需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

通过质谱法对白细胞中的心磷脂进行指纹图谱分析以快速诊断巴特综合征

2.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63552

⸱

2022年3月23日

 ,  ,  , 
1Medical School, Swansea University, 2Department of Basic Medical Sciences, Neuroscience and Sense Organs, University of Bari Aldo Moro

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案展示了如何获取白细胞心磷脂的质谱“指纹图谱”，用于巴特综合征的诊断。通过评估单溶血心磷脂与心磷脂比值的升高情况，可将巴特综合征患者与对照组心力衰竭患者区分开，其敏感性和特异性均达到100%。

摘要

心磷脂（CL）是一种结构中含有四条脂肪酸链的二聚磷酸甘油酯，是线粒体的脂质标志物，在线粒体内膜功能中发挥关键作用。其代谢产物单溶血心磷脂（MLCL）在动物细胞脂质提取物中生理状态下几乎不存在，而其出现则是巴思综合征（BTHS）的特征性标志。巴思综合征是一种罕见且常被误诊的遗传性疾病，可导致婴幼儿严重的心肌病。本文所述方法可生成“心磷脂指纹图谱”，并实现对细胞脂质谱中CL与MLCL各分子种类相对水平的简便检测。对于白细胞而言，仅需1 mL血液即可测定MLCL/CL比值。 通过 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法（MALDI-TOF/MS）可在采血后2小时内完成检测。该检测方法简便，可轻松整合到临床生物化学实验室的常规工作中，用于BTHS的筛查。该检测对BTHS具有100%的敏感性和特异性，适合作为诊断试验。

引言

巴特综合征（Barth syndrome，BTHS）是一种罕见的X连锁遗传病，其特征为早发性心肌病、骨骼肌肌病、生长迟缓、中性粒细胞减少症、不同程度的线粒体呼吸链功能障碍以及线粒体结构异常1,2,3,4,5。BTHS的发病率约为每百万男性中1例，目前全球已知病例不足250例，但普遍认为该疾病存在诊断不足的情况2,6。BTHS由位于染色体Xq28.12的Tafazzin（TAFAZZIN）基因功能缺失性突变所致7,8，导致线粒体磷脂心磷脂（cardiolipin，CL）的正常重塑过程受阻，而该过程通常会形成高度对称且富含不饱和酰基的CL分子结构9,10。心磷脂被认为是线粒体的标志性脂质，主要存在于线粒体内膜，对氧化磷酸化（即线粒体能量代谢）、呼吸链超复合体的形成、蛋白质的导入以及线粒体动力学、线粒体自噬和细胞凋亡等过程具有重要作用11,12,13,14,15,16。当TAFAZZIN基因功能丧失时，CL的重塑过程失败，BTHS患者线粒体中出现特异性的磷脂异常：成熟心磷脂水平（CLm）降低，单溶血心磷脂（monolysocardiolipin，MLCL）水平升高，并伴随CL酰基组成改变（即出现未成熟CL组分，CLi），从而导致MLCL/CL比值显著升高17。

由于 Barth 综合征（BTHS）的临床和生化特征表现极为多变，且在同一家庭的不同患者之间以及同一患者的不同病程阶段均可能存在差异，因此其诊断往往较为困难3,5。许多 BTHS 男性患儿尿液中 3-甲基戊二酸（3-MGCA）的排泄水平显著升高，但随着时间推移，部分患者的尿液水平可能恢复正常或仅轻度升高3。然而，3-MGCA 升高也可见于多种其他线粒体及非线粒体疾病，例如 3-甲基戊二酰辅酶 A 水合酶缺乏症（AUH 缺陷）、3-甲基戊二酸尿症、肌张力障碍-耳聋-脑病-Leigh 样（MEGDEL）综合征、Costeff 综合征以及伴共济失调的扩张型心肌病（DCMA）综合征18,19。因此，3-MGCA 作为 BTHS 标志物的特异性较差，加之患者间存在极大的异质性，使得生化诊断具有不确定性。

此外，已发现超过120种不同的TAFAZZIN突变可导致该疾病5，因此基因诊断可能复杂、耗时且昂贵。此外，在非编码区或调控序列存在突变的情况下，对TAFAZZIN基因进行分子分析可能导致假阴性结果3。通过测定（单溶血性）心磷脂（CL）分子种类的相对含量及其分布，可明确诊断BTHS，并可通过TAFAZZIN基因测序加以确认，反之亦然。

