方法文章

成像引导式生物反应器用于生成生物工程化气道组织

DOI：

10.3791/63544

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2022年4月6日

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1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

本文内容

摘要

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该方案描述了一种可实现成像的生物反应器，可用于选择性去除大鼠气管的内源性上皮，并使外源细胞在管腔表面均匀分布，随后进行长期培养 体外 细胞-组织构建物的培养。

摘要

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反复损伤气道组织可能损害肺功能，并导致慢性肺部疾病，例如慢性阻塞性肺疾病。再生医学和生物反应器技术的进步为体外培养功能性组织和器官结构提供了可能，这些结构可用于药物筛选、疾病建模以及组织替代工程。本文介绍一种微型化生物反应器，结合成像技术，可实现 原位 移植大鼠气管内腔的可视化观察 体外 组织操作和 描述了一种利用该生物反应器进行的培养方法。通过使用此生物反应器，该方案展示了在保留气道组织基质固有的生化特性及超微结构的前提下，基于成像引导选择性去除内源性细胞成分的过程。此外，还实现了外源性细胞在脱细胞气道腔内的递送、均匀分布以及后续的长期培养，并结合光学监测进行实时观察。 原位 结果显示，成像引导的生物反应器有望用于促进功能性组织的生成 体外 气道组织

引言

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呼吸道腔面由一层上皮覆盖，主要由多纤毛细胞、克拉拉细胞、杯状细胞和基底干细胞组成1,2上皮层作为肺部的主要防御机制，发挥着生物物理屏障的作用，可保护下层气道组织免受吸入性病原体、颗粒物或化学气体的侵害。它能够保护气道组织 通过 多种机制，包括细胞间紧密连接的形成、黏液纤毛清除作用，以及抗菌和抗氧化物质的分泌3,4受损的气道上皮与慢性阻塞性肺疾病（COPD）等严重的呼吸系统疾病相关5，原发性纤毛运动障碍（PCD）6，以及囊性纤维化（CF）7.

肺芯片（lung-on-chip, LOC）技术的进步为研究人类肺部发育、模拟多种肺部疾病以及开发新型治疗材料提供了机遇，且可在高度可控的环境中进行 体外 环境。例如，可将气道上皮和内皮细胞培养在一层薄的多孔膜的相对两侧，以模拟肺部气体交换组织，从而实现准确的疾病建模和药物测试8同样地， 体外 已创建疾病模型以模拟气道疾病 体外，例如慢性阻塞性肺疾....

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方案

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以下动物组织实验方案已获得斯蒂文斯理工学院动物护理与使用委员会（IACUC）的动物福利指南和法规批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物使用的规定。

1. 成像引导大鼠气管生物反应器的设计与构建

  1. 大鼠气管生物反应器的设计与构建
    1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件创建生物反应器腔室的计算机辅助设计（CAD）模型，包括相关设计结构，如进液口、出液口和组织培养腔室。本研究采用如下所示的几何形状和尺寸 图1A- CCAD生成器软件的使用教程可参见16,17.
    2. 将生成的CAD模型导出至计算机数控（CNC）控制器软件，并使用CNC机床切割聚四氟乙烯（PTFE）塑料，以制作生物反应器腔室。CNC控制器软件的使用教程可参见18.
      注意：除了聚四氟乙烯（PTFE）之外，也可使用其他塑料材料（如超高分子量聚乙烯（UHMWPE）和聚醚酰亚胺）来制备培养室。
    3. 对所有生物反应器组件（如鲁尔接头和螺丝）进行灭菌，以避免装置中培养的组织和细胞受到污染。在洁净环境中将所有生物反应器组件组装到主组织培养室....

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结果

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基于GRIN透镜的 原位 成像方式可实现气管内腔的可视化 原位 (图 5A）。利用该成像方法，可获得天然气管和去上皮化气管的明场与荧光图像（图5B，C）。在CFSE标记前，未观察到天然气管有荧光信号图 5Bii）。然而，当使用CFSE染料标记气管上皮时，可在整个上皮中观察到均匀的荧光信号（绿色）图5Ci）。去上皮化后 通过 SDS 和振动辅助气道灌洗后，荧光信号强度显著降低（图 5Cii)，表明上皮已被消融。

