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利用细胞示踪剂注射研究大鼠囊状侧壁模型中新生内膜形成细胞的来源

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DOI：

10.3791/63580

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2022年3月16日

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1Department of Neurosurgery, Kantonsspital Aarau, 2Cerebrovascular Research Group, Department for BioMedical Research, University of Bern, 3Institute of Pathology Laenggasse, 4Department of Neurosurgery, Neurocenter and Regenerative Neuroscience Cluster, Inselspital, Bern University Hospital, University of Bern, 5Faculty of Medicine, University of Bern

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们采用单点亲脂性细胞示踪剂注射法追踪内皮细胞，随后在大鼠腹主动脉上进行动脉切开术并缝合侧壁动脉瘤。在去细胞化动脉瘤中，新生内膜的形成似乎依赖于主干动脉，而在富含活细胞的动脉瘤壁中，则通过瘤壁细胞的募集而促进新生内膜形成。

摘要

显微外科夹闭术可形成阻止血流进入颅内动脉瘤的屏障，而血管内治疗则依赖于新生内膜和血栓的形成。覆盖新生内膜腔内层的内皮细胞来源尚不明确。因此，本研究旨在通过细胞示踪剂注射，探讨在已建立的赫尔辛基大鼠显微外科侧壁动脉瘤模型中新生内膜形成细胞的来源。

通过将去细胞化或活性动脉囊以端侧吻合的方式缝合至雄性Lewis大鼠的主动脉，构建侧壁动脉瘤模型。在进行动脉切开及动脉瘤缝合前，向夹闭的主动脉内注射含CM-Dil染料的细胞示踪剂，以标记邻近血管的内皮细胞，并在随访（FU）期间追踪其增殖情况。随后进行弹簧圈栓塞治疗（n = 16）或支架植入治疗（n = 15）。在随访期（7天或21天）结束时，所有大鼠均接受荧光血管造影，随后处死并收获动脉瘤组织，进行大体及组织学评估，并对特定感兴趣区域进行免疫组织化学细胞计数。

随访期间，31个动脉瘤均未发生破裂。4只动物过早死亡。大体观察显示，弹簧圈栓塞组有75.0%的动物存在残余血流，支架组则为7.0%。与弹簧圈栓塞组相比，去细胞支架组在第7天血栓中的示踪标记阳性细胞数量显著升高（p = 0.01），在第21天新生内膜中的示踪标记阳性细胞数量也显著升高（p = 0.04）。在存活动脉瘤中，血栓或新生内膜未发现显著差异。

这些发现证实，与支架修复的动脉瘤相比，弹簧圈栓塞的动脉瘤愈合模式更差。在去细胞化动脉瘤中，新生内膜的形成似乎特别依赖于载瘤动脉；而在细胞丰富的活性动脉瘤壁中，新生内膜则得益于动脉瘤壁细胞的募集作用。从临床转化角度来看，对于严重退变的动脉瘤，支架治疗可能更为合适；而对于血管壁基本健康的动脉瘤，单独弹簧圈栓塞可能已足够。

引言

颅内动脉瘤（IA）破裂引起的蛛网膜下腔出血是一种严重的神经外科疾病，具有较高的致残率和死亡率1,2,3,4。除了可实现内皮对内皮直接接触的显微外科夹闭术外，在过去几十年中，血管内治疗装置在治疗破裂性及偶然发现的颅内动脉瘤方面的重要性日益增加。血管内治疗后颅内动脉瘤的愈合反应主要依赖于新生内膜的形成和血栓的组织化过程。这两个过程相互协同，依赖于来自邻近血管及动脉瘤壁的细胞迁移5。迄今为止，血管内治疗后动脉瘤新生内膜中内皮细胞的来源仍不明确。关于参与新生内膜形成的细胞来源，文献中仍存在持续的争议。

通过在大鼠腹主动脉注射细胞示踪剂CM-Dil染料（参见材料表），我们旨在分析源自主主动脉的内皮细胞在两个不同随访时间点（第7天和第21天）新生内膜形成中的作用（图1）。该模型的一个优势在于，可在动脉瘤缝合前于主主动脉内直接进行局部细胞示踪剂的体内孵育，从而实现后期时间点的随访。目前文献中尚未报道过此类体内注射技术，例如细胞示踪剂孵育。该技术的优点是可在术中进行直接、单次、体内注射，使模型具有高度稳健性和可重复性。