一种用于诊断的实用检测方法是通过高效液相色谱法（HPLC）和电喷雾电离/质谱分析法（ESI/MS）检测干血斑中的MLCL/CL比值20,21。仅单独测定CL水平不足以用于诊断，因为部分患者的CL水平接近正常，但MLCL/CL比值异常。因此，MLCL/CL比值的测定对BTHS的诊断具有100%的敏感性和特异性21。另一种基于HPLC和ESI/MS分析的经验证方法已在白细胞中建立22，但此前提取脂质所需的复杂色谱分离技术以及仪器的高昂成本，限制了该分析方法仅能在少数临床实验室开展。上述所有因素，加上缺乏简便直接的诊断检测手段，导致该疾病长期存在诊断不足的问题。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）是脂质分析中另一种有效的工具23,24。该分析技术可直接获取多种生物样品的脂质谱图，从而省去提取和分离步骤25,26,27,28,29，包括用于质谱成像应用的组织切片30。基于这一优势，已开发出一种简单快速的方法，通过MALDI-TOF/MS对完整白细胞中的线粒体心磷脂（CL）进行谱型分析，以诊断巴特综合征（BTHS）28。仅需1 mL全血，通过红细胞沉降和裂解即可简便地分离白细胞，无需特殊仪器或试剂。此外，已有研究描述了一种适用于极少量白细胞的快速脂质"微型提取"方案，可获得比直接使用完整白细胞更清晰的质谱信号，信噪比（S/N）更高28。该附加步骤耗时短，即使在灵敏度较低的质谱仪上也能实现可重复的分析结果。总之，此处所述的分析方法所需样本前处理极少，因可跳过耗时且劳动密集的色谱脂质分离步骤，从而显著加快检测速度。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

健康供者和心力衰竭患者的血液样本采集自意大利巴里综合医院（意大利），而BTHS患者的样本则由英国布里斯托儿童皇家医院的英国国家医疗服务系统BTHS门诊提供（英国）。已获得健康供者、患者及家长（如适用）的书面知情同意，并经各自伦理委员会批准。

注意：若未立即使用，血液（置于K-EDTA凝胶管中）可在4 °C保存最多24-48小时。

1. 通过葡聚糖沉降红细胞（RBCs）分离白细胞

  1. 将血液样本（含K-EDTA抗凝剂）置于轨道摇床上，振荡10分钟以充分混匀血液。
  2. 在1.5 mL离心管中加入0.9 mL全血，再加入0.1 mL 20%右旋糖酐溶液（分子量 > 100 kDa，溶于0.9% NaCl中）。轻轻吹打混悬液20次，避免产生气泡，否则红细胞会滞留在管顶部。室温静置约1小时，使红细胞自然沉降。
  3. 用注射器收集黄色上清液，转移至15 mL离心管中，于室温下以400 × g 离心15分钟（不启用刹车，使用摆桶转子）。
  4. 弃去上清液，将主要含有白细胞及少量残留红细胞的沉淀重悬于0.6 mL冰浴的双蒸水（ddH2O）中。
  5. 约15秒后，向细胞悬液中加入0.2 mL 0.6 M KCl溶液，以恢复正常的渗透压。短暂的低渗处理可裂解红细胞而保持白细胞完整。用1× PBS将终体积调至2.5 mL。
  6. 将悬液于室温下以400 × g 离心15分钟（不启用刹车，使用摆桶转子）。弃去上清液，再用2.5 mL 1× PBS洗涤白细胞沉淀一次。
  7. 按步骤1.6条件再次离心，弃去上清液。将含有白细胞的沉淀重悬于200 µL无菌双蒸水（ddH2O）中。
    注：根据作者经验，此悬液的蛋白含量约为200 µg至400 µg。
  8. 将悬液于-80 °C冷冻保存，或直接进行如下所述的脂质提取。

