本方案展示了如何获取白细胞心磷脂的质谱“指纹图谱”，用于巴特综合征的诊断。通过评估单溶血心磷脂与心磷脂比值的升高情况，可将巴特综合征患者与对照组心力衰竭患者区分开，其敏感性和特异性均达到100%。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
通过质谱法对白细胞中的心磷脂进行指纹图谱分析以快速诊断巴特综合征
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
心磷脂（CL）是一种结构中含有四条脂肪酸链的二聚磷酸甘油酯，是线粒体的脂质标志物，在线粒体内膜功能中发挥关键作用。其代谢产物单溶血心磷脂（MLCL）在动物细胞脂质提取物中生理状态下几乎不存在，而其出现则是巴思综合征（BTHS）的特征性标志。巴思综合征是一种罕见且常被误诊的遗传性疾病，可导致婴幼儿严重的心肌病。本文所述方法可生成“心磷脂指纹图谱”，并实现对细胞脂质谱中CL与MLCL各分子种类相对水平的简便检测。对于白细胞而言，仅需1 mL血液即可测定MLCL/CL比值。 通过 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法（MALDI-TOF/MS）可在采血后2小时内完成检测。该检测方法简便，可轻松整合到临床生物化学实验室的常规工作中，用于BTHS的筛查。该检测对BTHS具有100%的敏感性和特异性，适合作为诊断试验。
引言
巴特综合征（Barth syndrome，BTHS）是一种罕见的X连锁遗传病，其特征为早发性心肌病、骨骼肌肌病、生长迟缓、中性粒细胞减少症、不同程度的线粒体呼吸链功能障碍以及线粒体结构异常1,2,3,4,5。BTHS的发病率约为每百万男性中1例，目前全球已知病例不足250例，但普遍认为该疾病存在诊断不足的情况2,6。BTHS由位于染色体Xq28.12的Tafazzin（TAFAZZIN）基因功能缺失性突变所致7,8，导致线粒体磷脂心磷脂（cardiolipin，CL）的正常重塑过程受阻，而该过程通常会形成高度对称且富含不饱和酰基的CL分子结构9,10。心磷脂被认为是线粒体的标志性脂质，主要存在于线粒体内膜，对氧化磷酸化（即线粒体能量代谢）、呼吸链超复合体的形成、....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
健康供者和心力衰竭患者的血液样本采集自意大利巴里综合医院（意大利），而BTHS患者的样本则由英国布里斯托儿童皇家医院的英国国家医疗服务系统BTHS门诊提供（英国）。已获得健康供者、患者及家长（如适用）的书面知情同意，并经各自伦理委员会批准。
注意：若未立即使用，血液（置于K-EDTA凝胶管中）可在4 °C保存最多24-48小时。
1. 通过葡聚糖沉降红细胞（RBCs）分离白细胞
- 将血液样本（含K-EDTA抗凝剂）置于轨道摇床上，振荡10分钟以充分混匀血液。
- 在1.5 mL离心管中加入0.9 mL全血，再加入0.1 mL 20%右旋糖酐溶液（分子量 > 100 kDa，溶于0.9% NaCl中）。轻轻吹打混悬液20次，避免产生气泡，否则红细胞会滞留在管顶部。室温静置约1小时，使红细胞自然沉降。
- 用注射器收集黄色上清液，转移至15 mL离心管中，于室温下以400 × g 离心15分钟（不启用刹车，使用摆桶转子）。
- 弃去上清液，将主要含有白细胞及少量残留红细胞的沉淀重悬于0.6 mL冰浴的双蒸水（ddH2O）中。
- 约15秒后，向细胞悬液中加入0.2 mL 0.6 M KCl溶液，以恢复正常的渗透压。短暂的低渗处理可裂解红细胞而保持白细胞完整。用....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本研究描述了一种从1 mL全血中快速、简便地分离白细胞，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）获得心磷脂（CL）指纹图谱的方法（见图2）。图3展示了来自对照组个体和 Barth 综合征（BTHS）男孩的白细胞在心磷脂（CL）和单溶血心磷脂（MLCL）质荷比（m/z）范围内的代表性指纹图谱比较结果。表1列出了在这些质谱中检测到的CL和MLCL种类。
TAFAZZIN 基因的缺陷通常决定了BTHS特有的脂质谱，即在心磷脂（CL）指纹图谱中出现单溶血心磷脂（MLCL）和不完全酰化心磷脂（CLi）形式，同时完全酰化心磷脂（CLm）形式减少。对照个体白细胞的脂质谱通常仅显示两种CLm分子种类（图3 上图）。该质谱中唯一值得关注的峰为CLm种类：四亚油酰基心磷脂（18:2）4，其 m/z 为 1,4.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
