方法文章

一种用于评估细胞DNA损伤的高通量彗星实验方法

DOI：

10.3791/63559

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2022年5月10日

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1Oxidative Stress Group, Dept. Cell Biology, Microbiology and Molecular Biology, College of Arts and Sciences, University of South Florida, 2Cepheid (Danaher Corp.), US Technical Operations, 3Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences, King Saud University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Institute of Environment, Florida International University, 5Leicester School of Allied Health Sciences, Faculty of Health and Life Sciences, De Montfort University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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彗星试验是检测DNA损伤的常用方法。本研究介绍了一种用于运行彗星试验代表性变体的载玻片操作方法。该方法显著增加了样本数量，同时缩短了试验运行时间、减少了载玻片操作步骤以及凝胶损伤的风险。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞持续暴露于来自内部和外部环境的各类因子，这些因子可能对DNA造成损伤。此类损伤可导致细胞功能异常，因此DNA损伤可能在几乎所有主要人类疾病（如癌症、神经退行性疾病、心血管疾病以及衰老）的发生发展中发挥关键作用。单细胞凝胶电泳（即彗星试验）是研究多种类型DNA损伤（如单链和双链断裂、碱不稳定位点、DNA-DNA交联，以及结合特定修复酶时检测氧化嘌呤和嘧啶）形成与修复的最常用且最敏感的方法之一，适用于体内外 体外 和 体内 系统。然而，传统彗星实验的样本通量较低，且样品前处理过程繁琐，限制了该方法的广泛应用。随着彗星图像分析逐渐实现自动化，当前主要瓶颈在于处理大量彗星载玻片的能力。本文介绍了一种高通量（HTP）版本的彗星实验（HTP彗星实验），可显著增加分析样本数量，缩短实验运行时间，减少单个载玻片操作次数、试剂用量以及凝胶物理损伤的风险。此外，由于载玻片采用垂直排列并集成冷却系统，电泳槽所占空间也显著减小。本文还报道了一种新颖的彗星实验载玻片冷却方法，可方便高效地促进彗星凝胶的凝固。文中描述了这些装置在代表性彗星实验方法中的应用。这些简单的技术创新极大地支持了彗星实验的使用，推动其在暴露生物学、生态毒理学、生物监测、毒性筛选/测试以及疾病发病机制研究等领域的应用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞会持续暴露于来自体内和体外环境的各种因子，这些因子可能对DNA造成损伤1,2。此类损伤可导致细胞功能异常3，因此DNA损伤可能在多种重大人类疾病（如癌症、神经退行性疾病、心血管疾病）以及衰老过程中发挥关键作用4。彗星试验（又称单细胞凝胶电泳）是一种日益广泛使用的方法，用于检测和定量细胞中的DNA损伤。

最简单地说，碱性彗星试验（ACA）可检测链断裂（SB，包括单链和双链断裂），以及在碱性条件下会转化为单链断裂的无嘌呤/无嘧啶位点和碱不稳定位点（ALS）5。中性pH彗星试验可用于评估明显的单链和双链断裂6。此外，ACA结合多种DNA修复酶，能够检测多种类型的DNA损伤，例如氧化嘌呤（通过人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶1检测；hOGG17）；氧化嘧啶（使用内切酶III；EndoIII）和环丁烷嘧啶二聚体（使用T4内切酶V；T4endoV）8。彗星试验还可用于评估由交联剂（如顺铂）诱导的DNA损伤9,10,11。正如该试验的正式名称——单细胞凝胶电泳所示，该试验依赖于被分析细胞为单细胞悬液；最常见的是培养细胞，但也可能来源于全血12,13，或直接使用全血14,15。此外，单细胞悬液也可由实体组织制备获得。

除了少数例外情况，尤其是Engleward实验室开发的CometChip相关报告16，总体彗星试验（comet assay）的操作流程自该检测方法最初由其发明者（Östling和Johansson17，以及Singh等18）提出以来，并未发生显著变化。彗星试验包含多个步骤（图1）。其中许多步骤需要逐张转移含有细胞的薄层琼脂糖凝胶，因此存在凝胶受损或丢失的风险，可能影响实验的成功。因此，该试验可能耗时较长，尤其是在处理大量载玻片时尤为明显。通常情况下，一个大型电泳槽（33 cm × 59 cm × 9 cm）最多可运行40张载玻片，该电泳槽置于更大的托盘内，托盘中装有冰块用于冷却。最近有报道称，通过缩短裂解步骤的时间并在染色前不干燥载玻片，可将实验周期缩短至1天19。

