我们采用单点亲脂性细胞示踪剂注射法追踪内皮细胞，随后在大鼠腹主动脉上进行动脉切开术并缝合侧壁动脉瘤。在去细胞化动脉瘤中，新生内膜的形成似乎依赖于主干动脉，而在富含活细胞的动脉瘤壁中，则通过瘤壁细胞的募集而促进新生内膜形成。
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方法文章
利用细胞示踪剂注射研究大鼠囊状侧壁模型中新生内膜形成细胞的来源
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
显微外科夹闭术可形成阻止血流进入颅内动脉瘤的屏障，而血管内治疗则依赖于新生内膜和血栓的形成。覆盖新生内膜腔内层的内皮细胞来源尚不明确。因此，本研究旨在通过细胞示踪剂注射，探讨在已建立的赫尔辛基大鼠显微外科侧壁动脉瘤模型中新生内膜形成细胞的来源。
通过将去细胞化或活性动脉囊以端侧吻合的方式缝合至雄性Lewis大鼠的主动脉，构建侧壁动脉瘤模型。在进行动脉切开及动脉瘤缝合前，向夹闭的主动脉内注射含CM-Dil染料的细胞示踪剂，以标记邻近血管的内皮细胞，并在随访（FU）期间追踪其增殖情况。随后进行弹簧圈栓塞治疗（n = 16）或支架植入治疗（n = 15）。在随访期（7天或21天）结束时，所有大鼠均接受荧光血管造影，随后处死并收获动脉瘤组织，进行大体及组织学评估，并对特定感兴趣区域进行免疫组织化学细胞计数。
随访期间，31个动脉瘤均未发生破裂。4只动物过早死亡。大体观察显示，弹簧圈栓塞组有75.0%的动物存在残余血流，支架组则为7.0%。与弹簧圈栓塞组相比，去细胞支架组在第7天血栓中的示踪标记阳性细胞数量显著升高（p = 0.01），在第21天新生内膜中的示踪标记阳性细胞数量也显著升高（p = 0.04）。在存活动脉瘤中，血栓或新生内膜未发现显著差异。
这些发现证实，与支架修复的动脉瘤相比，弹簧圈栓塞的动脉瘤愈合模式更差。在去细胞化动脉瘤中，新生内膜的形成似乎特别依赖于载瘤动脉；而在细胞丰富的活性动脉瘤壁中，新生内膜则得益于动脉瘤壁细胞的募集作用。从临床转化角度来看，对于严重退变的动脉瘤，支架治疗可能更为合适；而对于血管壁基本健康的动脉瘤，单独弹簧圈栓塞可能已足够。
引言
颅内动脉瘤（IA）破裂引起的蛛网膜下腔出血是一种严重的神经外科疾病，具有较高的致残率和死亡率1,2,3,4。除了可实现内皮对内皮直接接触的显微外科夹闭术外，在过去几十年中，血管内治疗装置在治疗破裂性及偶然发现的颅内动脉瘤方面的重要性日益增加。血管内治疗后颅内动脉瘤的愈合反应主要依赖于新生内膜的形成和血栓的组织化过程。这两个过程相互协同，依赖于来自邻近血管及动脉瘤壁的细胞迁移5。迄今为止，血管内治疗后动脉瘤新生内膜中内皮细胞的来源仍不明确。关于参与新生内膜形成的细胞来源，文献中仍存在持续的争议。
通过在大鼠腹主动脉注射细胞示踪剂CM-Dil染料（参见材料表），我们旨在分析源自主主动脉的内皮细胞在两个不同随访时间点（第7天和第21天）新生内膜形成中的作用（图1）。该模型的一个优势在于，可在动脉瘤缝合前于主主动脉内直接进行局部细胞示踪剂的体内孵育，从而实现后期时间点的随访。目前文献中尚未报道过此类体内注射技术，例如细胞示踪剂孵育。该技术的优点是可在术中进....
