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用于细胞外囊泡分析的冰冻断裂电子显微镜技术

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DOI：

10.3791/63550

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2022年9月16日

 ,  ,  , 
1Faculty of Medicine, Institute of Cell Biology, University of Ljubljana

本文内容

摘要

我们介绍一种分离和冷冻断裂源自癌性尿路上皮细胞的细胞外囊泡（EVs）的实验方案。冷冻断裂技术揭示了EVs的直径和形状，以及作为其独特特征的EV膜内部结构。这些信息对于理解EVs如何与受体细胞膜相互作用具有重要意义。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是一类由细胞释放到细胞外空间的膜包被结构，参与细胞间的通讯。EVs 包含三种类型的囊泡，即微囊泡（MVs）、外泌体和凋亡小体。EVs 的限界膜在与靶细胞相互作用中起关键作用，可介导生物活性分子向靶细胞的转移，从而影响靶细胞的行为。冰冻断裂透射电镜技术可用于研究生物膜的内部结构。本文介绍了一种从培养的尿路上皮癌细胞中分离微囊泡并对其进行冰冻断裂的实验方案，包括快速冷冻、断裂、制备和清洗复型，以及利用透射电子显微镜进行观察分析。结果表明，该分离方案可获得形态和大小均一的 EVs 群体，符合微囊泡的特征。限界膜的原生质面主要分布有膜内颗粒。因此，冰冻断裂技术是表征微囊泡直径、形态及膜蛋白分布的理想方法。本方案同样适用于其他类型细胞外囊泡的研究。

引言

细胞外囊泡（EVs）是由细胞释放到细胞外空间的膜包被囊泡。EVs 主要分为三种类型：外泌体、微囊泡（MVs）和凋亡小体，它们在来源、大小和分子组成上有所不同1,2,3。EVs 的组成反映了供体细胞的分子特征及其生理状态（即健康或疾病状态）4,5。这使得 EVs 在人类疾病的诊断、预后评估和治疗方面具有巨大潜力，并在个体化医学领域展现出良好的临床应用前景6,7,8。

细胞外囊泡（EVs）是细胞间通讯的媒介，含有具有生物活性的蛋白质、脂质和RNA，这些物质可干扰受体细胞内的生物学过程，并改变其行为9,10。然而，EV 限制性膜的组成对于其与受体细胞膜的相互作用至关重要。

细胞外囊泡（EVs）的来源包括体液和条件培养基。为了分离特定的EV群体，必须采用合适的分离技术。例如，在10,000 × g 条件下进行离心可获得富含微囊泡（MVs）的组分，而在≥100,000 × g的离心力下则可获得富含外泌体的组分11,12。所分离的EV组分必须在纯度、大小和形态方面进行验证。为此，国际细胞外囊泡学会2018年推荐了三类高分辨率成像技术：电子显微镜、原子力显微镜以及基于光学显微镜的超分辨率成像技术13。然而，这些技术均无法提供关于EV膜内部结构的信息。

冷冻断裂电子显微术是一种通过断裂冷冻样品以揭示其内部结构的技术，尤其能够观察膜的内部结构。样品制备的步骤包括：（1）快速冷冻，（2）断裂，（3）制备复型，以及（4）清洗复型14。在第1步中，样品可选择性地进行化学固定，用甘油进行冷冻保护，并在液态氟利昂中冷冻。在第2步中，将冷冻的样品置于冷冻断裂装置中进行断裂，从而暴露膜双层的内部。在第3步中，对暴露的断裂面用铂（Pt）和碳（C）喷镀形成复型。在第4步中，去除有机材料。随后在透射电子显微镜（TEM）中分析复型。为了准确解读显微图像，必须遵循正确的图像取向判读指南14,15。简而言之，显微图像中阴影的方向可用于确定图像的取向（即判断Pt喷镀的方向），并据此识别凸面与凹面结构（图1）。由于冷冻断裂导致膜双层发生分离，可观察到两种称为膜双层断裂面的内部视图：原生质面（P面）和外生质面（E面）。P面代表与细胞原生质相邻的膜小叶，而E面代表与细胞外空间相邻的膜小叶。整合膜蛋白及其聚集体在图像中表现为突出的膜内颗粒14,15。