作者此前已报道了一种高通量碱性彗星试验（HTP ACA）的新方法，在该方法中，可在整个彗星试验过程中同时操作多批次（每批25张）彗星试验载玻片20,21,22。这一专利技术通过消除对载玻片进行单独操作的需要，最大限度地降低了含样品凝胶受损或丢失的风险，且可应用于所有使用显微镜载玻片的彗星试验变体。装载载玻片的支架可在操作过程中保护凝胶，从而使样品处理更加快速高效。此外，载玻片可在支架中以垂直而非水平的方向进行电泳。结合内置冷却系统，显著减小了电泳槽的占用空间，并无需使用湿冰。综上所述，该方法相较于传统操作流程具有显著改进。所用设备如图2所示。本文所述的基于该新方法的实验方案，展示了其在培养细胞和全血样本中检测碱不稳定位点（ALS）、DNA链间交联（ICL）以及多种DNA修复酶底物的代表性应用14。

方案

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本研究使用了 commercially available 血液样本。在我们机构，使用 commercially available 血液无需经过机构审查委员会批准。

1. 准备彗星试验所需材料

  1. 显微镜载玻片的制备
    1. 取1% (w/v) 正常熔点琼脂糖 [溶于双蒸水 (ddH2O)] 加入50 mL离心管中，微波加热至琼脂糖完全溶解于ddH2O中。置于37 °C保存，以防止在涂片前发生凝固。若发生凝固，应弃去并重新配制。
    2. 将载玻片浸入盛有1% (w/v) 正常熔点琼脂糖的50 mL离心管中，进行预包被。
    3. 浸渍后迅速擦干载玻片背面。
      注意：若未正确擦干载玻片背面，将在显微镜分析步骤中增加背景噪声。
    4. 使用永久性记号笔在磨砂区域的右下角标记已包被的载玻片（图3A），以标明哪一侧已进行预包被。
    5. 室温下静置过夜，使琼脂糖凝固并干燥。
    6. 将干燥后的载玻片用纸巾包裹，并存放于盒中保存。

2. 样品制备

  1. 培养的细胞
    注意：首先，在开始彗星实验之前，用损伤剂处理细胞。然后执行以下步骤。
    1. 如果细胞为贴壁细胞，使用胰蛋白酶消化，使细胞从细胞培养瓶或细胞培养培养皿上脱落，消化时细胞应处于适当的汇合度。通过加入含血清的培养基中和胰蛋白酶。
    2. 将细胞转移至50 mL离心管中，离心（例如，HaCaT细胞在室温下以300 × g 离心5分钟），小心弃去上清液，并向细胞沉淀中加入1 mL PBS。
    3. 进行细胞计数。
    4. 将30,000个细胞转移至1.5 mL微量离心管中，在4 °C下以7,607 × g 离心5分钟。
    5. 小心弃去上清液，并将细胞沉淀置于冰上避光保存，待进行彗星实验。
      注意：在进行彗星实验前，应定期检测细胞是否存在支原体污染，以避免产生人为的DNA损伤及改变DNA损伤应答，这一点已有文献报道23。根据所用细胞类型的不同，离心条件可作相应调整。
  2. 修复实验用培养细胞的制备
    1. 在细胞培养瓶或培养皿中培养细胞。
    2. 在使用损伤剂处理细胞前，用1 mL PBS轻轻洗涤细胞两次（例如，BE-M17细胞在冰上用50 µM H2O2 处理20分钟），冰上操作以防止处理过程中发生修复。
    3. 用1 mL PBS轻轻洗涤细胞两次，以去除残留的损伤剂。
    4. 重新加入细胞培养基，将细胞置于加湿培养箱（37 °C，5% CO2）中，使其在不同时间段（例如0分钟、30分钟、2小时、6小时、24小时和30小时）内进行修复。
    5. 在每个时间点，收集30,000个细胞于含10%二甲基亚砜（DMSO）的细胞培养基中，并在-80 °C保存。
    6. 在进行彗星实验前，将细胞在37 °C水浴中快速解冻，并在4 °C下以7,607 × g 离心5分钟。
    7. 弃去上清液，将细胞沉淀置于冰上保存，待进行实验（即从步骤3开始）。
  3. 全血的制备
    注意：以下方法具有以下优势：（i）采血方式为微创；（ii）彗星实验前无需分离外周血单个核细胞（PBMC）；（iii）血液样本（体积< 250 µL）可在-80 °C保存长达1个月（尽管最近的研究表明更长时间的保存也是可行的），无需添加冷冻保护剂，且不会产生损伤风险或人为损伤14。在从患者或动物采集血液样本前，可能需要获得伦理批准或同等许可。此外，也可使用商业来源的血液样本，如本研究所采用的方式。在本机构，使用商业来源的血液无需经过机构审查委员会批准。
    1. 使用移液器将全血样本（<250 µL）（材料表）转移至含有少量抗凝剂（每250 µL血液含0.4 mg EDTA）的收集管中。
    2. 在进行高通量（HTP）彗星实验前，将血液样本在-80 °C冷冻保存。
    3. 在室温下解冻储存的血液样本（<250 µL），避免加热。
    4. 在进行彗星实验前（见步骤3），将5 µL全血转移至微量离心管中。

