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小鼠创伤性周围神经损伤

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DOI：

10.3791/63551

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2022年3月25日

 ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Korea University Guro Hospital, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Center for Orthopaedics and Translational Science, The Pennsylvania State University College of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了小鼠坐骨神经的创伤性周围神经损伤（TPNI），包括精确校准的压迫损伤、严格对齐和错位的切割损伤，以及移植和非移植的神经缺损。我们开发了定制的传感器，用于评估使用常用工具诱导的神经损伤程度，以确保TPNI后结果的可重复性。

摘要

创伤性周围神经损伤（TPNI）是骨科创伤后导致病态的常见原因。在肌肉骨骼研究领域，长期以来一直致力于建立可重复且精确的神经损伤及肌肉去神经化方法。许多遭受创伤的肢体其神经损伤决定了患者的长期预后。多年来，研究人员已开发出多种精确的显微外科神经损伤方法，包括压榨伤、切割伤以及神经缺损移植术，从而实现可重复的结果评估。此外，新型的标准化压榨损伤方法被不断建立，其与用于评估人类患者的临床结果具有良好的相关性。通过遵循最小化操作变异性的原则，以确保神经损伤的变异性较低，这些模型还可进一步整合其他相关的组织损伤，例如直接的肌肉压榨伤以及肢体损伤的其他组成部分。最后，结合肌肉萎缩评估以及对行为学结果的精确分析，这些方法构成了一个完整的体系，能够真实地涵盖人类创伤性肢体损伤的各种要素，用于肌肉骨骼创伤的研究。

引言

创伤性周围神经损伤（TPNI）是骨科创伤后常见的致病原因1,2,3。每年约有3%的创伤患者发生神经损伤1,4，发病率为35万例5，导致5万例手术修复6。TPNI的严重程度范围广泛，其功能恢复直接取决于损伤的类型和严重程度7,8,9。较轻的创伤（例如轻度挤压、不完全撕裂等）首先会损伤髓鞘和轴突，而更严重的外力（例如重度挤压、完全撕裂等）则会破坏神经的结缔组织，例如除髓鞘和轴突外，还会损伤神经内膜、神经束膜和神经外膜1,10。TPNI患者期望神经功能最终能够恢复，肌肉萎缩得以逆转。尽管治疗技术不断进步，数十年的研究仍未能提供精确有效的治疗方法以促进或确保完全恢复11,12。

神经横断若无手术修复将无法愈合，而手术通常在显微镜下进行。修复通常采用端对端吻合方式，并力求确保吻合部位无张力。神经移植被用于保证修复过程无张力13,14。尽管这些修复方法看似先进，但功能恢复效果通常并不理想11,12。康复往往不完全且不尽人意。最佳的功能恢复需要再生的轴突跨越损伤部位（即神经桥接）并支配靶器官。然而，轴突错向生长或生长受阻会显著影响这一过程，导致肌肉萎缩并最终丧失恢复能力15,16,17,18。已有研究表明，神经修复后的功能结果（例如端对端缝合、同种移植等）依赖于束膜对接的精确性19,20。因此，准确对齐横断神经残端及其神经束对于神经修复至关重要；若缺乏这种精确性，即使轴突再生达到最佳状态，功能恢复仍可能较差。显微外科缝合修复本身即为一种创伤性操作，且目前在显著改善预后的新型方法方面进展甚微。该领域缺乏可重复的神经横断动物模型，而此类模型应能产生可预测的缺损，从而在功能和组织水平上实现可靠的恢复评估。若具备此类方法，将有助于表征神经再生过程，避免神经血管化变异及去神经支配后萎缩等干扰因素21,22。许多研究团队正致力于采用更优的模型以减少此类变异性。其中一种策略是尽量减少对神经的干预操作，并确保神经残端实现完全精确的对合。

