowered 至孔洞中，以测试套管是否能够成功置入，或是否需要进一步钻孔。
    27. 将套管插入脑内后，轻轻将其提起，小心地在套管塑料基座的底面涂抹超级胶水，然后利用立体定位仪的移动臂将套管重新放回孔中。
    28. 原位放置以使胶水固化。
    29. 等待期间，混合牙科溶剂和粉末（参见 材料表在称量舟中倒入牙科水泥粉末，用1 mL注射器加入约300 µL溶剂，用同一注射器混合，直至混合物增稠并达到可用的稠度。必要时，可添加更多粉末以增加黏度，或添加更多溶剂以降低黏度。
    30. 使用专用螺丝将套管从套管固定器上卸下，并小心抬起机械臂。
      注意：套管应以90°角粘接到颅骨上。
    31. 使用一次性1 mL注射器吸取新鲜牙科水泥，并将其涂抹在暴露的颅骨上，围绕套管周围施加。注意避免将牙科水泥沾到皮肤或套管开口处。根据其稠度，静置数秒使其固化。
    32. 当牙科水泥变稠时，使用刮刀涂抹更多牙科水泥，形成完全覆盖螺钉的最终头固定帽。
      注意：避免覆盖过多套管，以免影响假性套管的旋紧。清除皮肤上多余的牙科水泥。
    33. 牙科水泥干燥变硬后，插入一根无菌的假性套管。
    34. 关闭异氟烷，松开耳杆，将大鼠从固定架上取下并放入恢复箱中。
    35. 动物恢复约15–30分钟后，将其置于清洁的饲养盒中。
      注意：手术后，大鼠需单笼饲养。建议将食物槽伸入笼内的标准网格笼盖替换为专用的高架网格笼盖，以尽量降低对头部固定装置造成干扰的风险。或者，可将笼内显著低于动物站立高度的区域进行封闭处理。
    36. 填写监查核对表，并按照方案中规定的监查指南进行监查。
      注意：可考虑将一些食物颗粒放在地板上，以便动物更容易获取。如果不会干扰实验，可通过添加了镇痛成分的甜食来替代术后额外的皮下注射给药，例如将丁丙诺啡混入甜味坚果巧克力酱中提供。35,36,37在这种情况下，手术前后提供相同的甜食作为奖励，以避免在给予镇痛处理时因食物新奇恐惧而拒食。可将坚果酱涂在粘附于笼壁的胶带上提供。
    37. 备用的假性套管数量应多于引导套管或注射套管，因为假性套管若意外脱落，可能丢失在动物笼具的垫料中。一旦发生此类情况，应立即用新的无菌假性套管进行更换。

2. 脑室内注射

  1. 配制药物和溶剂，例如将多粘菌素B（见材料表）溶于0.9%无菌生理盐水中，制成30 mg/mL的溶液。对体重在300–400 g之间的成年大鼠，注射体积应控制在5–10 µL之间。
  2. 手术后至少24 h，称重大鼠并将其转移至操作室。
  3. 根据大鼠体重计算注射体积。
  4. 打开笼盖，拧下假性套管。
    注意：通常情况下，轻轻握住笼内大鼠时，其会保持静止，无需额外固定。对于好奇或紧张的大鼠，可使用茶巾包裹，或轻触其颧骨以安抚。
  5. 进行推注给药时，将一段长度不少于40 cm的PE-50导管（见材料表）连接至10 µL气密微量注射器：将导管一端套在注射器的固定针头或可拆卸针头上，并确保连接紧密无漏。将匹配的注射套管连接至导管另一端。
    1. 通过套管吸取所需药液体积。将套管插入导向套管直至完全就位，然后进行注射。注射完毕后，保持注射器推杆位置不动至少额外1分钟，以防止回流。
  6. 若需较慢的给药速率，可使用微量注射泵进行药物注射（见材料表）。
    1. 首先，使用过滤水和带有23 G吸取针头的一次性1 mL注射器，将PE-50导管完全充满液体。随后取下一次性注射器，换上微量注射器。
    2. 回抽1–3 µL，形成一个微小但可见的气泡。然后吸取所需剂量的药物。可选操作：用记号笔标记气泡位置，以便观察药物流动情况。将注射器牢固固定在注射泵上。
      注意：请确保根据所用药物和设备正确设置参数，即按照使用说明书设定给药速度以及所用注射器的内径。
  7. 注射完成后，若注射泵未自动停止，则手动停止。保持针头插入状态至少额外1分钟，以防止回流。
  8. 缓慢拔出注射套管，并拧上导向套管的保护帽。
  9. 通过反复吸取和排出乙醇及去离子水各三次，清洁相关设备。