本研究旨在应用冷冻断裂技术，对微囊泡（MVs）的大小、形状及其限界膜结构进行表征。本文提供了一种从人侵袭性膀胱癌尿路上皮细胞来源的微囊泡中分离并进行冷冻断裂的实验方案。

方案

1. 癌性尿路上皮细胞的培养及EV的分离

注意：本文介绍了一种从人侵袭性膀胱癌尿路上皮（T24）细胞系中获取细胞外囊泡（EVs）的方案。然而，若要使用其他细胞类型，则必须优化培养条件。

  1. 将T24细胞以3 × 104 个细胞/cm2 的密度接种于三个培养瓶（培养表面积为75 cm2）中，并在37 °C、5% CO2 条件下的CO2 培养箱中培养3天（图2A）。
    1. T24细胞培养使用A-DMEM与F12培养基按1:1（v/v）比例混合的培养液，添加5%胎牛血清（FBS）、4 mM Glutamax、100 mg/mL链霉素和100 U/mL青霉素。
      注意： 以下分离步骤获得的细胞外囊泡（EVs）富含微囊泡（MVs）。在开始分离前，使用光学显微镜检查细胞，确认其活力和融合度（图2B）。当T24细胞达到70%融合度时，开始从条件培养基中收集EVs。
  2. 用移液器将含有MVs的培养基从培养瓶（T75）转移至锥形离心管中（图2C），在4 °C下以300 × g 离心10分钟（图2D）。
  3. 用移液器小心地将上清液转移至新的离心管中（图2E）。
  4. 在4 °C下以2,000 × g 离心20 分钟 ，温度 保持在4 °C。
  5. 用移液器小心地将上清液转移至新的离心管中。
  6. 在4 °C下以10,000 × g 离心40分钟，观察离心管底部是否出现乳白色沉淀。
    注意：如有需要，更换离心转子以达到所需的离心力。EV沉淀在离心管底部呈现为白色沉淀物（图2F）；标记其位置，以避免在移液过程中丢失沉淀（图2G）。
  7. 用移液器小心弃去上清液。向沉淀中加入1.5 mL PBS，重悬含有MVs的沉淀，并将悬液转移至新的离心管中。
  8. 在4 °C下以10,000 × g 离心40分钟，观察离心管底部是否出现白色沉淀。
    注意：EV沉淀在离心管底部呈现为白色斑块；标记其位置，以避免在移液过程中丢失沉淀。
  9. 用移液器小心移除固定液。向沉淀中轻柔加入固定剂（0.1 M卡可基酸钠缓冲液（pH 7.2）中含2.5%戊二醛），在4 °C下静置20分钟（图2H）。
    警告：戊二醛和卡可基酸钠具有毒性。操作时应在通风橱中进行，佩戴防护手套，并妥善处理废弃物。
  10. 用移液器小心移除固定剂。向沉淀中加入洗涤缓冲液（0.1 M卡可基酸钠缓冲液），在4 °C下静置10分钟，期间不要重悬沉淀。

2. 细胞外囊泡（EVs）的冷冻

注意：冷冻前，需先用甘油对样品进行冷冻保护。

  1. 配制0.1 M二甲胂酸钠缓冲液。去除洗涤缓冲液，加入50 µL含30%甘油的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液。轻柔重悬EVs，使溶液均匀。在4 °C下孵育30分钟。
  2. 用氯仿在超声波清洗机中清洗带有中心凹坑的铜载网5分钟（图3A）。将它们风干，若使用多个样本，可用不同颜色标记图3B)。使用前将载体置于干燥、洁净处（例如置于培养皿中的镜头纸上）。切勿用手直接接触载体。
    1. 准备移液器、溶液、滤纸、镊子、体视显微镜、装有氟利昂和液氮（LN₂）的杜瓦瓶2），一根金属棒和冻存管。用液氮将其冷却2.
      警告：操作液氮（LN）时应佩戴防护装备，并采取相应的安全措施2 和冷却的氟利昂。
  3. 再次悬浮EVs后再进行冷冻。避免产生气泡。
    注意：请迅速完成步骤 2.4–2.7。
  4. 在体视显微镜下操作（图3C将1.5–1.7 µL样品转移至铜载网中央凹槽内，形成一个高于铜载网边缘的凸液滴，注意避免样品溢出边缘。图3D）。若发生溢出，使用滤纸擦干载体外圈。
  5. 将凝固的氟利昂与金属棒混合，使其再次液化（图3E).
  6. 用镊子夹住铜载网的外圈，将其浸入冷却的氟利昂中，同时轻轻晃动镊子，持续8秒（图3F。8 秒后，迅速将载样器转移至另一装有液氮的杜瓦瓶中2.
  7. 立即进行样品破碎或将其储存在液氮中2在后一种情况下，标记一个冻存管，并通过将其浸入液氮中来冷却冻存管和镊子尖端2 (图3G）。在LN下2，将冷冻的铜载网收集到样品瓶中，盖紧瓶盖，并储存在液氮中2 容器（图3H直至冷冻断裂。