这可以通过使用一种称为逐步切断并用纤维蛋白胶固定（stepwise cut and fibrin glue, STG）的标准外周神经横断技术来最佳实现。在该STG模型中，修复部位使用纤维蛋白胶固定，且缺损距离被标准化并最小化21,22纤维胶本身已用于人类的此类修复，原因可能相同，此外它还对修复后的瘢痕形成具有有益作用。23,24该方法的关键在于神经修复在切割损伤完成之前即已开始，从而确保了固定的损伤模式。当前方法在坐骨神经横断后的病理生理特征上与金标准的外膜缝合技术表现出高度相似性，且未观察到纤维蛋白胶对神经再生产生负面影响。在小鼠坐骨神经横断模型中，使用纤维蛋白胶进行修复相较于早期神经再生可改善轴突的延伸。 通过 缝合，这些发现与STG结果一致。STG还受益于最小操作原则，即在缝合定位过程中神经始终不被触碰。21这有效地标准化了模型中修复操作相关的神经创伤。类似的原则也被用于通过在粘合前翻转神经来研究错位问题。22这使得神经损伤之间能够进行直接比较，在几乎相同操作程度下，差异仅在于对合的排列情况，而无间隙增大或额外创伤。这有助于直接检验排列对神经损伤所致神经血管变化的影响。21,22，肌肉萎缩21,22，以及功能恢复21,22本研究是唯一能够对刻意且精确错位的神经残端进行研究的方法。

在创伤性周围神经损伤（TPNI）中，大多数神经并未完全断裂，不存在间隙或缺损，且似乎具备自我恢复的能力，但在许多此类病例中，肢体仍因神经损伤而长期功能障碍，且对干预措施反应不明确。实验性TPNI通常在啮齿类动物坐骨神经 crush 损伤（SNCI）模型上进行，使用锁紧式持针器（NDs）、镊子或类似工具，并依赖经验丰富的外科医生来制造精确且可重复的 crush 损伤25,26,27,28,29,30。SNCI动物模型依赖操作者自身的技术精度以控制压力变化，但该压力从未被明确测量。这导致动物之间以及不同研究之间的结果存在变异性，且缺乏关于标准化压力的明确指导。因此，若能精确施加并记录一系列强度已知且一致的损伤，预计将有助于推动TPNI领域的发展。理想的模型应使任何实验室或研究人员都能为每只动物施加已知严重程度的SNCI，从而实现真实可靠的研究间比较和设备可重复性。为解决这一不足，研制了一种独特的可校准数字化装置，内置力敏电阻（FSR），能够实时报告施加于神经的压力。随后，该装置被用于测试不同类型镊子和持针器所施加的多种 crush 损伤压力的可重复性31。

最后，开发了一种特定方法以解决神经缺损问题32。文献中神经缺损的建立通常是通过切除一段神经，再将其修复至缺损部位13,33,34。该手术操作常涉及缝合，且神经断端会发生不同程度的回缩21,32,34。基于使用同基因型 oversized 神经移植物可完全避免神经断端回缩的设想32，该方法要求同时对两到三只动物进行操作，取一段7 mm的移植物植入另一只动物的5 mm缺损处。如有需要，第二只动物的缺损尺寸还可用于修复第三只动物更小的缺损。该方法形成了一套完整的同步手术策略，确保供体神经始终大于神经缺损，从而实现无张力修复。结合最小化操作的要求，该策略为在同系动物中直接研究移植物长度提供了途径，避免了文献中普遍存在的非对称性移植物缺损问题20,32,34。

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方案

实验设计和动物操作方案已获宾夕法尼亚州立大学医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。研究采用10周龄、体重20-25 g的成年C57BL/6J雄性小鼠。动物饲养于无菌动物管理条件下的动物设施中，在开展研究前至少适应环境5天。

1. 动物准备

  1. 使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物对动物进行深度麻醉 通过 使用26 G针头进行腹腔注射。
  2. 剃除动物右侧后肢及下背部毛发，使用修毛器修剪，然后用无菌棉签蘸取10%聚维酮碘溶液进行清洁（参见 材料表).
  3. 使用无菌棉签将眼用润滑软膏涂抹于眼睛，以防止眼睛干燥。
  4. 准备完毕后，将动物置于恒温加热垫上（参见 材料表) 以维持体温在 37 °C。
  5. 将小鼠的后肢用胶带固定在加热垫上，并小心地对称放置，使膝关节与身体呈直角。
  6. 通过高压灭菌对所有手术器械进行灭菌，然后将其放置在无菌垫上。
    ​注意：外科医生在进行手术前必须佩戴无菌口罩、手术衣和手套。