3. 脑脊液和组织取样

  1. 将大鼠转运至操作室。
  2. 将大鼠放入诱导室，使用2 L/min氧气混合5%异氟烷进行麻醉诱导，直至呼吸减慢（约5分钟）。
  3. 将大鼠转移至立体定位仪，并通过鼻罩维持相同深度的麻醉状态。
  4. 检查足底反射。一旦反射消失，使用耳杆将颅骨固定在立体定位仪上。
    注意：可使用结构较简单的立体定位仪，无需显示屏、圆形耳杆或可移动臂。本操作为非复苏性手术，唯一必需的部件是适用于大鼠的耳杆。
  5. 通过鼻罩将大鼠鼻部向下倾斜约45°，以充分暴露颈部操作区域。
  6. 使用小型钝头弯剪，触摸颅骨并向后移动至颅骨末端。在此位置，沿颈部正中线切开最外层肌肉，切口长约2–3 cm。仔细逐层剪开其余肌肉组织。
    1. 使用小型弹簧牵开器撑开切口，以获得良好视野。继续剪开组织直至小脑延髓池膜可见。使用棉签辅助轻柔去除残留皮肤。
  7. 若出现出血，使用纱布清洁并止血。
  8. 必要时，可使用卷成条状的小块组织围绕小脑延髓池放置，防止血液污染脑脊液（CSF）。
    注意：若需通过染料验证注射效果，可在使用配套套管和一次性1 mL注射器采集脑脊液前，向麻醉大鼠注射2–3 µL的1.1%伊文思蓝染料（见材料表）。
  9. 准备脑脊液提取工具：在注射器中吸入约500 µL过滤水，连接23 G采样针头，并在针头上套上导管。将拉制的玻璃毛细管连接至导管另一端。
  10. 提取脑脊液时，缓慢将拉制毛细管插入暴露的小脑延髓池。
    注意：脑脊液将缓慢被动流入毛细管，并通过注射器主动抽吸。若已注射染料，脑脊液将呈蓝色（图1）。
  11. 将采集的脑脊液加入已标记的离心管中，并立即置于干冰上。脑脊液可随后储存于-80 °C。
  12. 采集其他感兴趣的组织用于分析。对于血浆，需采集至少3 mL心腔血液。
    1. 将深度麻醉的大鼠仰卧放置，打开胸腔以暴露心脏。使用止血钳夹住肋骨并将其固定于动物咽喉部位以改善视野。使用带钩组织镊夹住右心室，将带有18 G针头的一次性5 mL注射器平行于室间隔插入左心室。缓慢抽取血液至注射器中。采集3–5 mL血液后，将针头从心脏中拔出。
  13. 将针头从注射器上取下并放入锐器盒中。将血液转移至肝素化管中，在2,739 x g、4 °C条件下离心15分钟，随后使用200 µL移液器收集上清液，并立即在干冰上速冻。
  14. 使用剪刀剪除心脏以实施安乐死。关闭异氟烷气源。
  15. 采集其他感兴趣的腹腔器官，如肾脏或脾脏。辨认目标器官，使用带钩组织镊夹住该器官并提起，剪断所有连接组织。将器官放入已标记的离心管中，并立即在干冰上速冻。
  16. 为取出脑组织，使用锋利的大剪刀在颅底处剪断颈部以实现断头。手动取下头部固定装置。剪开覆盖颅骨的剩余皮肤。
  17. 使用解剖剪从颅底至人字缝沿正中线剪开颅骨，即纵向切开枕骨。使用止血钳夹住一侧颅骨并剥离。重复另一侧操作，以完全暴露小脑。
  18. 继续沿矢状缝向额骨方向剪开。使用止血钳逐片剥离顶骨。如需暴露嗅球，可进一步剪开并移除额骨部分骨质。
  19. 将头部倒置，使用解剖铲小心撬起脑组织，同时用铲切断视神经和三叉神经以分离脑组织。将脑组织收集至离心管中，并立即在干冰上速冻。
  20. 若已注射染料，脑室系统将呈现蓝色染色。使用一次性刀片在注射部位（图2A、B）及后方约1 cm处（图2C）切开脑组织，以观察染料在脑室内的分布情况。
  21. 为取出脊髓，沿大鼠背部正中线剪开皮肤以暴露脊柱。围绕脊柱做双侧切口，并在腰段脊髓尾端横向切断脊柱，完整切除脊柱段。
  22. 使用剪刀沿脊柱双侧椎板剪开，直至整个脊髓完全暴露。从一端（如头端）提起脊髓，沿尾向方向逐一切断脊神经，直至完全分离脊髓。将脊髓收集至离心管中，并立即在干冰上速冻。
    注意：为数据分析需要，应在采集器官前后称量所有离心管重量。如实验需要，可在采集脑脊液后、取脑前冲洗脑室系统，以清除脑室内残留药物。使用装有生理盐水的1 mL注射器连接导管和注射套管，插入引导套管中，注入2–3 mL生理盐水。生理盐水应从小脑延髓池开口处流出。引导套管、假套管和螺钉可通过在丙酮中浸泡24小时，随后用医用洗涤剂和水浸泡清洗的方式重复使用。干燥后，可用精细镊子去除残留的牙科水泥。

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结果

所介绍的手术方案非常成功，经过培训的外科医生能够达到 >99.8%的存活率，且术后第1天动物体重稳定，与术前第0天体重相比无显著变化（第0天平均体重 ± 标准差为 315.8 g ± 42.1 g，第1天为 314.1 g ± 43.0 g） 图3).