去上皮化气管的H&E染色图像显示，气管管腔内的假复层上皮已被去除，而下层组织中的细胞及细胞外基质（ECM）微结构得以保留（图6A

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讨论

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在本研究中，我们构建了一种成像引导式生物反应器，可实现（i）对气管管腔的监测 原位 在细胞清除和外源性细胞递送之后，以及（ii）长期 体外 细胞接种气管组织的培养。利用这种定制的生物反应器，我们实现了：（i）使用去污剂结合振动辅助气道冲洗，选择性去除气管管腔内的内源性上皮细胞；（ii）通过负载细胞的I型胶原预凝胶，将外源性细胞均匀分布于去细胞化气管的管腔表面。此外，基于GRIN透镜的成像方法证实了上皮层的去除。 原位此外，通过进一步分析，包括H&E、三色染色、五色染色、免疫荧光染色和扫描电镜观察，我们证实了上皮层已被去除，而下层组织的结构和组分得以保留。此外，基于GRIN透镜的成像显示，当使用I型胶原预凝胶作为递送载体时，新植入的外源性间充质干细胞（MSCs）呈均匀分布。最后，植入的细胞在去上皮化的气管上存活并增殖，凸显了该生物反应器在细胞接种气道组织长期培养中的有效性。

脱上皮化方案中的关键步骤是在气管腔内形成一层薄的去垢剂溶液。在目前的脱细胞方案中，长时间使用多种化学试剂和酶的循环处理，会减少胶原纤维、糖胺聚.......

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披露

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作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

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本研究部分得到了美国胸科学会基金会研究项目、新泽西州健康基金会和美国国家科学基金会（CAREER奖2143620）对J.K.的资助；以及美国国立卫生研究院（P41 EB027062）对G.V.N.的资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1× PBSGibco，赛默飞世尔科技10-010-031
三通连接器World Precision Instruments14048-20
4端口连接器世界精密仪器公司14047-10
加速度计意法半导体IIS3DWBTR
消色差双合透镜ThorlabsAC254-150-A-ML
铝制样品台TED PELLA16111
抗生素-抗真菌剂赛默飞世尔科技15240062
组装杆ThorlabsER1
圆头螺丝McMaster-Carr91255A274
笼盒立方体ThorlabsC4W
碳双面导电胶带TED PELLA16073
CFSE 标记试剂盒Abcamab113853
Citrisolv（透明剂）去污1061
C型接口适配器ThorlabsSM1A9
I型胶原蛋白Advanced BioMatrix5153
导电液态银漆TED PELLA16034
二向色镜SemrockDI03-R488反射激光波长：  473.0 ± 2 nm 488.0 +3/-2 nm
杜尔贝科改良伊格尔培养基’s 培养基Gibco，赛默飞世尔科技11965118
雌性鲁尔接头转软管接头适配器Cole-ParmerEW-45501-30
雌性鲁尔接头转管用凸缘Cole-ParmerEW-45508-03
雌性至雄性鲁尔接头Cole-ParmerZY-45508-80
胎牛血清Gibco，赛默飞世尔科技10082147
滤光片Chroma Technology CorpET535/50m
荧光显微镜尼康Eclipse E1000 - D
Fusion 360Autodesk
六角螺母McMaster-Carr91813A160
六甲基二硅氮烷（HMDS）Fisher ScientificAC120585000
成像光纤SELFOC，NSG 集团GRIN透镜
激光光引擎MDL-D-488-150mW
透镜管ThorlabsSM1L40
LIVE/DEAD 存活率/细胞毒性检测试剂盒（Invitrogen）赛默飞世尔科技L3224
MACH 3 数控控制软件新式解决方案
物镜OlympusUCPLFLN20X
蠕动泵Cole ParmerL/S 标准数字泵系统
重组人碱性成纤维细胞生长因子PeproTech100-18B
卡环ThorlabsSM1RR
科学级CMOS相机PCO 熊猫PCO Panda 4.2
十二烷基硫酸钠VWR97064-472
Solidworks（2019）达索系统è间充质干细胞
可堆叠透镜管ThorlabsSM1L10
低音炮板式放大器Dayton AudioSPA250DSP
低音扬声器Dayton AudioRSS21OHO-4膈肌直径：21 cm
注射泵World Precision InstrumentsAL-4000
螺纹笼式钢板ThorlabsCP33
螺纹鲁尔接头适配器Cole-ParmerEW-45513-81
管镜ThorlabsAC254-150-A-ML
Tygon 管Cole-Parmer13-200-110
XY 翻译器ThorlabsCXY1

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of N....

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