使用细胞示踪剂注射研究大鼠囊侧壁模型中新内膜形成细胞的起源

摘要

我们进行了一点亲脂性细胞示踪剂注射以追踪内皮细胞，然后进行动脉切开术和缝合腹大鼠主动脉上的侧壁动脉瘤。在去细胞化动脉瘤中，新intima的形成似乎依赖于母动脉，并且通过从富含细胞的重要壁的动脉瘤壁细胞中募集来促进。

摘要

显微外科夹闭术形成随后的血流屏障进入颅内动脉瘤，而血管内治疗则依赖于新脑和血栓形成。覆盖新内腔层的内皮细胞的来源尚不清楚。因此，本研究的目的是在已经完善的赫尔辛基大鼠显微外科侧壁动脉瘤模型中研究细胞示踪剂注射后新intima形成细胞的起源。

侧壁动脉瘤是通过在雄性Lewis大鼠中将脱细胞化或重要动脉袋首尾并侧缝合到主动脉而形成的。在用动脉瘤缝合线进行动脉切开术之前，在夹紧的主动脉中进行含有CM-Dil染料的细胞示踪剂注射，以标记相邻血管中的内皮细胞并在随访期间跟踪其增殖（FU）。治疗后进行盘绕（n = 16）或支架置入术（n = 15）。在FU（7天或21天）时，所有大鼠都接受荧光血管造影，然后进行动脉瘤收获以及具有特定感兴趣区域的免疫组学细胞计数的宏观和组织学评估。

31例动脉瘤均未在随访时破裂。四只动物过早死亡。在75.0%盘绕大鼠和7.0%支架大鼠中观察到宏观残余灌注。与盘绕动脉瘤相比，第7天（p = 0.01）和第21天新intima（p = 0.04）的盘绕动脉瘤相比，去细胞化支架的细胞示踪阳性细胞数量显着升高。在血栓或新生血管中未发现显著差异。

这些发现证实，与支架置入式动脉瘤相比，盘绕动脉瘤的愈合模式更差。在去细胞化动脉瘤中，新内膜的形成似乎特别依赖于母动脉，而它是由重要细胞丰富的壁中的动脉瘤壁细胞募集支持的。在转化方面，支架治疗可能更适合于高度退化的动脉瘤，而对于血管壁大多健康的动脉瘤，仅进行盘绕可能就足够了。

引言

由颅内动脉瘤 （IA） 破裂引起的蛛网膜下腔出血是一种破坏性的神经外科疾病，与高发病率和死亡率相关^{1，2，3，4}。除了提供内皮与内皮直接接触的显微外科夹闭外，血管内装置在过去几十年中在治疗破裂和偶然发现的IA方面变得越来越重要。血管内治疗的IA的愈合反应主要取决于新脑形成和血栓组织。两者都是协同过程，取决于细胞从相邻血管和动脉瘤壁的迁移。⁵ 迄今为止，血管内处理动脉瘤新脑形成中内皮细胞的起源尚不清楚。文献中关于新intima形成细胞被招募的来源一直存在争议。

通过在大鼠腹主动脉中使用CM-Dil染料的细胞示踪剂注射（见 材料表），我们旨在分析起源于母动脉的内皮细胞在两个不同的FU时间点（第7天和第21天）的新intima形成中的作用（图1）。该模型的一个优点是在动脉瘤缝合之前在亲体动脉 中 直接在体内孵育局部细胞示踪剂，从而在以后的时间点允许FU。 体内 注射技术，如细胞示踪剂孵育，尚未在文献中描述。该技术的一个优点是直接，单点，术 中，体内 注射，这使得模型坚固耐用且可重复。

方案

兽医支持是根据机构指南进行的。实验由瑞士地方伦理委员会批准（BE 60/19）。^6，7严格遵守了ARRIAGE指南和3R原则。包括31只雄性刘易斯大鼠，12周大，体重492±8克。将所有大鼠在23°C的室温和12小时的光/暗循环下。提供免费水和颗粒。统计分析是使用非参数Wilcoxon-Mann-Whitney U 检验进行的。≤0.05和/或≤0.01的概率值（p）被认为是显著的。