3. 细胞外囊泡的断裂及复制品制备

注意：根据制造商的操作说明准备冷冻断裂装置。（图4A）清洁装置的腔室。将铂（Pt/C）和碳（C）喷镀枪分别置于45°和90°角度（图4B）。

  1. 启动设备的真空系统。当压力达到 6.6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr) 时，将样品室冷却至 −150 °C。
  2. 使用干燥镊子将带有冷冻样品的铜载网转移至冷冻断裂装置中（图 4C）。应采用低温转移或快速操作，以避免样品融化及冰晶沉积。将载网固定在样品台上。
  3. 等待真空再次达到 6.6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr)，然后将刀温设定为 −100 °C（图 4D）。
  4. 等待真空达到 1.0 × 10−3 Pa (8 × 10−6 Torr)。
  5. 通过双目显微镜观察样品，并小心地将刀靠近样品（图 4E）。
  6. 开启刀具的电动移动功能，开始切片（图 4F），持续切片直至样品表面平滑（图 4G）。
  7. 进行断裂时，关闭刀具的电动移动功能，改用缓慢的手动控制推进刀具，使样品发生断裂（图 4H）。为防止断裂面在喷镀前形成冰晶或受到污染，应将刀移至断裂样品上方加以遮挡。
  8. 进行 45° 铂（Pt）喷镀（图 4I，J）。
    1. 准备秒表和/或开启冷冻断裂装置上的石英晶体监测仪，以监控样品上 Pt 镀层的厚度。建议的 Pt 层厚度为石英晶体监测仪读数 2.5 nm，对应在特定高电压和电流条件下的 4 秒喷镀时间（即 Pt 喷镀速度为 0.63 nm/s）。
    2. 开始喷镀前，将刀移离样品。对 Pt/C 枪施加高电压（1,600 V），并将电流升至 60 mA。此时应出现 Pt 火花并开始对样品进行喷镀。此时启动 4 秒倒计时和/或观察并记录石英晶体监测仪上 Pt 的位置。
      注：建议的碳（C）层厚度为 2.5 nm，对应在特定高电压和电流条件下的 10 秒喷镀时间。
    3. 当达到所需 Pt 厚度时，关闭电流和高电压。
  9. 进行 90° 碳（C）喷镀（即 C 喷镀速度为 0.25 nm/s）。
    1. 对碳枪施加高电压（1,900 V），将电流升至 90 mA，此时应出现碳火花并开始对样品进行喷镀；在此时刻启动 10 秒倒计时。当达到所需碳层厚度时，关闭电流和高电压。

4. 复制品的清洗与复制品分析

  1. 使用样品台上的铜载网，用镊子将其转移至瓷制12孔板中室温的蒸馏水中（图4K）。复型将漂浮在水面上，而铜载网则会下沉（图4L）。
  2. 用金属环将复型从蒸馏水中转移至含有次氯酸钠的孔中。盖上盖子，在通风橱中室温下静置过夜。
    注意：次氯酸钠具有毒性。操作时应在通风橱内进行，佩戴防护手套，并妥善处理废弃物。
  3. 将复型转移至ddH2O中，清洗30分钟。重复此步骤3次。
  4. 用金属环将复型转移至铜制透射电镜载网上（例如，方形或蜂窝状100目以上载网）。将载网在空气中干燥2小时，然后存放在载网储存盒中，直至进行显微观察。
    备注：通常情况下，载网可在避光、干燥、室温条件下保存数月。
  5. 使用透射电子显微镜（TEM）对复型进行成像，获取显微照片。
    1. 具体操作为：将带有复型的TEM载网插入显微镜，按照制造商的操作手册开始TEM成像。工作电压选择80 kV或100 kV。
  6. 观察样品，并通过TEM相机在低倍和高倍下采集显微照片。
  7. 分析微囊泡（MV）的显微照片。测量MV直径时，使用Fiji/ImageJ软件16。根据Hallett等人的方法17，MV的实际直径为显微照片上测量值的4/π倍。