Barth综合征是一种先天性代谢缺陷疾病，也是一种可能被低估诊断的严重影响生活的疾病2,6。如前所述，造成这一现状的一个因素可能是缺乏简便直接的诊断检测方法。本文介绍了一种通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF/MS）在白细胞中测定单层心磷脂/心磷脂（MLCL/CL）比值的简单快速方法，可用于Barth综合征的筛查。此外，MALDI-TOF质谱仪在全球范围内的临床实验室中已广泛配备，且无需高度专业的分析技术知识即可操作31,32。
当前方法相较于现有技术具有显著优势，即能够在一次质谱分析中同时检测分离所得白细胞总脂质谱中的心磷脂（CL）和单酰基心磷脂（MLCL）种类，从而避免了标准脂质提取与分离等耗时步骤 通过 HPLC。除了时间因素外，操作流程中的步骤越多，越有可能引入误差。本方法简便，即.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
所有作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
我们感谢参与本研究的 Barth 综合征患者及其家属。感谢美国 Barth 综合征基金会和英国 Barth 综合征信托基金的支持，并感谢其在布里斯托尔年度会议上协助采集血样。本研究由美国 Barth 综合征基金会、Barth Italia Onlus 和普利亚大区资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,1′,2,2′-四十四烷酰基心磷脂 | Avanti Polar Lipids | 750332 | 用于 MALDI-TOF 校准的脂质标准品 |
| 1,1′,2,2′-四-(9Z-十八碳烯酰基)心磷脂 | Avanti Polar Lipids | 710335 | 用于 MALDI-TOF 校准的脂质标准品 |
| 1,2-二-(9Z-十六碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺 | Avanti Polar Lipids | 878130 | 用于 MALDI-TOF 校准的脂质标准品 |
| 1,2-二十四烷酰基-sn-甘油-3-磷酸 | Avanti Polar Lipids | 830845 | 用于 MALDI-TOF 校准的脂质标准品 |
| 1,2-二十四烷酰基-sn-甘油-3-磷脂-(1′-外消旋-甘油) | Avanti Polar Lipids | 840445 | 用于 MALDI-TOF 校准的脂质标准品 |
| 1,2-二十四烷酰基-sn-甘油-3-磷脂-L-丝氨酸 | Avanti Polar Lipids | 840033 | 用于 MALDI-TOF 校准的脂质标准品 |
| 2-丙醇，ACS 级试剂，≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 190764 | |
| 9-氨基吖啶半水合物，98% | Acros Organics | 134410010 | |
| 乙腈，ACS 级试剂，≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 360457 | |
| 氯仿，ACS 级试剂，≥99.8% | Merck Life Science S.r.l. | 319988 | |
| 右旋糖酐（来源于 Leuconostoc spp.），分子量 450,000–650,000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
| Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | 软件 | |
| MALDI-TOF 质谱仪 Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
| Microsoft Excel | Microsoft Office | 软件 | |
| OmniPur 10X PBS 液体浓缩液 | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
| 氯化钾，ACS 级试剂，99.0–100.5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
| 氯化钠，ACS 级试剂，≥99.0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
参考文献
- Barth, P. G., et al. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts. Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).
- Steward, C. G., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