3. 细胞裂解

注意：所有操作均需在冰上进行。

  1. 每块凝胶使用 12,000 个细胞或 2.5 µL 全血。
  2. 使用微波炉将 0.6% (w/v) 低熔点琼脂糖溶解于 PBS 中，并置于 37 °C 水浴中以防止凝固。
  3. 使用永久性记号笔或铅笔在预先包被的载玻片磨砂端标记研究者姓名、日期和处理信息。
  4. 将冷却板放置在平坦的实验台上，并将两个冷冻冷却包插入金属表面下方的滑动抽屉中（如 图4)21 所示）。
  5. 将载玻片放置在冷却板上，在加入含 0.6% (w/v) 低熔点琼脂糖的细胞（步骤 3.7）前，预先冷却 1–2 分钟。
    注意：将载玻片在冷却板上放置超过 1–2 分钟可能会因环境湿度导致载玻片表面产生冷凝水，这可能使低熔点琼脂糖凝胶在载玻片上变得不稳定。
  6. 通过涡旋振荡重悬沉淀（步骤 2.2.7），确保完全去除沉淀中的上清液。立即将含有细胞沉淀的样品管放回冰上。
    注意：将含样品的离心管放入离心机时，应使管盖铰链朝外，以便沉淀聚集在管的这一侧。有时沉淀难以观察，且在去除上清液时容易将其移位。以这种方向进行离心可确保操作者明确细胞沉淀的位置。
  7. 用 200 µL 0.6% 低熔点琼脂糖（LMP 琼脂糖）重悬细胞沉淀，并通过上下吹打混匀，避免产生气泡。随后，迅速将 80 µL 含 LMP 琼脂糖的细胞转移至预冷的载玻片上，并立即盖上盖玻片。
  8. 让凝胶在冷却板上静置 1–2 分钟使其凝固。
  9. 同时，配制 500 mL 裂解缓冲液工作液（表1），并倒入裂解槽中（图2）。
  10. 凝胶凝固后，用拇指和食指轻轻夹住载玻片，迅速滑动移除盖玻片。
  11. 将含有样品的载玻片放入载玻片架中（载玻片上所有黑色“点”标记应朝同一方向放置）（图3B），然后将载玻片架放入裂解槽中（图2）。
  12. 盖上裂解槽盖子，并在 4 °C 冰箱中过夜或室温放置 30 分钟，具体选择应根据操作者的时间安排而定19。

4. 电泳

  1. 小心地将载玻片架从裂解皿中取出，注意不要扰动凝胶。
  2. 将载玻片架轻轻放入预先装有冰冻去离子水（ddH2O）的洗涤皿中，静置30分钟，确保载玻片完全被ddH2O覆盖。
  3. 在电泳槽下方的滑动抽屉内插入一个冷冻冷却包，以维持缓冲液的最佳温度。
  4. 向电泳槽中小心加入冰冻的电泳工作液（表1），然后将载玻片架转移至电泳槽中。调整载玻片方向，使其带有细胞凝胶的透明端（即非磨砂/标记端）朝向阴极（红色电极）。
  5. 让载玻片在电泳槽中静置20分钟，使DNA松弛并解旋。此步骤期间保持电源关闭。
  6. 如有需要，可插入新的冷冻冷却包以增强冷却效果。
  7. 在1.19 V/cm条件下进行电泳20分钟，或根据已优化的条件进行。
    注意：建议各实验室对电泳运行条件及缓冲液体积进行优化24。在电泳过程中仅使用一个载玻片架不会影响电泳缓冲液的电阻，作者也未观察到载玻片数量变化对电压或电流产生显著影响。
  8. 关闭电源，小心地将载玻片架从电泳槽中取出，并在纸巾上沥干30秒。
  9. 将载玻片架放入盛有中和缓冲液的皿中（表1），静置20分钟。
  10. 从中和皿中取出载玻片架，放入盛有冰冻去离子水（ddH2O）的洗涤皿中，静置20分钟。
  11. 将载玻片架从水中取出，根据操作者的安排，将载玻片在37 °C孵育箱中干燥1小时，或在室温下过夜干燥，或不进行干燥处理19。
    注意：若步骤4.11中未进行干燥处理，则直接从步骤5.2开始染色。