1. 术前阶段-一般准备和麻醉方面

1. 通过基于网络的随机化系统将大鼠随机化到线圈或支架治疗组中（图2）。现在，在一个安静的无菌手术室旁边对所有计划进行手术的动物进行术前临床检查，保持室温为23±3°C。 分析动物的行为并检查粘膜和弹性，作为术前临床检查的一部分。
2. 记录每只动物的体重。
3. 手术前，将供体大鼠的动脉袋在37°C下在0.1%十二烷基硫酸钠中孵育10小时，以获得脱细胞化动脉瘤⁸。在手术前几天从捐赠动物那里收集这些袋子。
   1. 用显微剪刀和镊子准备腹主动脉的整个长度，并以3-4mm的间隔应用6-0个不可吸收的结扎。
   2. 术中通过先前结扎的动脉血管袋从供体动物的胸部部分直接产生生命动脉瘤⁹。在指定的FU时间点用剪刀和手术钳进行开胸术，并以所需的长度连接血管袋。
4. 直接将袋子植入受体并从供体动物处收获动脉瘤，以进行进一步的宏观分析和组织学处理。
5. 对于麻醉诱导，将所有大鼠置于提供氧气（O₂）的干净盒子中，直到5-10分钟后失去意识。用皮下注射（SC）芬太尼0.005mg / kg，美托咪定0.15mg / kg和咪达唑仑2mg / kg的混合物麻醉大鼠。
   注意:这确保了手术平面至少45分钟。
6. 通过没有踏板退出反射来检查麻醉深度。
7. 将大鼠置于仰卧位，并用电动剃须刀剃除胸腹部。
8. 用胶带将大鼠的4只爪子固定在板上，由连接到自动调节直肠探针的加热垫覆盖。将直肠探针插入大鼠的肛门，在加热垫的帮助下保持37°C的所需温度。
9. 现在，在连接到计算机系统的右后腿上安装一个传感器，用于检查术中的生命体征。
10. 用口罩遮住老鼠的鼻子和嘴巴。如果需要长时间麻醉，开始异氟醚（1.0-2.0%滴定，在100%O₂中起作用）。
11. 用聚维酮 - 碘或交替消毒剂对手术区域进行消毒，并以无菌方式覆盖手术区域。
12. 对于肛周护理，将无菌眼科润滑剂涂抹在眼睛上，并用不透明的铝箔面罩覆盖它们，以防止手术灯干燥和损坏。
13. 在整个手术过程中，通过面罩连续供氧，监测体温，并使用加热垫提供热量，以保持正常体温。
14. 持续监测其他生命体征（脉搏和呼吸膨胀、心脏和呼吸频率以及血氧饱和度）。

2. 手术阶段 - 细胞示踪剂注射

注:赫尔辛基大鼠显微外科侧壁动脉瘤模型⁹ 中的详细手术方法以及线圈和支架植入技术在别处进行了描述^8，10，11。

1. 将荧光亲脂性细胞示踪剂始终储存在≤-20°C，避光。
2. 通过准备大鼠主动脉和腔静脉进行手术，然后分离两者，以及主动脉的近端和远端临时钳夹。
   注意:此技术在前面已在^{9 中}进行了描述。
   1. 用两个临时的泰坦夹钳夹住主动脉的近端和远端部分。
3. 在主动脉的近端和远端部分下放置一个带有紫色衬垫的微拭子，以便更好地可视化动脉。
4. 现在，用湿纱布保护腹部。
5. 在手术当天，通过移液于1mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）来溶解2μL细胞示踪剂。
6. 将混合物转移到装有27-1 / 2 G（0.4 x 13 mm）无菌套管的1mL注射器中。
   注:在执行步骤 2.5 和 2.6 时，请注意避免光线照射。
7. 关闭手术室的灯。在显微镜下观察时，使用微镊子在主动脉的中腹侧部分进行单点注射，并小心地注射1mL肝素化的0.9%盐水溶液。
8. 小心地注射细胞示踪剂 （视频1 ），并立即关闭手术显微镜。再次，用湿纱布保护腹部。
9. 让染料孵育至少15分钟。潜伏期过后，打开显微镜和手术室的灯。
10. 进行动脉瘤的纵向动脉切开术和缝合，如别处¹¹所述。
    1. 使用微镊子和微剪刀进行动脉切开术，使其长度平均采集的动脉瘤的直径（步骤1.3）。为确保长度正确，在进行动脉切开术之前，将动脉瘤放在主动脉旁边。使用不可吸收的10-0缝线用8-10针单缝缝合动脉瘤，并小心地取下临时钳子 - 从远端开始 - 用肝素盐水连续冲洗。以分层方式闭合伤口。请注意，使用1厘米的线圈包装密度。
       注:线圈或支架植入技术已在别处进行了描述^8，10.

3. 术后阶段监测和镇痛护理

1. 在手术结束时，用丁丙诺啡0.05mg / kg，阿替哌唑0.75mg / kg和氟马西尼0.2mg / kg的SC注射混合物逆转麻醉。让每只操作的动物在干净的笼子里恢复，直到完全清醒，并根据需要用加热灯加热。
2. 3天，给予1mg / kg美洛昔康（每天一次注射或口服）和丁丙诺啡（0.05mg / kg，每天四次）SC.过夜，在饮用水中连续提供丁丙诺啡，剂量相同:6mL丁丙诺啡0.3mg / mL，360mL饮用水，10mL 5%葡萄糖。
3. 在术后立即阶段，将每只动物安置在一个笼子里进行保护。24小时后重新组合动物。
4. 如果任何大鼠在SC注射后表现出痛苦或攻击性行为，请在白天在饮用水中施用丁丙诺啡。
5. 在笼子地板上提供软饲料，以支持术后喂养和恢复。
6. 根据健康和疼痛评分表观察并照顾所有动物。
7. 需要时给予急救镇痛SC（美洛昔康1mg / kg和0.05mg / kg丁丙诺啡）。