结果

通过差速离心法从膀胱癌T24细胞的条件培养基中分离微囊泡（MVs）。根据实验方案，首先在10,000 × g离心后检测细胞外囊泡（EV）组分。 g 当观察到白色沉淀时（图 2G).

接下来，按照上述方案处理EVs，并在透射电子显微镜（TEM）下进行观察。Pt/C喷镀产生的复制膜（图4L）相对较大，在清洗步骤中经常碎裂成较小的片段。在TEM载网上挑选出较大的复制膜及其较小的碎片，并在显微镜下进行比较。结果显示，无论复制膜大小如何，其表面质量均无差异，因此均可用于分析。低倍镜观察显示复制膜区域包括：i）均一的表面（背景），ii）凹形和凸形球面轮廓（囊泡），以及iii）表面受损区域（伪影； 图5A）。典型的伪影表现为破裂、折叠以及不规则的较暗阴影（即标本上冰晶沉积物的复制结构）。还需注意的是，未观察到任何细胞碎片或细胞器，证实了样品的纯度（图5B）。

分离得到的囊泡通常以三个或更多为一组聚集存在，或呈单个分布（图5B）。囊泡呈球形，表明其在分离、固定和冷冻过程中超微结构得到了良好保存（图5C）。偶尔可见“扁球状”或拉长形的囊泡（图5C），这些可能为制备过程中的假象，因此未纳入后续囊泡直径的测量统计。可见切面轮廓的直径为238.5 nm（±8.0 nm，n = 190），根据Hallett等人提出的校正系数进行修正后17，对应囊泡的平均直径为304 nm（±10 nm；图5D）。该尺寸范围符合微囊泡（MVs）直径在100 nm至1000 nm之间的特征，证明了所用分离方案的有效性。囊泡的电镜图像结合直径测定结果明确证实，所获得的细胞外囊泡（EVs）样品中富含微囊泡（MVs）。

对复制品的分析揭示了微囊（MV）限界膜的P面和E面的结构组织。微囊呈现为凹形和凸形的圆形结构（图5C、E、F），反映了断裂面的位置。凸形结构代表E面（即膜的外质层断裂面；图5E）。细胞外囊泡（EVs）的外质面呈现出光滑且均匀的外观。凹形结构对应P面（图5F）。在P面上，光滑的膜内可见少量突出的膜内颗粒（图5C、F）。这表明从肿瘤尿路上皮T24细胞中分离出的微囊仅含有少量膜蛋白。

冰冻断裂示意图：显示膜断裂与投影，以及E面和P面脂质双层的分离。
图1：冰冻断裂后膜结构的示意图。（A）微囊泡从质膜向外出芽进入细胞外空间。（B）在冰冻断裂前，微囊泡由P面和E面脂质层所包绕；冰冻断裂使脂质双层分离，暴露出脂质层的内部结构，称为断裂面。（C）经铂/碳投影后，可分辨出两个断裂面：原生质面（P-face），呈凸形，朝向细胞质（原生质）；外生质面（E-face），呈凹形，朝向细胞外空间。图1 使用 Biorender.com 制作。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞培养与分析；显微镜观察、移液、离心；实验室实验设置。
图 2：EVs 的分离。（A）在 CO2 培养箱中培养的 T24 细胞，通过（B）光学显微镜观察，以确认其活力和汇合度，再进行微囊泡（MV）的分离。（C）收集细胞培养基，并（D）依次在 300 × g 和 2,000 × g 条件下进行离心，（E）每次离心后均收集上清液。（F、G）在 10,000 × g 离心后，可见指示沉淀的白色斑块并予以标记。弃去上清液后，（H）小心地向沉淀中加入固定剂，避免重悬沉淀。请点击此处查看该图的放大版本。