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方案

根据机构指南进行兽医支持。实验已获得瑞士当地伦理委员会批准（BE 60/19）。严格遵循ARRIVE指南和3R原则6,7。共纳入31只雄性Lewis大鼠，12周龄，体重为492 ± 8 g。将所有大鼠饲养于室温23 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的环境中。自由饮水和摄食颗粒饲料。采用非参数Wilcoxon-Mann-Whitney U 检验进行统计分析。概率值（p）≤ 0.05和/或≤ 0.01被认为具有显著性差异。

1. 术前阶段——一般准备与麻醉相关事项

  1. 通过基于网络的随机化系统将大鼠随机分配至线圈或支架治疗组（图2）。随后，在安静、无菌的手术室旁对计划接受手术的所有动物进行术前临床检查，手术室温度维持在23 ± 3 °C。作为术前临床检查的一部分，分析动物的行为，并检查其黏膜和皮肤弹性。
  2. 记录每只动物的体重。
  3. 手术前，将供体大鼠的动脉囊袋置于0.1%十二烷基硫酸钠中，在37 °C条件下孵育10小时，以获得去细胞化动脉瘤8。在手术前几天从供体动物中采集这些囊袋。
    1. 使用显微剪刀和镊子准备腹主动脉的全长，并以3-4 mm的间隔施加6-0不可吸收结扎线。
    2. 通过供体动物胸段先前结扎的动脉囊袋，在术中直接生成活体动脉瘤9。在指定的随访时间点使用剪刀和手术镊进行开胸，并按所需长度结扎血管囊袋。
  4. 将囊袋直接植入受体动物，并从供体动物中取出动脉瘤，用于进一步的大体分析和组织学处理。
  5. 麻醉诱导时，将所有大鼠置于一个清洁的箱体内，通入氧气（O2），持续5-10分钟后直至意识丧失。通过皮下（SC）注射给予芬太尼0.005 mg/kg、美托咪啶0.15 mg/kg和咪达唑仑2 mg/kg的混合物进行麻醉。
    注：此方案可确保至少45分钟的手术麻醉深度。
  6. 通过检查足底回缩反射是否消失来评估麻醉深度。
  7. 将大鼠仰卧位固定，并使用电动剃毛器剃除胸腹部毛发。
  8. 用胶带将大鼠的四只脚固定在板上，板上覆盖连接自动调节直肠探头的加热垫。将直肠探头插入大鼠肛门，借助加热垫维持目标体温37 °C。
  9. 现在，在大鼠右后肢安装一个连接至计算机系统的传感器，用于术中监测生命体征。
  10. 用面罩覆盖大鼠的鼻部和口部。如需延长麻醉时间，开始使用异氟烷（1.0-2.0%，根据效应滴定，以100% O2为载体）。
  11. 使用聚维酮碘或交替使用的消毒剂对手术区域进行消毒，并以无菌方式铺巾。
  12. 围麻醉期护理中，向眼睛涂抹无菌眼用润滑剂，并用不透明的箔片罩覆盖，以防止手术灯导致的眼部干燥和损伤。
  13. 整个手术过程中，通过面罩持续供氧，监测体温，并使用加热垫提供热量，维持正常体温。
  14. 持续监测其他生命体征（脉搏和呼吸扩张、心率和呼吸频率以及血氧饱和度）。