5. 碘化丙啶（PI）染色

  1. 将载玻片架转移至含有冰冻ddH2O的洗涤皿中，以重新水化载玻片，并静置30分钟。
  2. 将载玻片架放入含有2.5 µg/mL碘化丙啶溶液的染色皿中。
    注意：碘化丙啶对光敏感，需在避光条件下操作。该物质也有毒性。
  3. 盖上染色皿盖子，在室温下避光孵育20分钟。
  4. 将载玻片架转移至另一个独立的皿中，用冰冻ddH2O洗涤20分钟。
  5. 从皿中取出载玻片架，在避光条件下完全干燥，可选择在37 °C培养箱中或室温下干燥，具体取决于操作者的安排或偏好。
  6. 载玻片完全干燥后，将其从载玻片架上取下，放入载玻片盒中避光保存，直至进行图像分析。
    注意：载玻片可长期保持可读性，必要时可重新染色。

6. 酶修饰的碱性彗星实验

注意：酶修饰的碱性彗星试验在裂解后、电泳前增加一个酶处理步骤。酶的作用会在其底物位点处导致DNA断裂。在进行该实验前，必须优化酶的浓度以及酶孵育的时间。

  1. 细胞裂解后（步骤3），用预冷的ddH2O洗涤载玻片两次，每次20分钟。
  2. 将载玻片架从水中取出，把载玻片转移至铺有滤纸的托盘中。
  3. 加入80 µL优化浓度的酶（例如，BE-M17细胞使用3.2 U/mL的hOGG1，用酶反应缓冲液稀释），并加盖盖玻片，使酶均匀覆盖凝胶中的样品。
  4. 在37 °C孵育优化的时间（例如，hOGG1孵育45分钟）。
  5. 孵育结束后，轻轻移去盖玻片，并将载玻片放回载玻片架中。
    注意：酶处理后不要洗涤载玻片；直接进行4.3步骤的电泳。

7. DNA链间交联（ICL）修饰的碱性彗星实验

注意：这种ICL-ACA变体的原理在于，DNA中的交联（ICL）会减缓因暴露于氧化性损伤后所产生的受损DNA的电泳迁移速度。在此情况下，彗尾越短，表明ICL数量越多25,26,27,28。

  1. 使用可诱导DNA链间交联（ICL）的试剂处理细胞（例如顺铂；参见补充文件）。
  2. 将处理后的细胞暴露于以下任一试剂，以诱导足够的链断裂，形成适当大小的彗尾（约20%尾部DNA）：过氧化氢（50 µM H2O2，处理30分钟）、电离辐射（2–5 Gy）或中波紫外线（UVB）（0.5 J/cm2）。
  3. 此外，通过使用与步骤7.2相同的试剂和剂量处理一批细胞（即不使用ICL诱导剂），制备链断裂阳性对照。
  4. 将细胞在7,607 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液，用1 mL PBS洗涤细胞沉淀三次，并按碱性彗星实验步骤（步骤3–5）进行后续操作。
  5. 使用以下公式计算DNA链间交联水平。
    静态平衡；尾矩减少百分比的计算公式；计算公式。
    注：MOTM（平均橄榄尾矩）是描述经ICL修饰的彗星实验时广泛使用的彗星实验终点指标，定义为尾长与尾部DNA占总DNA比例的乘积（即尾矩 = 尾长 × 尾部DNA百分比）29；TMdi：同时用交联剂和H2O2（或其他链断裂诱导剂）处理的样品的尾矩；TMcu：未用交联剂且未用H2O2处理的样品（无处理）的尾矩；TMci：未用交联剂但用H2O2处理的样品的尾矩。

8. 彗星评分与数据分析

注意：术语“彗星”来源于实验完成后在显微镜下观察到的受损细胞图像（图5）。在电泳条件下，未受损细胞中的DNA基本不发生迁移，而是保留在一个称为彗星“头部”的球形区域中。然而，当存在DNA链断裂时，细胞的DNA会从头部迁移出来，形成一条“尾部”，从而呈现出类似彗星的形态（图5）。尾部中的DNA越多，表明存在的损伤越严重。