纳米颗粒制备与分析；显微镜与冷冻技术装置；实验步骤。
图3：细胞外囊泡（EVs）的冷冻。（A）预先将洁净的铜载网在空气中干燥，其具有一个中央凹坑；（B）在处理前对铜载网进行标记。（C）在体视显微镜下，将微囊泡重悬于甘油中以获得均一的样品，并加入到铜载网的中央凹坑内。（D）需加入适量样品，使其在中央凹坑内形成凸起的液滴。（E）在冷冻前立即使用金属棒搅拌液氮（LN2）冷却的氟利昂，使其液化。（F）将样品浸入氟利昂中进行冷冻，随后（G）转移至液氮（LN2）中。（H）含有冷冻样品的载网可收集至冻存管中，并储存在液氮（LN2）杜瓦瓶容器内。请点击此处查看该图的放大版本。

用于材料分析的真空镀膜系统装置，包括切片机、样品制备和铂/碳枪。
图 4：冷冻断裂与复型制备。 （A）冷冻断裂装置。装置腔室内部（B）包含一个铂（Pt）和碳（C）电子枪、一把刀和样品台。（C）开始断裂前，携带样品的载具被转移至样品台，（D）冷冻断裂装置被冷却，并建立真空环境。（E）切片通过电机驱动（F）移动刀具完成，但断裂步骤建议手动操作。（G）切片前的样品和（H）断裂后的样品。（I）断裂后立即进行复型。（J）在此过程中，铂被喷镀到样品表面。腔室内可见铂喷镀产生的明亮火花。（K）样品载具被收集到盛有水的瓷皿中。（L）清洗步骤中，复型（箭头所示）漂浮在次氯酸钠溶液中。请点击此处查看该图的放大版本。

显示囊泡表面的电子显微镜图像；包括囊泡直径图；结构分析。
图 5：冷冻断裂并经铂/碳投影的微囊泡（MVs）的电子显微照片。 （A）冷冻断裂并投影的细胞外囊泡（EV）沉淀物的概览（i），放大倍数较低。均质表面为背景（ii），明亮区域为复制品的破裂处（iii），较暗区域为复制品的褶皱（星号），不规则且较暗的阴影由冰晶造成（双星号）。（B）具有凹面和凸面的圆形EV簇。（C）EV的高倍放大图像。在显示EV膜P面的凸面断裂中，可见膜内颗粒（箭头）和平滑表面区域（箭头头）。还发现具有拉长形（星号）和平球形（双星号）的细胞外囊泡。（D）根据Hallett等17提出的方法进行尺寸测量，分离得到的尿路上皮微囊泡（MVs）的平均直径为304 nm ± 10 nm。数据以均值±标准误（SEM）表示。（E、F）MVs的E面和P面。图注：箭头 = P面上的膜内颗粒，带圆圈的箭头 = 铂/碳投影方向。比例尺：A = 10 µm，B-F = 400 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在开展下游分析（如"组学"研究或功能研究）之前，首先对微囊泡（MVs）或任何其他分离的细胞外囊泡（EVs）群体进行表征至关重要11,18。本文中，通过离心法从人侵袭性膀胱癌尿路上皮T24细胞中分离EVs，并按照所提供的方案进行冷冻断裂电子显微镜分析，结果表明所分离的组分富含MVs11,13。该MVs分离物中无细胞碎片或细胞器污染，证实了分离与纯化方案的成功。

化学固定与冷冻相结合（该实验方案的关键步骤）能够保持细胞外囊泡（EVs）的球形形态12。然而，在通过冷冻断裂法评估EV直径时需采取预防措施17。由于断裂面随机穿过样品，微囊泡（MV）膜会被分裂为赤道面与非赤道面。为了提供一种严格分析冷冻断裂并投影样品图像的方法，Hallett 等人证明，囊泡的平均直径为图像上囊泡直径实际尺寸的4/π倍17。据此校正后，计算得出T24细胞来源的EVs直径为304 nm，处于微囊泡（MV）理论尺寸分布范围（100–1000 nm）之内19。