2. "微型提取" 从分离的白细胞中提取脂质

  1. 取20 µL白细胞悬液（约含20–40 µg蛋白质）至1.5 mL离心管中，在16,000 × g条件下离心30秒。
  2. 弃去上清液，向剩余沉淀中加入10 µL CHCl3，反复吹打以促进脂质提取。
  3. 最后，向含CHCl3的沉淀中加入10 µL 9-氨基吖啶（9-AA）基质溶液（10 mg/mL 9-AA溶于2-丙醇/乙腈，60:40 v/v），反复吹打并分散以充分混匀。
  4. 将含有脂质的CHCl3和9-AA混合溶液在16,000 × g条件下离心30秒，然后取上清液以0.35 µL为一滴（每样本三个重复）点样于MALDI靶板（样品板）上待分析（采用“干燥液滴”点样法）。
  5. 让液滴在空气中自然干燥至少10–15分钟。

3. 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行脂质分析

  1. 在MALDI-TOF质谱仪上对样品进行三份平行样的质谱检测。
  2. 使用脂质标准品校准后（见材料表），将分析设置为负离子模式，并将小分子分析的检测 m/z 范围优化为 200 Th 至 2,000 Th。
  3. 激光通量保持在CL和MLCL阈值以上5%，以获得至少为2的信噪比（S/N）。
  4. 采用反射模式并结合延迟脉冲提取技术采集质谱。每张质谱图平均采集2,000次单次激光脉冲信号（共4 × 500次）。应用门控基质抑制至400 Th，以防止检测器饱和。

4. 如何计算 (MLCL + CLi)/CLm 比值

  1. 运行MALDI-TOF/MS仪器软件（参见材料表）以分析获取的谱图。
  2. 使用打开命令，打开谱图浏览器对话框，以选择并加载目标谱图。
  3. 在菜单栏上，点击平滑质谱图和扣除质谱基线图标。
  4. 点击文件 > 导出 > 质谱图，选择ASCII格式将谱图导出为两列数据表，包含数据点对：m/z（x）和强度（y）。将坐标复制并粘贴至电子表格程序（*.xls）中。
  5. 对每个分析样品的三个重复样本重复步骤4.2至4.4，将坐标粘贴至同一电子表格程序文件中，如图1（步骤1）所示。
  6. 根据图1（步骤2）中列出的每种物质的x范围，使用求和函数计算y1、y2和y3值（三个重复）的总和，以获得峰面积（图1；步骤3）。
  7. 使用平均值函数计算三个重复峰面积值的平均值（图1；步骤3）。
  8. 将每种物质的平均峰面积值填入相应列中，如图1（步骤2）所示。
  9. 为仅考虑CLm 72:7物种的第一同位素体（如文献28所述），计算CLm 72:8的M + 2同位素体与CLm 72:7单一同位素峰之间的重叠同位素校正值，如图1（步骤4）所示。
  10. 最后，计算（MLCL + CLi）/CLm比值，如图1（步骤5）所示。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本研究描述了一种从1 mL全血中快速、简便地分离白细胞，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）获得心磷脂（CL）指纹图谱的方法（见图2）。图3展示了来自对照组个体和 Barth 综合征（BTHS）男孩的白细胞在心磷脂（CL）和单溶血心磷脂（MLCL）质荷比（m/z）范围内的代表性指纹图谱比较结果。表1列出了在这些质谱中检测到的CL和MLCL种类。

TAFAZZIN 基因的缺陷通常决定了BTHS特有的脂质谱，即在心磷脂（CL）指纹图谱中出现单溶血心磷脂（MLCL）和不完全酰化心磷脂（CLi）形式，同时完全酰化心磷脂（CLm）形式减少。对照个体白细胞的脂质谱通常仅显示两种CLm分子种类（图3 上图）。该质谱中唯一值得关注的峰为CLm种类：四亚油酰基心磷脂（18:2）4，其 m/z 为 1,4...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

Barth综合征是一种先天性代谢缺陷疾病，也是一种可能被低估诊断的严重影响生活的疾病2,6。如前所述，造成这一现状的一个因素可能是缺乏简便直接的诊断检测方法。本文介绍了一种通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF/MS）在白细胞中测定单层心磷脂/心磷脂（MLCL/CL）比值的简单快速方法，可用于Barth综合征的筛查。此外，MALDI-TOF质谱仪在全球范围内的临床实验室中已广泛配备，且无需高度专业的分析技术知识即可操作31,32。