2. 手术阶段——细胞示踪剂注射

注意：赫尔辛基大鼠显微外科侧壁动脉瘤模型的详细手术方法9，以及弹簧圈和支架植入技术，在其他文献中已有描述8,10,11。

  1. 荧光脂溶性细胞示踪剂应始终在 ≤ -20 °C 条件下避光保存。
  2. 通过准备大鼠腹主动脉和下腔静脉并将其分离，随后对主动脉近端和远端进行临时夹闭，完成手术操作。
    注意：该技术此前已有描述9。
    1. 使用两个临时钛夹分别夹闭主动脉的近端和远端。
  3. 在主动脉近端和远端下方各放置一个紫色垫片的微型棉签，以更好地暴露动脉。
  4. 现在用湿纱布覆盖腹部以作保护。
  5. 手术当天，用移液器将 2 µL 细胞示踪剂溶解于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
  6. 将混合液转移至配有 27-1/2 G（0.4 × 13 mm）无菌套管的 1 mL 注射器中。
    注意：执行步骤 2.5 和 2.6 时需注意避免光照。
  7. 关闭手术室灯光。在显微镜下，使用显微镊子夹住主动脉腹侧中段进行单点注射，并小心注入 1 mL 肝素化 0.9% 生理盐水溶液。
  8. 小心注射细胞示踪剂 （视频 1），随后立即关闭手术显微镜。再次用湿纱布覆盖腹部。
  9. 让染料孵育至少 15 分钟。孵育结束后，打开显微镜和手术室的灯光。
  10. 按照其他文献所述方法进行动脉纵切及动脉瘤缝合11。
    1. 使用显微镊和显微剪进行动脉切开，使其长度与所取动脉瘤的直径相当（步骤 1.3）。为确保切口长度准确，可在切开前将动脉瘤置于主动脉旁进行比对。使用不可吸收的 10-0 缝线以 8–10 个单缝合针缝合动脉瘤，并在持续肝素化生理盐水灌注下，从远端开始小心移除临时夹闭夹。逐层关闭切口。注意，弹簧圈填塞密度应为 1 cm。
      注意：弹簧圈或支架植入技术在其他文献中已有描述8,10。

3. 术后阶段监测与镇痛护理

  1. 手术结束时，皮下注射混合液以逆转麻醉作用，混合液成分为：每千克体重0.05 mg的布托啡诺（buprenorphine）、0.75 mg的阿替美唑（atipamezol）和0.2 mg的氟马西尼（flumazenil）。将每只手术动物置于清洁笼具中恢复，直至完全清醒且体温恢复正常，必要时使用加热灯辅助保温。
  2. 术后连续3天给予美洛昔康（meloxicam）1 mg/kg（每日一次注射或口服）和布托啡诺（buprenorphine）0.05 mg/kg（每日皮下注射四次）。夜间通过饮水持续给予布托啡诺，剂量相同：6 mL 浓度为0.3 mg/mL的布托啡诺溶液，溶于360 mL 饮用水中，并加入10 mL 5%葡萄糖溶液。
  3. 术后即刻阶段，为保护动物，应将每只动物单独饲养于独立笼具中。24小时后可重新分组饲养。
  4. 若任何大鼠在皮下注射后出现痛苦或攻击性行为，可在当日饮水中添加布托啡诺进行给药。
  5. 术后将软质饲料放置于笼底，以促进动物进食并支持其恢复。
  6. 根据动物福利与疼痛评分表对所有动物进行观察和护理。
  7. 必要时给予急救镇痛治疗，皮下注射美洛昔康1 mg/kg和布托啡诺0.05 mg/kg。

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结果

共纳入31只动物进行实验室研究：其中27只大鼠纳入最终统计分析；4只大鼠过早死亡（死亡率为12.9%）。术中发现，支架治疗组大鼠的呼吸扩张显著低于弹簧圈治疗组（支架组为12.9 μm ± 0.7，弹簧圈组为13.5 μm ± 0.6，p = 0.03）。在最后一次随访结束时，对每只大鼠均进行了荧光血管造影。所有6只弹簧圈治疗的大鼠均显示再灌注，而在8只支架治疗的大鼠中，仅25%（即12.5%）观察到再灌注现象。

第7天和第21天的基线动脉瘤体积汇总数据在弹簧圈组与支架组之间均无显著差异（去细胞化动脉瘤（p = 0.9）和活性动脉瘤（p = 0.1）均如此）（图3）。随访期间，去细胞化动脉瘤的汇总体积显示，弹簧圈组相较于支架组的动脉瘤增长无统计学意义（p = 0.28）；而在活性动脉瘤中，弹簧圈组的体积增长显著大于支架组（60.1 mm3 ± 31.1 mm3 vs. 20.5 mm3 ±...