  1. 打开荧光显微镜的PI（红色）滤光片（λ = 536/617 nm），并启动彗星图像分析软件。
  2. 使用巴斯德移液管向凝胶上滴加一滴水，然后盖上盖玻片。
  3. 将载玻片放入荧光显微镜中，对彗星进行“评分”。
    注意：评分是一种评估彗星的方法，用于确定每个彗星中DNA损伤的程度。通常可根据用户偏好采用两种方式之一进行评分：目视评分（根据彗星大小在0至4级的量表上进行判断）或使用免费或商业软件进行分析30。两种方法通常均基于彗星尾部的大小进行评估，但也可测定多种与彗星相关的终点参数。若使用软件，点击彗星头部中央，等待软件自动识别彗星，随后分析所选的终点参数（图5）。
  4. 每张凝胶评分50个彗星，每个样品共评分100个彗星（即每个样品对应不同的DNA损伤处理条件或其重复样本）。
  5. 实验应设置重复（n = 2）或三重复（n = 3）。
    注意：若仅进行n = 2次重复实验，则无法进行统计学分析；若n = 3，应进行D'Agostino正态性检验。大多数彗星实验数据无法通过正态性检验。在此情况下，应采用非参数检验方法（Kruskal-Wallis检验结合Dunn's多重比较检验，Mann-Whitney检验的显著性水平设定为 p < 0.05）。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HTP ACA 电泳电压的优化
人角质形成细胞（HaCaTs； 材料表) 经不同剂量的长波紫外线（UVA）照射（5 或 10 J/cm²）2; 图6A），UVB（0.5 或 1 J/cm²）2; 图6B），或用 50 µM H2O2 (图6C)以诱导损伤。测试了电泳的三种不同电压，以确定电泳的最佳电压。三种DNA损伤处理的结果均显示，尽管所有电压均产生线性剂量-反应关系，但最敏感的反应出现在1.19 V/cm条件下。在电泳过程中，使用1.19 V/cm时，HaCaT细胞的基线DNA损伤高于1 V/cm和1.09 V/cm条件下的损伤水平（图6A- C）。此外，在所有损伤处理后，使用1.19 V/cm时观察到最高的尾部DNA百分比（% tail DNA）图6)31.

使用Fpg修饰的高通量碱性彗星分析法检测人全血中的DNA损伤
人全血（材料表）经不同剂量的10 J/cm2 UVA照射以诱导损伤。采用四种不同浓度的Fpg酶（1、2、4或8 U/mL）处理，以确定高通量碱性彗星分析法（HTP ACA）中酶反应的最佳浓度。结果显示，当Fpg浓度为4 U/mL时，检测到的DNA损伤水平最为理想（图7A）。UVA照射后人全血样本的代表性彗星图像如（图7B）所示。

使用ICL修饰的HTP ACA在代表性卵巢癌细胞系中检测DNA交联
采用顺铂（200 µM）单独或联合后续过氧化氢（H2O2，50 µM）处理卵巢癌细胞系（SKOV-3；材料表），冰上孵育30分钟。未暴露于处理的细胞中未观察到明显损伤（图8A）。单独暴露于H2O2的细胞产生了显著的MOTM信号（图8B）。相比之下，诱导形成ICL的细胞中MOTM信号降低（图8C）28。

在代表性卵巢癌细胞系中顺铂诱导的DNA链间交联（ICL）的形成与修复
采用ICL修饰的HTP ACA方法，检测顺铂在卵巢癌细胞系（A2780；材料表）中诱导DNA链间交联（ICL）的形成与修复的时间进程。细胞用100 µM顺铂处理1小时，随后在不含顺铂的培养基（RPMI 1640培养基，添加10% (v/v) 胎牛血清（FBS））中继续培养，并在不同时间点取样。通过ICL修饰的HTP ACA方法检测各时间点的ICL水平（图9）28。在顺铂处理前未检测到ICL。然而，在单次100 µM顺铂处理后，ICL水平显著上升，在12小时达到峰值，之后逐渐下降，至30小时时恢复至零水平。

DNA交联（ICL）与DNA中铂含量之间的相关性
三种卵巢癌细胞经100 µM顺铂处理，以诱导不同水平的DNA-ICL，随后采用ICL改良的高通量阵列共价结合分析法（HTP ACA）及电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）进行分析（详见补充文件）。如图10所示，在三种细胞系中诱导出不同水平的DNA-ICL，同时DNA中的铂（Pt）含量也存在差异。DNA-ICL水平与铂浓度之间呈现出正相关关系（R2 = 0.9235），表明DNA中铂含量与相应的ICL水平之间存在关联28。