2. 创伤性周围神经损伤（TPNI）模型构建

  1. 制备完成后，使用剪刀和精密体视变倍双目显微镜（参见材料表），沿股骨长度方向做一横向皮肤切口（约 2 cm）。
  2. 使用解剖剪和显微外科镊子，通过髂胫束钝性分离暴露坐骨神经（SN），避免对坐骨神经造成任何医源性机械损伤。
  3. 在完成TPNI手术（步骤4-9）后，使用外科缝钉闭合皮肤。所有动物均皮下注射缓释布托啡诺（0.05 mg/kg）（参见材料表）作为镇痛剂。
  4. 按照以下步骤进行坐骨神经压榨损伤（SNCI）。
    1. 将坐骨神经置于镊子尖端平面之间，位置约在三分叉处近端3 mm处（图1A）。
      注：必须格外小心，避免神经位置不正，否则会导致动物或组间实验结果出现变异。
    2. 使用校准过的镊子和定制铝制夹具（图1C）31,35进行SNCI，以在固定宽度（3.5 mm）上施加特定压力。
      注：使用校准镊子和定制钻孔夹具进行SNCI的数字压力传感器装置的详细信息，已在我们先前发表的报告中提及31,35。定制夹具通过在小块铝材上钻孔制成，其产生特定压力的效果已通过数字压力传感器验证，所用部件和规格均为公开且先前已描述31,35。
    3. 定位后，轻推夹具直至接触镊子限位块，保持30秒后缓慢释放夹具，并通过观察神经结构的改变确认损伤（图1B）。
      注：神经结构的改变可确认损伤程度，可在试验案例中通过显微镜验证。
    4. SNCI后，小心将神经埋入肌肉之间，避免术者造成医源性损伤。
      注：使用校准镊子造成的压榨损伤精确、可靠且可重复，这一点已通过精密夹持压力传感器装置验证31（图1D）。不同夹具与镊子组合在实时压榨损伤过程中的压力时间曲线如图2A、B所示。
  5. 进行横断与胶合（TG）操作。
    1. 使用解剖剪在坐骨神经三分叉处近端约3 mm处完全横断坐骨神经。
    2. 横断后，立即在横断部位周围涂抹10 µL纤维蛋白胶（参见材料表），以修复神经缺损并限制断端进一步移位。纤维蛋白胶的凝固时间约为15秒。
      注：由于神经回缩，横断后神经缺损大小不可控且随机，这可能成为影响结果的变量。
  6. 进行逐步横断与胶合（STG）操作。
    1. 使用解剖剪在坐骨神经三分叉处近端约3 mm处进行不完全横断（横断其宽度的80%），以防止缺损形成。
    2. 随后，在切口周围涂抹10 µL纤维蛋白胶，并在胶完全凝固前（约10秒内）将剩余20%的神经完全横断。
      注：该方法有效减少了因神经断端弹性回缩导致的缺损形成，同时避免了额外的手术操作，与TG模型不同（图3A）。
  7. 进行翻转横断并胶合（FTG）操作。
    1. 首先，从两侧各横断坐骨神经宽度的40%（图3B）。
    2. 将远端残端横向翻转，并在横断部位周围涂抹10 µL纤维蛋白胶。
    3. 随后，在纤维蛋白胶完全凝固前（约10秒内），完全横断中央剩余的20%神经。
    4. 在直视显微镜下确认完全横断。
  8. 按照以下步骤进行神经缺损与移植操作。
    1. 在分级神经缺损与移植模型中，成对使用小鼠进行一系列级联同基因神经移植32，用于一组实验。
    2. 在一只小鼠（例如小鼠#1）中，在右侧坐骨神经上创建7 mm（G-7/0）的神经缺损，即在坐骨神经三分叉处近端约3 mm处开始解剖，并使用无菌刻度尺向远端延伸7 mm（图3C）。
      注：通过解剖7 mm长的坐骨神经而不进行移植，创建不可修复的神经缺损。该小鼠标记为G-7/0，表示取下7 mm移植物但未进行修复。
    3. 解剖后，立即将横断的神经转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌培养皿中，并用10 µL纤维蛋白胶将小鼠#1的坐骨神经近端残端埋入肌肉下方。
    4. 随后，在小鼠#2中，在右侧坐骨神经上创建5 mm神经缺损，并使用纤维蛋白胶（10 µL，约10秒）在两端将从小鼠#1获取的7 mm神经段进行移植（G-5/7）（图3C）。
      注：移植过程中需特别注意，避免术者造成坐骨神经的错位或其他医源性损伤。
  9. 进行逐步横断与缝合（STS）操作。
    1. 沿坐骨神经宽度的80%进行部分横断（图3D），并使用9-0尼龙线进行外膜缝合修复残端。
    2. 完成后，横断神经剩余部分，并使用单根9-0尼龙线进行修复。
    3. 将神经翻转以暴露裂伤背面，使用两根9-0尼龙线完成修复。