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方案
根据机构指南进行兽医支持。实验已获得瑞士当地伦理委员会批准（BE 60/19）。严格遵循ARRIVE指南和3R原则6,7。共纳入31只雄性Lewis大鼠，12周龄，体重为492 ± 8 g。将所有大鼠饲养于室温23 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的环境中。自由饮水和摄食颗粒饲料。采用非参数Wilcoxon-Mann-Whitney U 检验进行统计分析。概率值（p）≤ 0.05和/或≤ 0.01被认为具有显著性差异。
1. 术前阶段——一般准备与麻醉相关事项
- 通过基于网络的随机化系统将大鼠随机分配至线圈或支架治疗组（图2）。随后，在安静、无菌的手术室旁对计划接受手术的所有动物进行术前临床检查，手术室温度维持在23 ± 3 °C。作为术前临床检查的一部分，分析动物的行为，并检查其黏膜和皮肤弹性。
- 记录每只动物的体重。
- 手术前，将供体大鼠的动脉囊袋置于0.1%十二烷基硫酸钠中，在37 °C条件下孵育10小时，以获得去细胞化动脉瘤8。在手术前几天从供体动物中采集这些囊袋。
- 使用显微剪刀和镊子准备腹主....
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结果
共有31只动物被纳入实验室研究：其中27只大鼠被纳入最终的统计分析；4只大鼠过早死亡（死亡率为12.9%）。术中发现，支架治疗组大鼠的呼吸扩张显著低于弹簧圈治疗组（支架组：12.9 μm ± 0.7，弹簧圈组：13.5 μm ± 0.6，p = 0.03）。在最后一次随访结束时，对每只大鼠均进行了荧光血管造影。在6只接受弹簧圈治疗的动物中均观察到再灌注现象，而在8只接受支架治疗的动物中，仅有12.5%出现再灌注。
第7天和第21天的基线动脉瘤体积汇总数据显示，去细胞化动脉瘤（p = 0.9）和活性动脉瘤（p = 0.1）在弹簧圈治疗组与支架治疗组之间均无显著差异（图3）。随访期间，去细胞化动脉瘤的汇总体积显示，弹簧圈组相较于支架组的动脉瘤增长无统计学意义（p = 0.28）；而在活性动脉瘤中，弹簧圈组的体积增长显著大于支架组（60.1 mm3 ± 31.1 mm3 vs. 20.5 mm3
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讨论
本研究表明，新生内膜的形成是通过起源于动脉瘤复合体主干动脉的内皮细胞介导的，但在存活动脉瘤中，也依赖于来自动脉瘤壁细胞的募集作用。然而，循环祖细胞在动脉瘤愈合过程中的作用仍存在争议12,13。本研究共纳入31只雄性Lewis大鼠，其中仅有4只过早死亡（死亡率为12.9%）。
与促进内皮-内皮接触的外科夹闭术不同，血管内治疗的成功依赖于延迟的生物学反应。近年来新开发的技术，如血流导向装置、生物活性血管内器械或管腔内细胞治疗，在血管内治疗器械方面具有重要意义14,15。在此背景下，有证据表明，成功消除动脉瘤的治疗效果与动脉瘤壁自身产生的生物学反应呈相加性关联5,16,17
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披露
作者全权负责本研究的设计与实施，并声明不存在任何利益冲突。
致谢
作者感谢兽医学博士 Alessandra Bergadano 对动物长期健康的悉心监管。本研究由瑞士阿劳州立医院阿劳分院研究委员会的科研基金以及瑞士国家科学基金会 SNF（项目编号：310030_182450）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-0 可吸收缝线 | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 不可吸收缝线 | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 不可吸收缝线 | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 不可吸收缝线 | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| 阿替美唑（Atipamezol） | Arovet AG, 瑞士 | ||
| 蓝色带通滤光片 | Thorlabs | FD1B | 其他任意型号 |
| 绿色带通滤光片 | Thorlabs | FGV9 | 其他任意型号 |
| 双极电凝镊 | 其他任意型号 | ||
| 自行车前灯 | 其他任意型号 | ||
| 板（20 × 10 cm） | 其他任意型号 | ||