结果

实验室环境共纳入31只动物:最终统计分析中包括27只大鼠;4只大鼠过早死亡（死亡率为12.9%）。术中，与线圈处理（13.5μm±0.6）大鼠相比，支架（12.9μm±0.7）的呼吸膨胀显着减少（p = 0.03）。在最后的FU结束时对每只大鼠进行荧光血管造影。在所有6种线圈处理的动物中均有再灌注，而在8种支架处理的动物中仅观察到12.5%的再灌注。

盘管或支架治疗组之间第7天和第21天的合并基线动脉瘤体积没有显着差异（无论是去细胞化（p = 0.9）也不是重要的动脉瘤（p = 0.1）动脉瘤）（图3）。与支架置入式动脉瘤相比，去细胞化动脉瘤的合并FU体积显示盘绕的动脉瘤生长不显着（p = 0.28），在重要的盘绕组中显着大于支架组（60.1 mm^3±31.1 mm³ vs. 20.5 mm³ ±20.6 mm³; p = 0.002）。

...

讨论

这项研究表明，新血管的形成是通过起源于动脉瘤复合体母动脉的内皮细胞介导的，但由重要动脉瘤中来自动脉瘤壁的细胞的募集来支持。然而，循环祖细胞在动脉瘤愈合中的作用仍然存在争议^12，13。总体而言，31只雄性刘易斯大鼠被纳入这项调查;只有4人过早死亡（死亡率为12.9%）。

与促进随后内皮至内皮接触的手术夹闭相比，血管内治疗的成功依赖于延迟的生物反应。新开发的技术，例如流量转移，生物活性血管内装置或基于腔内细胞的疗法，相对于血管内治疗装置^14，15是值得注意的。在这种情况下，有证据表明，成功根除动脉瘤的治疗成功与动脉瘤壁本身的生物反应相加相关^5，16，17。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-0 可吸收缝合线	Ethicon Inc.，美国	VCP428G
4-0 不可吸收缝合线	B. Braun，德国	G0762563
6-0 不可吸收缝合	B. Braun，德国	C0766070
9-0 不可吸收缝线	B. Braun，德国	G1111140
Atipamezol	Arovet AG，瑞士
带通滤光片 蓝色	Thorlabs	FD1B	任何其他
带通滤光片 绿色	Thorlabs	FGV9	任何其他
双极镊子			任何其他
自行车射灯			任何其他
（20 x 10 厘米）			任何其他
丁丙诺啡	Indivior， 瑞士	1014197
相机	Sony NEX-5R，Sony，Tokyo，Japan
套管 （27-1/2 G）			任何其他
细胞计数软件	Image-J 版本 1.52n，美国国立卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达，https://imagej.nih.gov/ij/
CellTracker CM-Dil 染料	ThermoFisher SCIENTIFIC，美国	C7000
线圈装置	Styker，美国密歇根州卡拉马祖	2 厘米的 Target 360 TM Ultra，直径 2 毫米
			通用
荧光显微镜	奥林巴斯 BX51，德国汉堡;Cell Sens Dimension 成像软件 v1.8
箔 掩盖			任何其他
葡萄糖 （5%）
加热垫	恒温控制单元， Harvard， Edenbridge， England		任何其他
等渗氯化钠溶液 （0.9%）	Fresenius KABI	336769	任何通用
异氟醚			任何仿制药
Longuettes			任何其他
洛昔康	勃林格殷格翰	P7626406	任何仿制药
美托咪定	瑞士维巴克	QN05CM91
微型针架			任何其他
咪达唑仑	瑞士罗氏
监测系统	Starr Life Sciences Corp.， 333 Allegheny Ave， Oakmont， PA 15139， 美国
持针器			任何其他
O2 面罩
手术显微镜	OPMI， Carl Zeiss AG， Oberkochen， Germany		任何其他
氧气			任何其他
直肠温度探头			其他
Scalpell	Swann-Morton	210	任何其他
小动物剃须刀			任何其他
智能手机			十二
烷基硫酸钠 （0.1%）	Sigma-Aldrich	11667289001
软饲料	Emeraid Omnivore		任何通用
软组织镊子			任何其他
软组织扩张器			任何其他
不锈钢海绵碗			任何其他
支架装置	Biotroni， Bülach，瑞士		改良的 magmaris 装置，带聚合物涂层的 AMS，长度 6 毫米，直径 2 毫米
无菌微拭子			任何其他
直和弯曲的微镊子			任何其他
直的和弯曲的微
			任何其他
手术单			任何其他
手术剪刀			任何其他
注射器 1 mL、2 mL 和 5 mL
任何其他胶带			任何其他
血管夹涂抹器	B. Braun，德国	FT495T
Yasargil titan 标准夹 （2x）	B. Braun Medical AG，瑞士 Aesculap	FT242T	临时