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讨论

本研究表明，新生内膜的形成是通过起源于动脉瘤复合体主干动脉的内皮细胞介导的，但在存活动脉瘤中，也依赖于来自动脉瘤壁细胞的募集作用。然而，循环祖细胞在动脉瘤愈合过程中的作用仍存在争议12,13。本研究共纳入31只雄性Lewis大鼠，其中仅有4只过早死亡（死亡率为12.9%）。

与促进内皮-内皮接触的外科夹闭术不同，血管内治疗的成功依赖于延迟的生物学反应。近年来新开发的技术，如血流导向装置、生物活性血管内器械或管腔内细胞治疗，在血管内治疗器械方面具有重要意义14,15。在此背景下，有证据表明，成功消除动脉瘤的治疗效果与动脉瘤壁自身产生的生物学反应呈相加性关联5,16,17

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披露

作者全权负责本研究的设计与实施，并声明不存在任何利益冲突。

致谢

作者感谢兽医学博士 Alessandra Bergadano 对动物长期健康的悉心监管。本研究由瑞士阿劳州立医院阿劳分院研究委员会的科研基金以及瑞士国家科学基金会 SNF（项目编号：310030_182450）提供资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-0 可吸收缝线Ethicon Inc., USAVCP428G
4-0 不可吸收缝线B. Braun, GermanyG0762563
6-0 不可吸收缝线B. Braun, GermanyC0766070
9-0 不可吸收缝线B. Braun, GermanyG1111140
阿替美唑（Atipamezol）Arovet AG, 瑞士
蓝色带通滤光片ThorlabsFD1B其他任意型号
绿色带通滤光片ThorlabsFGV9其他任意型号
双极电凝镊其他任意型号
自行车前灯其他任意型号
板（20 × 10 cm）其他任意型号
丁丙诺啡（Buprenorphine）Indivior, 瑞士1014197
相机Sony NEX-5R, Sony, 东京, 日本
套管（27-1/2 G）其他任意型号
细胞计数软件Image-J 版本 1.52n, 美国国立卫生研究院, 贝塞斯达, 马里兰州, 美国, https://imagej.nih.gov/ij/
CellTracker CM-Dil 染料ThermoFisher SCIENTIFIC, 美国C7000
弹簧圈装置Styker, Kalamazoo, MI, 美国2 cm 长 Target 360 TM Ultra, 直径 2 mm
消毒剂其他任意型号
眼用润滑剂其他任意型号
芬太尼（Fentanyl）Sintetica, S.A., 瑞士98683任意通用型号
氟马西尼（Flumazenil）Labatec-Pharma, 瑞士
荧光素（Fluoresceine）Curatis AG5030376任意通用型号
荧光显微镜Olympus BX51, 汉堡, 德国; Cell Sens Dimension 成像软件 v1.8
箔制面罩其他任意型号
葡萄糖（5%）其他任意型号
加热垫Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, 英格兰其他任意型号
等渗氯化钠溶液（0.9%）Fresenius KABI336769任意通用型号
异氟烷（Isoflurane）任意通用型号
长镊子其他任意型号
美洛昔康（Meloxicam）Boehringer IngelheimP7626406任意通用型号
美托咪啶（Medetomidine）Virbac, 瑞士QN05CM91
微型持针器其他任意型号
咪达唑仑（Midazolam）Roche, 瑞士
监测系统Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, 美国
持针器其他任意型号
氧气面罩其他任意型号
手术显微镜OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, 德国其他任意型号
氧气其他任意型号
直肠温度探头其他任意型号
手术刀Swann-Morton210其他任意型号
小型动物剃毛器其他任意型号
智能手机其他任意型号
十二烷基硫酸钠（0.1%）Sigma-Aldrich11667289001
软质饲料Emeraid Omnivore任意通用型号
软组织镊其他任意型号
软组织牵开器其他任意型号
不锈钢海绵碗其他任意型号
支架装置Biotroni, Bülach, 瑞士改良 magmaris 装置, AMS 带聚合物涂层, 长度 6 mm, 直径 2 mm
无菌微型棉签其他任意型号
直形和弯形微型镊其他任意型号
直形和弯形微型剪刀其他任意型号
直形和弯形镊子其他任意型号
手术单其他任意型号
手术剪刀其他任意型号
1 mL、2 mL 和 5 mL 注射器其他任意型号
胶带其他任意型号
血管夹施加器B. Braun, 德国FT495T
Yasargil 钛标准夹（2个）B. Braun Medical AG, Aesculap, 瑞士FT242T临时使用

参考文献

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