支原体感染与未感染的 BE-M17 细胞中的碱基切除修复
将支原体感染与未感染的 BE-M17 细胞用 50 µM H2O2 处理 30 分钟，随后在完全培养基（含 10% (v/v) 胎牛血清的 DMEM 培养基）中于不同时间点（0 分钟、30 分钟、1 小时、2 小时、6 小时、24 小时或 30 小时）进行培养，以允许细胞修复。在每个时间点收集细胞，并在含 10% DMSO 的培养基中于 -80 ˚C 冻存，随后进行 hOGG1 修饰的高通量单细胞凝胶电泳分析（步骤 6）。处理 30 分钟后，未感染细胞中的单链断裂/无碱基位点（SB/ALS）水平下降至 21% TD（尾部 DNA 百分比），而感染细胞中仍高达 49% TD（图 11A）。约 15 小时后，感染与未感染细胞中的 SB/ALS 水平均恢复至基线水平。对于氧化嘌呤损伤，未感染的 BE-M17 细胞最初出现轻微损伤增加，但在 30 小时内恢复至基线水平（图 11B）。相比之下，感染细胞中氧化嘌呤损伤持续显著升高，且在整个 30 小时内均维持在高水平，未能恢复至基线（图 11B）23。

彗星实验示意图，显示细胞裂解、电泳、荧光染色和分析步骤。
图1：常规碱性彗星实验流程概览。 （i）将培养细胞的单细胞悬液或全血样品与0.6%（w/v）低熔点琼脂糖混合。（ii）将细胞-琼脂糖混合物涂布于预先包被的载玻片上，并加盖盖玻片直至凝固。（iii）使用高pH裂解缓冲液对细胞进行过夜裂解，形成核小体结构，随后（iv）用ddH2O洗涤。（v）在高pH电泳缓冲液中，细胞DNA发生解旋；若存在DNA链断裂，DNA会松弛并展开，在电泳作用下从核小体中迁移出来，形成“尾部”。然后将载玻片（vi）沥干、干燥，（vii）中和，并（viii）用ddH2O洗涤，再（ix）过夜干燥。（x）用ddH2O重新水化载玻片，（xi）染色，（xii）洗涤，最后（xiii）进行评分与分析，通常借助荧光显微镜和图像分析软件完成。本图改编自先前发表的研究20。请点击此处查看该图的放大版本。

电泳系统装置、凝胶托盘、电泳槽、电源线，用于DNA分离，实验室设备。
图2：高通量彗星电泳系统的组成材料。 图中显示了高通量电泳槽、高通量支架，以及用于裂解、洗涤、中和和染色的器皿。请点击此处查看该图的放大版本。

色谱过程；用于化合物分离分析的示意图和板式装置。
图3：彗星试验载玻片和高通量载架（显微镜载玻片载体）的代表性图像。（A）为正确对位，可通过载玻片右上角的黑点识别预包被面。（B）高通量载架图像显示了载玻片如何保持紧密的垂直方向，并通过载体上的卡扣固定其在电泳槽中的位置。每个载体最多可容纳25张载玻片。请点击此处查看此图的放大版本。

用于DNA分离的聚丙烯酰胺凝胶电泳装置，显示凝胶板和间隔片。
图4：放置样品载玻片和冷冻包的冷却板示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

光学激发图像、发射模式分析；示意图显示光谱拟合结果。
图5：评分过程中拍摄的代表性彗星图像截图。 HaCaT细胞（A）未经处理和（B）在进行高通量彗星分析（HTP ACA）前经1 J/cm2 UVB处理。大多数软件包均可计算多种彗星参数，但最常用的为尾部DNA百分比（推荐）或基于这些图像计算的尾矩（蓝色：头部起始位置，绿色：头部中点，紫色：尾部末端）。比例尺为10 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

DNA损伤分析；图表显示UVA/UVB剂量和H2O2对DNA的影响（%尾部DNA）
图6：利用高通量碱性彗星分析法（HTP ACA）测定电泳电压对尾部DNA百分比影响的代表性图表。 细胞在进行HTP ACA前分别暴露于（A）5 或 10 J/cm2 的UVA、（B）0.5 或 1.0 J/cm2 的UVB，或（C）50 µM H2O2，电泳电压分别为1、1.09 或 1.19 V/cm。数据来自n = 2次重复实验，共200次测定结果的平均值31。 请点击此处查看该图的放大版本。

DNA损伤分析图表与图像；尾部DNA百分比与Fpg浓度的关系，UVA照射研究。
图7：通过Fpg改良的高通量平板彗星分析法（HTP ACA）分析人血样本的代表性图表与彗星图像。 人血样本在裂解步骤前于冰上接受10 J/cm2 UVA照射或假照射（“ctrl”）。在电泳前，酶处理步骤中使用不同浓度的Fpg（1、2、4 或 8 U/mL）。(A) 数据来自n=3次实验的300次测定，表示为均值±标准误（SEM）。(B) 在10 J/cm2 UVA照射的人血样本中，各Fpg浓度下的代表性彗星图像。比例尺为10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