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结果

定制的数字压力传感器装置（图1D通过检测力敏电阻器（FSR）在受力时电阻的变化来工作。该装置可感知并记录施加于其上的微小压力，响应时间为 <5 µs，采样速率为 20 Hz，压力范围为 2.5–25 lbs31. 镰钳的差异（图1C) 诱导的 SNCI (图1A，B）压力传感器装置所感知并指示的压力图1D）在图中表示为 图2A，B无间隙显微外科神经修复方法中的STG、FTG、Gap和移植以及STS示意图如图所示。 图3A-D 分别21

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讨论

TPNI 研究的历史已延续数十年11,12。早期在犬类及其他较大物种中进行的实验，确立了动物模型在研究 TPNI 结局中的重要性36,37,38。随着时间推移，这些模型逐渐转向使用小型啮齿类动物，并建立了已被广泛验证且常用的结果评估指标39,40,41。然而，这些模型在结果方面仍缺乏标准化，许多研究者在相同的损伤条件下报道了不同的效应21,26,28,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：K08 AR060164-01A）和美国国防部（DOD，项目编号：W81XWH-16-1-0725；W81XWH-19-1-0773）的资助，以及美国宾夕法尼亚州立大学医学院（赫尔希，宾夕法尼亚州 17033）的机构支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酒精消毒液COVIDIEN5110
丁丙诺啡ZooPharmBSRLAB0.5-211706
C57BL/6JJackson Laboratories, Bar HarborN/A
棉签Puritan25-8062WC
解剖剪ASSIASSI.SDC18R8
纤维蛋白胶-TISSEELBaxter1501263
力敏电阻（FSR）N/AFlexiForce A301
镊子FST-Dumont5SF Inox, 11252-00
GraphPad PrismGraphPad Software Inc.Version 8.4.3.
恒温加热垫Kent ScientificRJ1675
氯胺酮/KetavedVEDCOVED1220
显微外科镊Miltex Premium instrumentsBL1901
眼科润滑软膏Akorn Animal HealthNDC 59399-162-35
培养皿VWR25384-092
磷酸盐缓冲液Gibco14190-144
聚维酮碘SolimoL0017765SA
精密捏压压力传感器装置定制N/A
剪刀Miltex Premium21-536
立体变焦双目显微镜World Precision InstrumentsModel PZMIII
无菌手套Cardinal Health9L19E511
外科缝合钉3M-PreciseDS-25
手术胶带3M-Microphore1530-0
缝合线EthiconBV130-5
注射器BD syringe309597
剃毛器Philips ElectronicsMG3750
赛拉嗪/AnasedAkorn Animal Health, Inc.VAM4811

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