冷冻断裂技术可作为负染色法的补充，后者是用于观察细胞外囊泡（EVs）最广泛的透射电子显微镜（TEM）技术。在负染色法中，样品通常经过化学固定、干燥后附着于TEM载网，并用醋酸铀溶液进行染色增强对比。由于缺乏支撑介质，EVs容易塌陷，从而呈现杯状外观。而通过冷冻断裂技术，我们显示微囊泡（MVs）呈球形，这反映了它们在细胞外空间和体液中的真实形态12。因此，我们的结果也与冷冻超薄切片中对EVs的观察一致20。

冷冻断裂技术的一个关键优势在于其能够解析限定膜的内部结构，这对于理解细胞外囊泡（EVs）如何靶向并与其受体膜相互作用至关重要。本文中，我们分析了微囊泡（MVs）的膜结构，但冷冻断裂技术同样可用于揭示其他任何EV群体的膜组织特征。MVs通过质膜出芽形成，因此其膜上应含有质膜蛋白及蛋白聚集体。我们的结果支持T24细胞来源的MVs膜中含有内嵌膜颗粒，这些颗粒代表了整合膜蛋白。根据这些颗粒在E面与P面之间的分布特征，可以合理推测MVs中观察到的颗粒为跨膜蛋白——尿斑蛋白（uroplakins），这是尿路上皮细胞特异性的蛋白21,24。所观察到的颗粒分布稀疏，这与先前研究报道的在尿路上皮癌变过程中尿斑蛋白减少的现象一致21,22,23。然而，为进一步研究MV膜的蛋白质组成，建议采用冷冻断裂复型免疫标记技术（FRIL）。FRIL是本文所述冷冻断裂技术的升级版，专用于通过抗体识别来确定复型中蛋白质的身份24,25。总之，冷冻断裂技术是一种适用于表征EV限定膜以及分离EV组分形态、大小和纯度的电子显微镜技术。本文所述方案也可用于评估其他分离EV群体，因此，冷冻断裂技术值得被纳入国际细胞外囊泡学会（International Society for Extracellular Vesicles）关于EV限定膜结构研究的指导规范中。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由斯洛文尼亚研究署（研究核心资助编号 P3-0108 和项目 J7-2594）以及卢布尔雅那大学医学研究所 IP-0510 基础设施计划资助。本工作属于欧洲科学合作组织（COST）支持的 COST 行动 CA17116“围产期衍生物治疗应用转化研究国际网络”（SPRINT）的一部分。作者谨此感谢 Linda Štrus、Sanja Čabraja、Nada Pavlica Dubarič 和 Sabina Železnik 在细胞培养及样品制备方面的技术协助，以及 Marko Vogrinc、Ota Širca Roš 和 Nejc Debevec 在视频制备过程中提供的技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A-DMEMThermoFisher Scientific, USA12491015
Balzers 冷冻断裂装置Balzers AG, LiechtensteinBalzers BAF 200
离心机Eppendorf, Germany型号 5810R
CO2 培养箱 HeraCell Heraeus, Germany
铜载网BalzersBB 113 142-2100目以上
铜网栅SPI, United States2010C
培养瓶 T75TPP, 瑞士生长面积 75 cm²
F12 (HAM)Sigma-Aldrich, 德国21765029
胎牛血清（FBS）Gibco, Life Technologies, USA10500064
6孔釉面瓷板Fischer Scientific, 美国50-949-072
甘油Kemika, 克罗地亚711901终浓度 30 % (v/v)
戊二醛 Serva, 德国23114.01终浓度 2.5 % (v/v)
GlutaMAXGibco, Life Technologies35050-079终浓度 4 mM
青霉素Gibco, Life Technologies15140163终浓度 100 U/mL
相差倒置显微镜Nikon, 日本型号 Eclipse
转子Eppendorf, 德国A 4-44
转子 Eppendorf, 德国F-34-6-38
血清移液管TPP, 瑞士50 mL 容量
次氯酸钠水溶液Carlo Erba, 意大利481181
体视显微镜Leica, 德国
链霉素Gibco, Life Technologies35050038终浓度 100 mg/mL
透射电子显微镜Philips, 荷兰型号 CM100工作电压 80 kV
镊子SPI, 美国

参考文献

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