显示荧光发射分析的细胞显微图像；图 a-c 比较。
图 8：代表性彗星图像，展示顺铂处理后交联（ICL）的检测。 （A）未经任何处理的对照细胞，（B）仅用 H2O2（50 µM）处理的细胞，（C）用 H2O2（50 µM）和顺铂（200 µM）共同处理的细胞，显示其尾部比（B）更短，这是由于存在 ICL28。比例尺为 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

DNA交联减少图表，顺铂作用40小时的实验结果图。
图9：顺铂诱导的DNA链间交联（ICL）形成与修复动力学的展示。 A2780细胞在培养基中用100 µM顺铂处理1小时。随后移除含顺铂的培养基，并将细胞继续培养不同时间后，采用经ICL修饰的高通量阵列毛细管电泳（HTP ACA）进行分析。数据来自n = 3次实验，表示为均值±标准误（SEM）28。**** P < 0.0001。 请点击此处查看该图的放大版本。

DNA交联与浓度关系图；线性回归，Pt分析，%减少，SQ-KED方法。
图10：DNA ICL与铂浓度之间的相关性。DNA ICL通过ICL修饰的高通量亲和色谱分析法（HTP ACA）测定，铂浓度通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS，采用单四极杆-动能歧视，SQ-KED）测定，实验在三种卵巢癌细胞系中进行。R2 = 0.9235。ICP-MS定量DNA中铂含量的方法详见补充文件28。请点击此处查看该图的放大版本。

支原体感染与未感染BE-M17细胞中DNA损伤修复动力学图；剩余百分比 vs 时间。
图11：通过hOGG1修饰的彗星实验测定支原体感染与未感染BE-M17细胞中DNA损伤与修复的代表性图示。 细胞经50 µM H2O2处理30分钟后，分别进行不同时间（0、30分钟、1小时、2小时、6小时、24小时或30小时）的修复。采用hOGG1修饰的高通量彗星分析法（HTP ACA）检测感染（红色数据点）和未感染（黑色数据点）BE-M17细胞中的（A）单链断裂/碱性不稳定位点（SB/ALS）和（B）氧化嘌呤。数据来自n = 2次重复实验，共200次测定的平均值。本图经此前发表文献23许可转载。请点击此处查看此图的放大版本。

试剂储存液工作液
裂解缓冲液100 mM Na2EDTA、2.5 M NaCl 和 10 mM Tris 碱溶于 ddH2O 中；用 10 M NaOH 调节 pH 至 10裂解储存液中含 1% Triton X-100
电泳缓冲液10 M NaOH 和 200 mM Na2EDTA 溶于 ddH2O 中300 mM NaOH 和 1 mM Na2EDTA；pH > 13
中和缓冲液0.4 M Tris 碱溶于 ddH2O 中；用 HCl 调节 pH 至 7.5
染色缓冲液1 mg/mL 碘化丙啶2.5 µg/mL 碘化丙啶溶于 ddH2O 中

表1：高通量碱性裂解法（HTP ACA）中所用试剂的组成。 显示了裂解液、电泳缓冲液、中和缓冲液和染色缓冲液的储存浓度及工作浓度。

补充文件。 请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究展示了当前设备所提供的多功能性，该设备可用于实现高通量的多种代表性常见彗星试验变体（即碱性法、酶修饰法、血液样本法、交联法及其他变体）。此外，本方法具有多项优势20,21：（a）由于可同时操作多个载玻片，检测运行时间缩短（操作时间减少60%）；（b）凝胶受损风险以及由此导致的实验风险降低；（c）试剂需求量减少（例如，电泳槽体积小于传统电泳槽）；（d）可运行的载玻片数量增加。单个电泳槽相比传统单个电泳槽可使载玻片数量增加20%；此外，多个电泳槽可并行运行或级联运行（即多个电泳槽由同一电源控制），且仍占用比带冰盒的传统单个电泳槽更小的台面空间；（e）由于载玻片采用垂直排列并集成冷却系统，电泳槽占用空间减小（节省实验室空间）；高通量电泳槽配备高性能陶瓷冷却底座和滑动抽屉，可容纳一个冷冻冷却包，以维持缓冲液的最佳温度，无需在低温房间内操作。

此外，我们开发的冷却板可容纳26张彗星电泳载玻片，能够实现彗星电泳载玻片上低熔点琼脂糖的快速凝固，并在琼脂糖凝胶凝固后便于载玻片的轻松取出。上述创新使得彗星电泳实验流程更加简便易行。