在采集脑脊液（CSF）之前，可通过植入的套管注射1.1%伊文思蓝染料，以确认注射液已送达目标位置。所采集的脑脊液将呈蓝色（图1），脑组织中的脑室系统也将呈蓝色（图2）。

该方法有助于全面研究药代动力学，可在术后不同时间点采集样本。

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讨论

研究人员和临床医生采用脑室内注射（ICV）来绕过血脑屏障（BBB）的保护机制，将药物直接递送至中枢神经系统12,18,19,21,24。本研究提供了一套完整的脑室内注射方案，用于高效地将药物递送至中枢神经系统，并采集脑脊液（CSF）以进行药代动力学分析。在实验初期、该方案首次在实验室建立时，可通过已植入的套管注射伊文思蓝染料来确认注射位点。如果使用不同品系或不同年龄的大鼠，此步骤尤为重要且必要，因为此时可能需要采用不同的定位坐标。在实验动物中另一种可选方法是注射血管紧张素II并观察动物随后的饮水行为；然而，该方法可靠性较低38。

药物引起的神经毒性可能是鞘内给药（ICV）的一个限制因素

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢墨尔本大学生物医学科学动物实验中心在实验动物提供与护理方面给予的支持。本研究获得了美国国立卫生研究院下属国家过敏与传染病研究所的研究资助（R01 AI146241，GR 和 TV）。JL 是澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC）首席研究员。本内容仅由作者负责，不代表国家过敏与传染病研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮Terumo, 日本SS+01T
5 mL 注射器Terumo, 日本SS+05S
丙酮Merck, 德国67641
实验台防护垫Halyard, 美国2765-C
聚维酮碘（Betadine）Mundipharma, 荷兰1015695
布托啡诺；TemgesicClifford Hallam Healthcare, 澳大利亚1238366
卡洛芬Zoetis, 澳大利亚10001132
氯己定Tasman Chemicals, 澳大利亚890401
Chux 超级擦拭巾（或同等产品）Chux, 澳大利亚n/a已高压灭菌
电动剪毛器n/an/a
棉签LP Italiana, 意大利112191已高压灭菌
牙科水泥粉末（Vertex 自固化粉末）Henry Schein, 美国VX-SC500GVD5
牙科水泥溶剂（Vertex 自固化液体）Henry Schein, 美国VX-SC250MLLQ
一次性针头：18 G、26 G、30 GTerumo, 日本NN+2525RL
一次性手术刀片Westlab, 澳大利亚663-255
解剖剪刀F.S.T.14082-09
假性套管（Dummy cannulas）Bio Scientific, 澳大利亚C313DC/SPC剪裁至 4.05 mm 以适配导向套管
80% 乙醇Merck, 澳大利亚10107
伊文思蓝染料SigmaE2129 - 50G
眼用润滑膏Clifford Hallam Healthcare, 澳大利亚2070491
记号笔Sharpie, 美国D-4236
光纤光源n/an/a
扁平针头（18 G）或类似工具用于涂抹速干胶n/an/a
拉制玻璃微量移液管Hirschmann Laborgeraete, 德国9100175
10 µL 玻璃注射器Hamilton, 美国701 LT 和 1701 LT
导向套管Bio Scientific, 澳大利亚C313G/SPC22 G，成年 Sprague Dawley 大鼠侧脑室插管时，从基座下方剪短 4 mm
止血钳
热珠灭菌器Inotech, 瑞士IS-250
加热垫n/an/a
3% 过氧化氢Perrigo, 澳大利亚11383
诱导室（有机玻璃，300 mm × 200 mm）n/an/a
注射套管Bio Scientific, 澳大利亚C313I/SPC剪裁至适配 4 mm 套管并延伸 0.5 mm
异氟烷Clifford Hallam Healthcare, 澳大利亚2093803
异氟烷挥发罐及配套废气清除系统n/an/a
中号称量舟n/an/a
金属刮刀Met-App, 澳大利亚n/a
微量注射泵New Era, 美国NE-300
微型钻机RWD Life Science Co, 中国87001
多粘菌素 BBeta Pharma, 中国86-40302
蛋白低吸附管，0.5 mLEppendorf, 德国Z666491
1% 罗哌卡因；NaropinAstraZeneca, 英国PS09634
大剪刀F.S.T.14511-15
小剪刀F.S.T.14079-10
螺丝刀n/an/a
螺钉Mr. Specs, 澳大利亚n/a
立体定位仪RWD Life Science Co, 中国n/a必要组件：大鼠耳杆、门齿固定杆、麻醉鼻罩、带数字显示（X、Y、Z）的机械臂及套管固定夹
无菌生理盐水 0.9%Baxter, 美国AHB1323
Super etch（37% 磷酸）凝胶SDI Limited, 澳大利亚8100045
速干胶UHU, 德国n/a
带钩组织镊F.S.T.11027-12
PE-50 导管Bio Scientific, 澳大利亚C313CT

参考文献

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