当前方法相较于现有技术具有显著优势，即能够在一次质谱分析中同时检测分离所得白细胞总脂质谱中的心磷脂（CL）和单酰基心磷脂（MLCL）种类，从而避免了标准脂质提取与分离等耗时步骤 通过 HPLC。除了时间因素外，操作流程中的步骤越多，越有可能引入误差。本方法简便，即...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

所有作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

我们感谢参与本研究的 Barth 综合征患者及其家属。感谢美国 Barth 综合征基金会和英国 Barth 综合征信托基金的支持，并感谢其在布里斯托尔年度会议上协助采集血样。本研究由美国 Barth 综合征基金会、Barth Italia Onlus 和普利亚大区资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,1′,2,2′-四十四烷酰基心磷脂Avanti Polar Lipids750332用于 MALDI-TOF 校准的脂质标准品
1,1′,2,2′-四-(9Z-十八碳烯酰基)心磷脂Avanti Polar Lipids710335用于 MALDI-TOF 校准的脂质标准品
1,2-二-(9Z-十六碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺Avanti Polar Lipids878130用于 MALDI-TOF 校准的脂质标准品
1,2-二十四烷酰基-sn-甘油-3-磷酸Avanti Polar Lipids830845用于 MALDI-TOF 校准的脂质标准品
1,2-二十四烷酰基-sn-甘油-3-磷脂-(1′-外消旋-甘油)Avanti Polar Lipids840445用于 MALDI-TOF 校准的脂质标准品
1,2-二十四烷酰基-sn-甘油-3-磷脂-L-丝氨酸Avanti Polar Lipids840033用于 MALDI-TOF 校准的脂质标准品
2-丙醇，ACS 级试剂，≥99.5%Merck Life Science S.r.l.190764
9-氨基吖啶半水合物，98%Acros Organics134410010
乙腈，ACS 级试剂，≥99.5%Merck Life Science S.r.l.360457
氯仿，ACS 级试剂，≥99.8%Merck Life Science S.r.l.319988
右旋糖酐（来源于 Leuconostoc spp.），分子量 450,000–650,000Merck Life Science S.r.l.31392
Flex Analysis 3.3Bruker Daltonics软件
MALDI-TOF 质谱仪 Microflex LRFBruker Daltonics
Microsoft ExcelMicrosoft Office软件
OmniPur 10X PBS 液体浓缩液Merck Life Science S.r.l.6505-OP
氯化钾，ACS 级试剂，99.0–100.5%Merck Life Science S.r.l.P3911
氯化钠，ACS 级试剂，≥99.0%Merck Life Science S.r.l.S9888