尽管已开发出其他高通量方法（例如12胶彗星试验、CometChip或96微胶格式）25，许多科学家仍倾向于使用传统的显微镜载玻片（包括 commercially available 预包被载玻片或其他专用载玻片）。本方法可兼容各种类型的显微镜载玻片，从而通过更快的载玻片处理和操作，实现使用这些载玻片的实验通量提升。如上所述，高通量彗星系统具有诸多优势，但也存在一个明显局限：与传统水平电泳槽相比，当前方法仅能使运行样本数量增加20%（尽管载玻片处理速度显著加快）。CometChip和96微胶格式可运行更多样本。截至目前，我们尚不清楚本方法是否能够兼容CometChip或96微胶格式，但我们预测其具备此潜力。如前所述，通过将多个电泳槽连接至同一电源，可进一步增加样本数量。与所有方法一样，在加样以及在显微镜下分析过程中，仍存在凝胶丢失或损坏的风险，但这更多是由于操作者误差所致，而当前方法已将此类风险降至最低。

HTP彗星系统可用于高效分析DNA损伤，有助于在多种领域中广泛应用彗星实验，例如分子流行病学、男性生殖科学、遗传毒理学研究以及环境毒理学。对于希望在不脱离熟悉且经济实惠的传统显微镜载玻片的前提下，获得更高通量和更便捷操作体验的用户而言，该系统尤其适用。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cooke 博士和 Karbaschi 博士是三项已获授权专利的发明人，这些专利与本文所述技术相关。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本出版物中报告的工作部分由美国国立卫生研究院下属的国家环境卫生科学研究所资助，资助编号为：1R41ES030274。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
22 x 22 mm 玻璃盖玻片Fisher Scientific, Hampton, NH, USA631-0124
A2780ECACC, 
Louis, MO,
 USA		93112519
浓硝酸（OptimaTM 级）Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USAA467-250
配备相机的荧光显微镜Zeiss, Jena, Germany
新鲜人全血Zen Bio IncSER-WB10ML商用人体全血样本
GraphPad PrismGraphPad Software, San Diego, California数据分析软件
高通量彗星实验系统（HTP Comet Assay system）Cleaver ScientificCOMPAC- 50
人角质形成细胞（HaCaTs）美国典型培养物保藏中心（ATCC）, Manassas, VA, USA已停产可从其他公司购买
ADDEXBIO TECHNOLOGIES
货号# T0020001
过氧化氢（H2O2)
水溶液（30%）		Fisher Scientific, Hampton, NH, USABP2633-500
ICP-MS
iCAP RQ ICP-MS 系统		Thermo Scientific,
Waltham, MA,
USA		IQLAAGGAAQFAQKMBIT
图像与数据分析软件Perceptive Instrument,
Bury St Edmunds, England,
UK		125525可使用免费图像分析软件，例如 ImageJ
内标混合液SPEX Certiprep,
Metuchen, NJ, USA		CL-ISM1-500铋（监测同位素 209 Bi）- 浓度为 10 µg/mL，溶于 5% HNO3
低熔点琼脂糖Invitrogen
Waltham, MA, USA		P4864
Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠）Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		E5134
NaCl（氯化钠）Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		S7653
NanoDrop OneThermo Scientific,
Waltham, MA,
USA		701-058108用于测定 DNA 浓度的 Nanodrop 仪器
Nanopure Infinity 超纯水系统（Barnstead Nanopure）Thermo Scientific, 
Waltham, MA,
USA		D11901超纯水（16 MΩ cm-1）
NaOH（氢氧化钠）Sigma Aldrich,
St. Louis, MO, USA		E5134
正常熔点琼脂糖Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		16520100用于载玻片预包被
OCI-P5X迈阿密大学,
Miami, FL,
USA		N/A活体肿瘤培养核心设施提供细胞
铂（Pt）标准参考物质SPEX Certiprep,
Metuchen, NJ, USA		PLPT3-2Y（含铋，1000 µg/mL，溶于 10% HCl）
碘化丙啶
（1.0 mg/mL 水溶液）		Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		12-541BP486410ML
QIAamp DNA Mini 试剂盒Qiagen
Valencia, CA,
USA		51304DNA 提取试剂盒
单面磨砂玻璃显微镜载玻片Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		12-541B
SKOV3ECACC,
Louis, MO,
USA		91091004
载玻片盒Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		03-448-2避光，用于保护细胞免受意外损伤（根据普遍观点）并防止荧光染料褪色
载玻片冷却板Cleaver Scientific,
Rugby, England,
UK		CSL-CHILLPLATE
处理皿Cleaver Scientific,
Rugby, England,
UK		STAINDISH4X
Tris 碱Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		93362
吐温 X-100Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		BP151-500
胰蛋白酶 EDTA（0.5%）Invitrogen
Gibco,
Waltham, MA, USA		15400054
垂直载玻片架Cleaver Scientific,
Rugby, England,
UK		COMPAC-25

参考文献

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DNA

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