| 丁丙诺啡（Buprenorphine） | Indivior, 瑞士 | 1014197 | |
| 相机 | Sony NEX-5R, Sony, 东京, 日本 | ||
| 套管（27-1/2 G） | 其他任意型号 | ||
| 细胞计数软件 | Image-J 版本 1.52n, 美国国立卫生研究院, 贝塞斯达, 马里兰州, 美国, https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| CellTracker CM-Dil 染料 | ThermoFisher SCIENTIFIC, 美国 | C7000 | |
| 弹簧圈装置 | Styker, Kalamazoo, MI, 美国 | 2 cm 长 Target 360 TM Ultra, 直径 2 mm | |
| 消毒剂 | 其他任意型号 | ||
| 眼用润滑剂 | 其他任意型号 | ||
| 芬太尼（Fentanyl） | Sintetica, S.A., 瑞士 | 98683 | 任意通用型号 |
| 氟马西尼（Flumazenil） | Labatec-Pharma, 瑞士 | ||
| 荧光素（Fluoresceine） | Curatis AG | 5030376 | 任意通用型号 |
| 荧光显微镜 | Olympus BX51, 汉堡, 德国; Cell Sens Dimension 成像软件 v1.8 | ||
| 箔制面罩 | 其他任意型号 | ||
| 葡萄糖（5%） | 其他任意型号 | ||
| 加热垫 | Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, 英格兰 | 其他任意型号 | |
| 等渗氯化钠溶液（0.9%） | Fresenius KABI | 336769 | 任意通用型号 |
| 异氟烷（Isoflurane） | 任意通用型号 | ||
| 长镊子 | 其他任意型号 | ||
| 美洛昔康（Meloxicam） | Boehringer Ingelheim | P7626406 | 任意通用型号 |
| 美托咪啶（Medetomidine） | Virbac, 瑞士 | QN05CM91 | |
| 微型持针器 | 其他任意型号 | ||
| 咪达唑仑（Midazolam） | Roche, 瑞士 | ||
| 监测系统 | Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, 美国 | ||
| 持针器 | 其他任意型号 | ||
| 氧气面罩 | 其他任意型号 | ||
| 手术显微镜 | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, 德国 | 其他任意型号 | |
| 氧气 | 其他任意型号 | ||
| 直肠温度探头 | 其他任意型号 | ||
| 手术刀 | Swann-Morton | 210 | 其他任意型号 |
| 小型动物剃毛器 | 其他任意型号 | ||
| 智能手机 | 其他任意型号 | ||
| 十二烷基硫酸钠（0.1%） | Sigma-Aldrich | 11667289001 | |
| 软质饲料 | Emeraid Omnivore | 任意通用型号 | |
| 软组织镊 | 其他任意型号 | ||
| 软组织牵开器 | 其他任意型号 | ||
| 不锈钢海绵碗 | 其他任意型号 | ||
| 支架装置 | Biotroni, Bülach, 瑞士 | 改良 magmaris 装置, AMS 带聚合物涂层, 长度 6 mm, 直径 2 mm | |
| 无菌微型棉签 | 其他任意型号 | ||
| 直形和弯形微型镊 | 其他任意型号 | ||
| 直形和弯形微型剪刀 | 其他任意型号 | ||
| 直形和弯形镊子 | 其他任意型号 | ||
| 手术单 | 其他任意型号 | ||
| 手术剪刀 | 其他任意型号 | ||
| 1 mL、2 mL 和 5 mL 注射器 | 其他任意型号 | ||
| 胶带 | 其他任意型号 | ||
| 血管夹施加器 | B. Braun, 德国 | FT495T | |
| Yasargil 钛标准夹（2个） | B. Braun Medical AG, Aesculap, 瑞士 | FT242T | 临时使用 |
参考文献
- Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Macdonald, R. L., et al.
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重印与许可