参考文献

  1. Barth, P. G., et al. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts. Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).
  2. Steward, C. G., et al. syndrome (X linked cardiac and skeletal myopathy, neutropenia, and organic aciduria): rarely recognised, frequently fatal [abstract]. Archives of Disease in Childhood. 89, 48(2004).
  3. Clarke, S. L. N., et al. Barth syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 8, 23(2013).
  4. Zegallai, H. M., Hatch, G. M. Barth syndrome: cardiolipin, cellular pathophysiology, management, and novel therapeutic targets. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1605-1629 (2021).
  5. Taylor, C., et al. Clinical presentation and natural history of Barth Syndrome: An overview. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 7-16 (2022).
  6. Miller, P. C., Ren, M., Schlame, M., Toth, M. J., Phoon, C. A. Bayesian analysis to determine the prevalence of Barth syndrome in the pediatric population. The Journal of Pediatrics. 217, 139-144 (2020).
  7. Bione, S., et al. A novel X-linked gene, G4.5. is responsible for Barth syndrome. Nature Genetics. 12 (4), 385-389 (1996).
  8. Whited, K., Baile, M. G., Currier, P., Claypool, S. M. Seven functional classes of Barth Syndrome mutation. Human Molecular Genetics. 22 (3), 483-492 (2013).
  9. Schlame, M., Ren, M., Xu, Y., Greenberg, M. L., Haller, I. Molecular symmetry in mitochondrial cardiolipins. Chemistry and Physics of Lipids. 138 (1-2), 38-49 (2005).
  10. Schlame, M., Xu, Y. The function of Tafazzin, a mitochondrial phospholipid-lysophospholipid acyltransferase. Journal of Molecular Biology. 432 (18), 5043-5051 (2020).
  11. Schlame, M., Rua, D., Greenberg, M. L. The biosynthesis and functional role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 39 (3), 257-288 (2000).
  12. Mileykovskaya, E., Dowhan, W. Cardiolipin membrane domains in prokaryotes and eukaryotes. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (10), 2084-2091 (2009).
  13. Claypool, S. M., Koehler, C. M. The complexity of cardiolipin in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 37 (1), 32-41 (2011).
  14. Ren, M., Phoon, C. K., Schlame, M. Metabolism and function of mitochondrial cardiolipin. Progress in Lipid Research. 55, 1-16 (2014).
  15. Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Role of cardiolipin in mitochondrial function and dynamics in health and disease: Molecular and pharmacological aspects. Cells. 8 (7), 728(2019).
  16. Acoba, M. G., Senoo, N., Claypool, S. M. Phospholipid ebb and flow makes mitochondria go. The Journal of Cell Biology. 219 (8), 03131(2020).
  17. Schlame, M., et al. Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome. Journal of the American College of Cardiology. 42 (11), 1994-1999 (2003).
  18. Wortmann, S. B., et al. Inborn errors of metabolism with 3-methylglutaconic aciduria as discriminative feature: proper classification and nomenclature. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (6), 923-928 (2013).
  19. Ikon, N., Ryan, R. O. On the origin of 3-methylglutaconic acid in disorders of mitochondrial energy metabolism. Journal of Inherited Metabolic Disease. 39 (5), 749-756 (2016).
  20. Kulik, W., et al. Bloodspot assay using HPLC-tandem mass spectrometry for detection of Barth syndrome. Clinical Chemistry. 54 (2), 371-378 (2008).
  21. Vaz, F. M., et al. An improved functional assay in blood spot to diagnose Barth syndrome using the monolysocardiolipin/cardiolipin ratio. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 29-37 (2022).
  22. Bowron, A., et al. Diagnosis of Barth syndrome using a novel LC-MS/MS method for leukocyte cardiolipin analysis. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (5), 741-746 (2013).
  23. Sun, G., et al. Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of cellular glycerophospholipids enabled by multiplexed solvent dependent analyte-matrix interactions. Analytical Chemistry. 80 (19), 7576-7585 (2008).
  24. Leopold, J., Popkova, Y., Engel, K. M., Schiller, J. Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of lipids. Biomolecules. 8 (4), 173(2018).
  25. Angelini, R., Babudri, F., Lobasso, S., Corcelli, A. MALDI-TOF/MS analysis of archaebacterial lipids in lyophilized membranes dry-mixed with 9-aminoacridine. The Journal of Lipid Research. 51 (9), 2818-2825 (2010).
  26. Angelini, R., et al. Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF MS. The Journal of Lipid Research. 53 (7), 1417-1425 (2012).
  27. Angelini, R., Vormieter, G., Corcelli, A., Fuchs, B. A fast method for the determination of PC/LPC ratio in intact horse serum by MALDI-TOF-MS: an easy-to-follow lipid biomarker of inflammation. Chemistry and Physics of Lipids. 183, 169-175 (2014).
  28. Angelini, R., et al. Cardiolipin fingerprinting of leukocytes by MALDI-TOF/MS as a screening tool for Barth syndrome. The Journal of Lipid Research. 56 (9), 1787-1794 (2015).
  29. Lobasso, S., et al. A lipidomic approach to identify potential biomarkers in exosomes from melanoma cells with different metastatic potential. Frontiers in Physiology. 12, 748895(2021).
  30. Angelini, R., et al. Visualizing cholesterol in the brain by on-tissue derivatization and quantitative mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 93 (11), 4932-4949 (2021).
  31. Greco, V., et al. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics. Expert Review of Proteomics. 15 (8), 683-696 (2018).
  32. Duncan, M., DeMarco, M. L. MALDI-MS: Emerging roles in pathology and laboratory medicine. Clinical Mass Spectrometry (Del Mar, Calif). 13, 1-4 (2019).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

心磷脂指纹图谱白细胞脂质谱单溶血心磷脂检测基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱脂质生物标志物TAFAZZIN基因临床生物化学脂质提取
通过质谱法对白细胞中的心磷脂进行指纹图谱分析以快速诊断巴特综合征
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。